基于“骨肉不相親”理論探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的代謝組學(xué)研究

孫娜，劉瑤，徐琬梨?，劉國巖

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省中醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種與女性生理周期相關(guān)的由雌激素戒斷引起的系統(tǒng)性骨骼疾?。?-2］，主要特征為骨量減少及骨的力學(xué)結(jié)構(gòu)改變，后期易致畸、致殘，嚴(yán)重影響患病人群的生活質(zhì)量，已成為全球性公共衛(wèi)生問題之一。因此，探明PMOP的分子機(jī)制成為亟待解決的問題。近年來，越來越多的研究表明，PMOP的發(fā)生與相關(guān)基因、蛋白質(zhì)等生物大分子的表達(dá)水平異常密切相關(guān)［3-8］。中醫(yī)學(xué)中雖無骨質(zhì)疏松癥之名，但類似癥狀古籍多有記載，該病屬“骨痿”范疇，其中“骨肉不相親則肉軟卻……發(fā)無澤者骨先死”及“骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”等表明骨痿病機(jī)與“骨肉不相親”密切相關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)家在此基礎(chǔ)上結(jié)合“腎主骨”“脾主肉”理論對(duì)PMOP進(jìn)行臨床研究，治療方向由腎論治轉(zhuǎn)向脾腎論治，治療效果較為顯著［9］，但“骨肉不相親”致PMOP的系統(tǒng)病理機(jī)制尚不明確。為了探明該病理機(jī)制，本研究擬通過檢測(cè)PMOP脾腎虧虛證患者、PMOP腎虛證患者及正常對(duì)照人群的血清差異代謝物，尋找PMOP脾腎虧虛證患者體內(nèi)發(fā)生獨(dú)特改變的代謝通路及網(wǎng)絡(luò)，以期從代謝組學(xué)角度揭示該病病理機(jī)制的同時(shí)，為該病靶向治療提供數(shù)據(jù)支持［10-11］。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

結(jié)合證候辨證素量表，選取山東省中醫(yī)院骨科收治住院且經(jīng)測(cè)定骨密度后確診的30例PMOP脾腎虧虛證患者（脾腎虧虛組）和30例PMOP腎虛證患者（腎虛組），以及18例健康人（正常組）作為研究對(duì)象。本研究共收集78例受試者的血清資料，參與本研究的人群均被明確告知血液用途。年齡、絕經(jīng)年齡、身高、體質(zhì)量、BMI方面的基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組基線資料比較（±s）

表1 各組基線資料比較（±s）

組別脾腎虧虛組腎虛組正常組例數(shù)30 30 18年齡（歲）55.22±3.56 54.83±2.98 53.65±3.87絕經(jīng)年齡（歲）51.20±1.66 50.73±1.32 50.87±2.01身高（cm）154.56±4.26 153.36±3.68 154.97±3.94體質(zhì)量（kg）47.45±2.30 45.79±1.96 45.92±2.60 BMI（kg/m2）19.45±2.63 20.31±3.12 19.93±3.01

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南》［12］，以脆性骨折程度或DXA 骨骼密度測(cè)量結(jié)果為準(zhǔn)，若該值≤-2.5則可確診。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照2011 版《中醫(yī)診斷學(xué)》［13］、2013 版《絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥》［14］及《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(shí)（2020）》［15］，共同制定本研究的中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)。腎虛證：主癥為腰膝酸軟，失眠健忘；次癥為頭暈耳鳴，耳聾，發(fā)脫齒搖，性欲減退，尿有余瀝，尿失禁，尺脈沉遲，舌淡苔白，面色晦暗等。脾腎虧虛證：主癥為腰膝酸軟，倦怠乏力；次癥為四肢怠惰，大便溏薄，納呆食少，脘腹脹滿，面色?白，懈惰嗜睡，注意力不集中，苔白，脈沉細(xì)等。主癥滿足1～2 項(xiàng)，次癥滿足2～3 項(xiàng)即可確診。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；②均絕經(jīng)1年以上；③臨床資料相對(duì)完整；④自愿參與本研究；⑤中醫(yī)證型確診無疑義。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①有各種影響骨代謝疾病的病史；②有血液系統(tǒng)疾病；③有慢性腎功能不全、惡性腫瘤病史；④有長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素使用史及免疫抑制劑治療史。

1.5 血清采樣方法

采集樣本前3 d，囑患者停藥以免藥物對(duì)本研究結(jié)果造成干擾。晨起對(duì)患者進(jìn)行空腹靜脈取血，并于室溫下離心5 min，取上層血清，將其置于-80 ℃的冰箱中，等待檢測(cè)。

