天麻素調(diào)控SIRT3 改善BV2 細(xì)胞衰老和炎癥的作用

管 桐，高麗莎，隋得志，米 佳，王斌勝,

（1.濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003）

隨著世界人口老齡化，與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的流行已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，給社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，研究大腦和神經(jīng)細(xì)胞的衰老機(jī)制，將有助于制定有效的預(yù)防干預(yù)措施。在衰老的大腦中，衰老的神經(jīng)細(xì)胞也逐漸積累增加，加劇大腦的衰老，而改善腦中神經(jīng)細(xì)胞的衰老則能夠延緩大腦的衰老。在腦老化過程中，衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸積累，大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞占所有膠質(zhì)細(xì)胞的5%～12%，在生理或病理?xiàng)l件下作為常駐的免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道防線，在感染、創(chuàng)傷、炎癥、缺血性疾病以及神經(jīng)退行性疾病中起著關(guān)鍵作用。盡管激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠吞噬細(xì)胞碎片和病原體來調(diào)節(jié)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，并分泌不同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以維持神經(jīng)元的存活，但小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活則會(huì)引起促炎介質(zhì)以及細(xì)胞毒性物質(zhì)如腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor，TNF-）、白細(xì)胞介素-1（interleukin 1IL-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等的過度釋放，加速神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)退行性變。

NAD+依賴性脫乙酰酶蛋白Sirtuin3（silent mating type information regulation 2 homolog 3）屬于Sirtuin 基因家族，主要存在于線粒體中。SIRT3 參與能量代謝、線粒體功能和氧化應(yīng)激以及炎癥的調(diào)節(jié)，能夠?qū)古c衰老相關(guān)的疾病。同時(shí)，SIRT3 已經(jīng)被確定為幾種炎癥相關(guān)疾病中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3 可能是引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵上游啟動(dòng)因子，在炎癥條件下，SIRT3 蛋白表達(dá)下降。在之前的研究中，描述了SIRT3 在神經(jīng)炎癥中的保護(hù)作用，但是很少有實(shí)驗(yàn)來研究SIRT3 對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的作用。在本研究中，使用D-半乳糖誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞在體外建立一個(gè)衰老細(xì)胞模型，試圖探討SIRT3 在衰老的BV2 細(xì)胞中的具體作用。

天麻（）是蘭科植物天麻的塊莖，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，天麻具有平肝息風(fēng)、通絡(luò)止痛的功效，能夠廣泛用于治療頭疼、癲癇、頭暈、神經(jīng)痛以及高血壓等疾病。天麻中有多種有效成分，但天麻素（Gastrodin）是其中最重要的一種天然酚類成分。研究發(fā)現(xiàn)，天麻素具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗衰老的作用，由于天麻素能夠穿越血腦屏障，通過清除活性氧，減少神經(jīng)毒性促炎物質(zhì)和脂質(zhì)過氧化而在不同的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，天麻作為一種藥食同源的中藥材，有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，其明確指出的保健功能主要包括改善睡眠、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，能夠調(diào)節(jié)血壓和血脂等。以天麻為主要原料的保健產(chǎn)品也被廣泛研究和開發(fā)，被CFDA批準(zhǔn)的保健食品達(dá)30 多種。2019 年11 月，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)、國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布對(duì)天麻等9 種中藥按照食藥物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，推進(jìn)了中藥材藥食同源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而目前關(guān)于天麻素對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用尚未有深入研究。由于神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病的重要病理反應(yīng)，而天麻素具有多種藥理學(xué)作用，因此本項(xiàng)研究以D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞建立衰老細(xì)胞模型，探討天麻素對(duì)衰老的BV2 細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用以及可能的機(jī)制，以期為開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病的新藥和保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