1.6 樣本預(yù)處理

室溫條件下解凍各組血清，取樣本200 μL 和400 μL 緩沖液（45 mmol/L NaH2PO4/K2HPO4；0.9%NaCl；pH 值7.4；50%D2O）置于1.5 mL 的離心管中，進(jìn)行充分的混勻斡旋、震蕩。置于4 ℃環(huán)境下離心10 min，分出上層清液550μL，并置于5 mm 核磁管（Wilmad-LabGlass）中等待下一步實(shí)驗(yàn)。

1.7 H-NMR數(shù)據(jù)的采集及處理

核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）實(shí)驗(yàn)中所用的儀器是Varian 600 MHz譜儀，1H共振頻率是599.93 MHz。將核磁共振管放入并進(jìn)行勻場(chǎng)鎖場(chǎng)（鎖場(chǎng)信號(hào)為重水信號(hào)），利用自波回旋法，橫向弛豫加權(quán)實(shí)驗(yàn)中，選用水峰抑制Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，并設(shè)置25 ℃下弛豫延遲時(shí)間為2.0 s，采集時(shí)間是1.5 s，譜寬為12 000.0 Hz，總回波時(shí)長(zhǎng)設(shè)置100 ms，累加64次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用MestReNova（V9.0.1）對(duì)H-NMR采集處理后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行傅里葉變換、基線校正及定標(biāo)處理后，對(duì)其進(jìn)行多元變量模式識(shí)別分析，主要包含主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structuresdiscriminant analysis，OPLS-DA）。對(duì)比OPLS-DA各模型中代謝物的相關(guān)系數(shù)，將每一個(gè)變量的Loading值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差相乘后進(jìn)行數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換，統(tǒng)計(jì)總結(jié)出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的血清差異代謝物。

2 代謝組學(xué)結(jié)果

2.1 代謝譜分析

使用SIMCA 軟件［16］（V14.1，MKS Data Analytics Solutions，Umea，Sweden）將正交變換轉(zhuǎn)換為線性不相關(guān)變量，自動(dòng)建模分析后發(fā)現(xiàn)脾腎虧虛組、腎虛組與正常組間的代謝譜有明顯分離，解釋數(shù)據(jù)變量具備進(jìn)一步研究的意義。見圖1。

2.2 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

采用OPLS-DA 的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理［17］。見圖2。其中脾腎虧虛組、腎虛組樣本與正常組相比數(shù)據(jù)分離較為明顯，表明有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。為了進(jìn)一步驗(yàn)證各兩組模型是否具備可靠性和較高的預(yù)測(cè)率，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行置換檢驗(yàn)，得出結(jié)果R2Y、Q2值接近1。見圖3。各組間數(shù)據(jù)的OPLS-DA 載荷圖見圖4，圖中橫坐標(biāo)意為化學(xué)位移，縱坐標(biāo)表明載荷值。紅色為正相關(guān)，且顏色的深淺程度與相關(guān)系數(shù)成正比；藍(lán)色為負(fù)相關(guān)，顏色的深淺程度隨相關(guān)系數(shù)的增長(zhǎng)而變淺。圖4中各標(biāo)記物質(zhì)在相關(guān)系數(shù)方面已通過臨界值檢驗(yàn)。

2.3 差異代謝物篩選

研究OPLS-DA模型時(shí)，各個(gè)組間排列檢驗(yàn)所示結(jié)果對(duì)應(yīng)不同系數(shù)，分析整理得出具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的所有組間血清差異代謝物明細(xì)。將相關(guān)系數(shù)圖中的所有變量Loading 值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差相乘，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回溯轉(zhuǎn)換，將絕對(duì)值與0.361 比較，得組間存在的差異代謝產(chǎn)物。見表2。

2.4 KEGG通路分析

通過在線網(wǎng)站Metascape（https：//metascape.org）對(duì)表1中的差異代謝物進(jìn)行KEGG 通路分析，得出相關(guān)通路及通路中包含化合物［18］。見表3。

表3 富集通路注釋信息表

2.5 差異代謝物的代謝通路分析

將表2中的差異代謝物導(dǎo)入在線代謝網(wǎng)站MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行測(cè)算，得出代謝物相關(guān)通路，將其中影響因子＞0.05的重要通路納入分析。結(jié)果：Valine，leucine and isoleucine biosynthesis為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成代謝；Valine，leucine andisoleucine degradation 為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解代謝；Aminoacyl-tRNA biosynthesis為氨基酞-tRNA合成代謝；Glycolysis or Gluconeogenesis為糖酵解/糖異生；Glycerophospholipidmetabolism 為甘油磷酸代謝；Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 為乙醛和二梭酸代謝；Methane metabolism 為甲烷代謝；Pyruvate metabolism 為丙酮酸代謝；Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 為乙醛和二羧酸代謝；Glycerophospholipid metabolism為甘油磷酸代謝；Glycolysis or Gluconeogenesis為糖酵解/糖異生；Pentose phosphate pathway為戊糖磷酸途徑；Galactose metabolism 為半乳糖代謝；Starch and sucrose metabolism 為淀粉和蔗糖代謝；Citrate cycle（TCA cycle）為檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。見圖5。

表2 脾腎虧虛組、腎虛組與正常組間的差異代謝物

3 討論

“骨肉不相親”理論相關(guān)記載最早見于《靈樞·經(jīng)脈》，如“骨不濡則肉不能著也，骨肉不相親則肉軟卻”，《靈樞·癲狂》及《素問·生氣通天論》中亦有相關(guān)表述，如“骨正筋柔，氣血以流，腠理以密，如是則骨氣以精”，高度概括了骨與肉之間的內(nèi)在平衡關(guān)系，是中醫(yī)學(xué)對(duì)肌骨協(xié)同病變病理機(jī)制的系統(tǒng)性總結(jié)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明骨與肌肉共同起源于軸旁中胚層，在解剖位置中相互依存，且各自作為內(nèi)分泌器官，通過分泌激動(dòng)因子、骨因子及代謝產(chǎn)物等共同參與包括PMOP 在內(nèi)的增齡性肌骨疾病病理過程［19-21］，這與中醫(yī)學(xué)骨肉關(guān)系及骨肉協(xié)同致病理論具有一致性。除此之外，通過骨應(yīng)力生物力學(xué)機(jī)制探查骨、肌肉與PMOP 之間的聯(lián)系也取得了一定成果，如骨細(xì)胞感受應(yīng)力刺激信號(hào)后可產(chǎn)生骨鈣素等因子調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)平衡及骨骼肌強(qiáng)度［22］，據(jù)此認(rèn)為適宜強(qiáng)度的應(yīng)力刺激有利于改善PMOP 等增齡性肌骨疾病的癥狀。相關(guān)研究表明，骨功能下降時(shí)，肌肉的力量及功能亦得不到很好的發(fā)揮，影響機(jī)體的平衡能力及穩(wěn)定性，進(jìn)一步證明骨、肌肉功能異?？梢詫?dǎo)致PMOP的發(fā)生［23］。

《類經(jīng)》中“脾主肌肉故脾絕則肉先死，腎主骨故腎絕則骨先死”及“治痿獨(dú)取陽明”將“骨肉不相親”理論從肌骨關(guān)系深化到脾腎生克制化。腎為先天之本，主骨生髓，女子絕經(jīng)后天癸消失，腎精虧損嚴(yán)重，“尺濡則骨肉不相親”表明腎精虧虛易發(fā)為骨痿。此時(shí)，先天之精不能對(duì)后天之精產(chǎn)生足夠的滋養(yǎng)作用，后天之精的化生之源脾胃發(fā)生虧虛，后天之精充養(yǎng)先天之精的功能不足以發(fā)揮，久之脾腎皆虛，促進(jìn)“骨痿”的產(chǎn)生?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，運(yùn)用補(bǔ)腎健脾法治療骨質(zhì)疏松癥取得了一定進(jìn)展，如用補(bǔ)中益氣丸聯(lián)合補(bǔ)中益氣湯可以提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的雌激素水平及調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)等，與中醫(yī)脾腎皆虛致骨痿理論有一致性［24-26］，但脾腎虧虛致骨痿的系統(tǒng)病理機(jī)制目前仍不明確，需進(jìn)一步研究探索。

現(xiàn)代研究中，通過代謝組學(xué)方法探討脾腎虧虛型PMOP的有效治療方式取得了一定進(jìn)展［27］，本研究在此基礎(chǔ)上，擬通過探查脾腎虧虛型PMOP患者血清中的特異代謝產(chǎn)物及其影響的代謝通路，為闡明脾腎虧虛致PMOP 的系統(tǒng)病理機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。本研究采取代謝組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)PMOP腎虛組患者血清中差異代謝物包括乙醇胺、甲酸、異丁酸、異亮氨酸、丙二酸鹽、亮氨酸、低密度脂蛋白、丙二酸鹽、α-葡萄糖及β-葡萄糖；發(fā)生改變的通路主要包括蛋白質(zhì)消化和吸收，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，碳代謝，氨酰tRNA 生物合成，2-氧代羰基酸代謝，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，礦物吸收，癌癥中心碳代謝以及糖酵解/糖異生。對(duì)比腎虛組數(shù)據(jù)，認(rèn)為PMOP 脾腎虧虛組特有的血清差異物為甘油和丙酮酸，發(fā)生改變通路包括戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、乙醛酸和二羧酸代謝、戊糖磷酸途徑、丙酮酸代謝及半乳糖代謝。