天麻素（純度≥98%）（SG8080）、CCK-8 試劑盒（CA1210）、TC 處理細(xì)胞爬片（YA0350）北京索萊寶生物科技有限公司；SIRT3 抑制劑（50 mg）（120241-79-4）MedChemExpress 公司；BV2 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株（CL-0493）、BV2 細(xì)胞專用培養(yǎng)基（CM-0493）武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司；細(xì)胞衰老-半乳糖苷酶（SA--Gal）染色試劑盒（C0602）、活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（S0033S）、小鼠白細(xì)胞介素1（IL-1）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（PI301）、小鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（PI326）、小鼠腫瘤壞死因子-（TNF-）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（PT512）、SIRT3 兔抗蛋白（AF5303）、P16 兔抗蛋白（AF1069）、P21 兔抗蛋白（AF5252）、-actin（AF0003）、Alexa Fluor 555 標(biāo)記驢抗兔IgG（H+L）（A0453）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（A0208）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）、抗熒光淬滅封片劑（P0131）上海碧云天生物科技有效公司。

Multiskan FC 酶標(biāo)儀、BB150-2TCS 二氧化碳培養(yǎng)箱、Sorvall Stratos 低溫冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific 公司；SDS-PAGE 膠電泳轉(zhuǎn)膜裝置美國(guó)Bio-Rad 公司；Odyssey 熒光成像系統(tǒng) 美國(guó)LI-COR Biosciences 公司；CKX53 倒置熒光顯微鏡日本OLYMPUS 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基液中，在37 ℃，5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代1 次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 將BV2 細(xì)胞分成4 組：正常組，模型組，SIRT3 抑制劑+天麻素組，天麻素組。正常組：給予細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組：使用D-半乳糖（10、20、30 和40 μg/mL）處理BV2 細(xì)胞24 h；SIRT3 抑制劑+天麻素組：先使用D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞24 h，然后同時(shí)使用10 μmol/L 的SIRT3 抑制劑和天麻素處理BV2 細(xì)胞24 h；天麻素組：先使用D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞24 h，然后使用天麻素（10、20、30、40和50 μmol/L）處理BV2 細(xì)胞24 h。

1.2.3 CCK-8 法測(cè)量細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在96 孔板中，各組細(xì)胞用藥干預(yù)結(jié)束后，棄去使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定各組細(xì)胞吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用各組吸光度值與正常組吸光度的比值進(jìn)行表示。

1.2.4 SA--Gal 染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老面積 將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在TC 處理細(xì)胞爬片上，各組細(xì)胞在用藥干預(yù)結(jié)束后，吸除使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。每孔加入400 μL PBS 進(jìn)行洗滌3 次，每次3 min，洗滌結(jié)束后，每孔加入400 μL-Gal 染色固定液在室溫固定15 min。染色固定結(jié)束后，每孔加入400 μL PBS 洗滌3 次，每次3 min。洗滌結(jié)束后，每孔加入400 μL染色工作液（每1 mL 染色工作液中按照：-Gal 染色液A:B:C:X-Gal=10:10:930:50 的比例配制）。使用保鮮膜封住24 孔板以防止蒸發(fā)，放在37 ℃烘箱中孵育過夜。孵育結(jié)束后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用衰老細(xì)胞面積與總細(xì)胞面積進(jìn)行表示。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)IL-1、IL-6 和TNF-的含量將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在6 孔板中并進(jìn)行用藥干預(yù)。各組用藥干預(yù)結(jié)束后，首先根據(jù)試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。收集各組細(xì)胞進(jìn)行離心（500 g，5 min），取上清。分別將100 μL 樣品和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的反應(yīng)孔中，用封板膜封住反應(yīng)孔并室溫孵育120 min。孵育結(jié)束后進(jìn)行洗板，拍干后每孔加入400 μL 辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin，用封板膜封住反應(yīng)孔后，室溫下避光孵育20 min。孵育結(jié)束后，進(jìn)行洗板5 次。拍干反應(yīng)板后，每孔加入100 μL 顯色劑TMB 試劑。室溫下避光孵育20 min，每孔加入50 μL 終止液，混勻后立即測(cè)量A值。

1.2.6 生化法檢測(cè)活性氧（ROS）水平 將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在96 孔板中，各組細(xì)胞用藥干預(yù)結(jié)束后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（按照1:1000 比例稀釋），37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。孵育結(jié)束后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3 次，每次5 min，洗滌結(jié)束后使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度值。

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中SIRT3 蛋白表達(dá)水平將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在TC 處理細(xì)胞爬片上并進(jìn)行用藥干預(yù)。各組干預(yù)結(jié)束后，吸盡使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入400 μL 固定液室溫下固定30 min。固定結(jié)束后，去除固定液，每孔加入400 μL PBS 放入搖床進(jìn)行搖動(dòng)洗滌，每次5 min，洗滌3 次。洗滌結(jié)束后用封閉液封閉60 min，封閉結(jié)束后加入稀釋的一抗anti-SIRT3（1:500）。在4 ℃條件下孵育過夜，一抗孵育結(jié)束后，每孔加入400 μL PBS 洗滌5 次，每次5 min。洗滌結(jié)束后，每孔加入熒光標(biāo)記的Alexa Fluor 555 標(biāo)記驢抗兔IgG（H+L）（1:1000）室溫下避光孵育60 min，孵育結(jié)束后使用抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）進(jìn)行封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.8 Western Blot 法檢測(cè)SIRT3、P16、P21 蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在24 孔板中并進(jìn)行用藥干預(yù)。各組干預(yù)結(jié)束后，每孔加入400 μL PBS 洗滌。洗滌結(jié)束后每孔加入100 μL 裂解液，使用移液槍吹打，使裂解液與細(xì)胞充分接觸。充分裂解后，離心（12000 g，5 min），取上清。使用BCA 法測(cè)量蛋白濃度。使用12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后加入適量的封閉液，室溫下封閉60 min，使用一抗稀釋液稀釋一抗anti-SIRT3（1:1000），anti-P16（1:1000），anti-P21（1:1000）和-actin（1:1000），在4 ℃條件下孵育過夜，用Western 洗滌液洗滌3 次，每次10 min，加入二抗anti-rabbit（1:10000）、antimouse（1:10000），室溫孵育60 min，洗滌3 次，每次10 min。洗滌結(jié)束后將配置好的顯影液滴加在PVDF 膜上進(jìn)行曝光成像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 GraphPad Prism 8.0 軟件（GraphPad Software,Inc.,An Diego,CA）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)（Independent-Sample t Test），多組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)＝0.05，＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，＜0.01 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-半乳糖對(duì)BV2 細(xì)胞活力和衰老的影響

研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖在半乳糖氧化酶的催化作用下，會(huì)產(chǎn)生過氧化氫和醛糖，該產(chǎn)物又會(huì)刺激細(xì)胞，產(chǎn)生大量的自由基離子，從而進(jìn)一步損傷細(xì)胞的生理功能，因此本實(shí)驗(yàn)使用D-半乳糖誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞衰老建立細(xì)胞模型。如圖1 顯示，不同劑量的D-半乳糖（10、20、30 和40 μg/mL）均能夠降低BV2 細(xì)胞活力，并且呈劑量依賴性下降（＜0.05）。使用30 μg/mL的D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞存活率在50%～60%，比20 μg/mL 的D-半乳糖誘導(dǎo)更為顯著地降低細(xì)胞活力（＜0.05），高于使用40 μg/mL 的D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞存活率（＜0.05）。為避免D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞活力過度降低而產(chǎn)生不可逆性的損傷，本實(shí)驗(yàn)選擇濃度30 μg/mL 的D-半乳糖用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)30 μg/mL 的D-半乳糖對(duì)BV2 細(xì)胞衰老的影響，由于-半乳糖苷酶染色陽性是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志物，因此本實(shí)驗(yàn)使用SA-Gal 染色法BV2 細(xì)胞衰老面積。如圖2 顯示：正常組細(xì)胞SA--Gal 衰老染色面積小，30 μg/mL 的D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞SA--Gal 染色面積極顯著增大（＜0.01）。這表明使用30 μg/mL 的D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞能夠降低BV2 細(xì)胞活力，并且引起B(yǎng)V2 細(xì)胞衰老。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用30 μg/mL的D-半乳糖進(jìn)行造模。

圖1 不同濃度的D-半乳糖對(duì)BV2 細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of D-galactose on the viability of BV2 cells