糖酵解第一階段過程中，半乳糖代謝產(chǎn)生的D-葡萄糖在已糖激酶、葡萄糖激酶的作用下，分子結(jié)構(gòu)中的碳?xì)滏I斷裂釋放能量，生成的磷酸果糖參與戊糖磷酸途徑；第二階段過程中D-葡萄糖在破骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白環(huán)附近丙酮酸激酶等一系列酶的催化下最終轉(zhuǎn)化為丙酮酸，經(jīng)歷丙酮酸代謝、輔酶A合成等調(diào)控骨降解能量途徑［28］，這可能是脾腎虧虛組患者血清差異物丙酮酸影響PMOP 發(fā)生的體內(nèi)途徑。甘油酯代謝途徑的初始化合物3-磷酸甘油酸既可以來自糖酵解過程，也可以源于甘油，而半乳糖代謝中D-半乳糖可以在α-半乳糖苷酶的催化下生成甘油。甘油參與脂質(zhì)代謝并產(chǎn)生重要能量物質(zhì)-脂肪酸、甘氨酸和膽固醇，血液中游離脂肪酸含量增加時(shí)可以影響過氧化物酶體增殖激活受體（peroxisome proliferation activates the receptor，PPAR）的表達(dá)［29］。該受體中的PPARα和PPARδ對(duì)破骨細(xì)胞的生成和骨吸收具有抑制作用，而PPARγ 有利于加速破骨細(xì)胞的生成進(jìn)程，PPARα、PPARδ和PPARγ共同參與三羧酸循環(huán)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，加速骨質(zhì)流失，發(fā)為PMOP［30-35］，這可能是脾腎虧虛組患者血清差異物甘油影響PMOP 發(fā)生的體內(nèi)機(jī)制。本研究中PMOP 脾腎虧虛組患者血清內(nèi)的甘油含量增加，表示與甘油相關(guān)的脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，相關(guān)研究也支持這一結(jié)論［34］。

作為與衰老明確相關(guān)的代謝途徑［36］，丙酮酸代謝中丙酮酸可以在甲酸-C-乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下生成甲酸參與乙醛酸和二羧酸代謝途徑，也可以經(jīng)由丙酮酸脫氫酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶催化后生成2-氧戊二酸鹽繼而轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A參與三羧酸循環(huán)。三羧酸循環(huán)途徑作為體內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成的重要來源之一，對(duì)調(diào)控機(jī)體的能量代謝平衡具有重要意義，與能量代謝密切相關(guān)，由此可見PMOP脾腎虧虛組患者丙酮酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝途徑改變，意味著能量代謝異常。PMOP本質(zhì)為骨吸收大于骨生成，而骨吸收活性增強(qiáng)過程中需要消耗大量的ATP，結(jié)合研究過程中與能量代謝相關(guān)的戊糖磷酸途徑產(chǎn)生異常，認(rèn)為PMOP 脾腎虧虛組患者在破骨細(xì)胞能量代謝方面存在異常。有研究認(rèn)為破骨細(xì)胞的骨吸收強(qiáng)烈依賴于能量消耗，亦一定程度上支持本結(jié)論［23］。

戊糖磷酸途徑中，葡萄糖可在葡萄糖酸內(nèi)酯酶、葡萄糖酸脫水酶的作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，經(jīng)甘油酸酯分解后參與糖酵解過程。戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化過程中，半乳糖醛酸酯在D-半乳糖醛酸還原酶等一系列還原酶的催化作用下生成甘油，參與脂質(zhì)代謝。乙醛酸和二羧酸鹽代謝過程中產(chǎn)生的丙酮酸參與甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝途徑時(shí)，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物羥基丙酮酸在某些條件下可以進(jìn)一步生成ATP［37］及L-谷氨酰胺，其中L-谷氨酰胺消耗時(shí)可抑制破骨細(xì)胞的分化和表達(dá)［23］，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)PMOP 的調(diào)控作用，一定程度上增加本研究結(jié)果的可信度。

基于以上數(shù)據(jù)，本研究認(rèn)為PMOP 是一種以能量代謝、脂質(zhì)代謝紊亂為特征的慢性代謝疾病，相關(guān)研究亦得出相同結(jié)論，一定程度上為本研究增加可信度［38-39］。本研究中的PMOP 脾腎虧虛組中甘油含量及相關(guān)脂質(zhì)代謝途徑異常表明患者出現(xiàn)脂代謝紊亂，結(jié)合“骨肉不相親”理論，中醫(yī)中“肉”的廣義概念不局限指代肌肉，還包括脂肪，故下一步研究將增加脂肪相關(guān)的觀察指標(biāo)，完善“骨肉不相親”理論下的骨肉關(guān)聯(lián)內(nèi)容，以期從分子生物學(xué)方面為探索PMOP 的發(fā)病機(jī)制提供方向，更好地指導(dǎo)臨床。