圖2 30 μg/mL 的D-半乳糖對(duì)BV2 細(xì)胞SA-β-Gal 染色面積的影響Fig.2 Effect of 30 μg/mL D-galactose on SA-β-Gal staining area of BV2 cells

2.2 天麻素對(duì)D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞活力和衰老的影響

先前研究已證實(shí)天麻素具有抗衰老作用。本實(shí)驗(yàn)中，使用不同濃度（10、20、30、40 和50 μmol/L）的天麻素干預(yù)衰老的BV2 細(xì)胞，然后檢測(cè)各組細(xì)胞活力以測(cè)定天麻素的最佳干預(yù)濃度。如圖3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：濃度為20、30、40 和50 μmol/L 的天麻素均能提高D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性（＜0.05）。30 μmol/L 的天麻素比20 μmol/L 的天麻素更有效的提高細(xì)胞活力（＜0.05）。而30 μmol/L天麻素較之40 μmol/L 天麻素與50 μmol/L 天麻素的作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為30 μmol/L 的天麻素用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞的SA--Gal 染色，如圖4 結(jié)果顯示：與模型組相比，天麻素組中BV2 細(xì)胞SA--Gal 染色面積極顯著減少（＜0.01）。與天麻素組相比，SIRT3抑制劑+天麻素組中BV2 細(xì)胞的SA--Gal 染色面積增加（＜0.05）。這提示天麻素能改善D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞衰老，而抑制SIRT3 表達(dá)則會(huì)減弱天麻素對(duì)D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞的抗衰老作用。

圖3 不同濃度的天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of gastrodin at different concentrations on the viability of BV2 cells induced by D-galactose

圖4 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中β-半乳糖苷酶染色面積的影響Fig.4 Effects of gastrodin on β-galactosidase staining area in D-galactose-induced BV2 cells

2.3 天麻素對(duì)D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響

如圖5 顯示，與正常組相比，模型組BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平極顯著增高（＜0.01）。與模型組相比，天麻素組BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平極顯著降低（＜0.01）。與天麻素組細(xì)胞相比，SIRT3 抑制劑加天麻素組中BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平增加（＜0.05）。這提示天麻素能改善D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 炎癥反應(yīng)，而抑制SIRT3 表達(dá)則會(huì)減弱天麻素對(duì)D-半乳糖處理的BV2細(xì)胞抗炎作用。

圖5 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中神經(jīng)炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的影響Fig.5 Effects of gastrodin on the neuroinflammatory factor IL-1β、IL-6 and TNF-α content in BV2 cells induced by D-galactose

2.4 天麻素對(duì)D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞ROS 水平的影響

由于線粒體產(chǎn)生的ROS 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組BV2 細(xì)胞的ROS 水平。如圖6結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組細(xì)胞ROS 水平極顯著增高（＜0.01）。與模型組相比，天麻素組中細(xì)胞ROS 水平極降低（＜0.01）。此外，與天麻素組相比，SIRT3 抑制劑+天麻素組中細(xì)胞ROS 水平顯著升高（＜0.05）。這提示天麻素能降低D-半乳糖處理的BV2 中ROS 水平，而抑制SIRT3 表達(dá)則會(huì)減弱天麻素降低BV2 細(xì)胞中ROS 的保護(hù)作用。

圖6 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中ROS 水平的影響Fig.6 Effects of gastrodin on ROS level in BV2 cells induced by D-galactose

2.5 天麻素對(duì)D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞中SIRT3、P16 和P21 蛋白表達(dá)的影響

如圖7 和圖8 結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組BV2 細(xì)胞中SIRT3 熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平極顯著下降（＜0.01）。與模型組相比，天麻素組中細(xì)胞SIRT3 熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平極顯著增高（＜0.01）。此外，與天麻素組相比，SIRT3 抑制劑+天麻素組BV2 細(xì)胞中SIRT3 熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。這提示天麻素能夠增高D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞中SIRT3 蛋白表達(dá)。

圖7 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中SIRT3 蛋白熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effects of gastrodin on the fluorescence intensity of SIRT3 protein in BV2 cells induced by D-galactose

細(xì)胞周期異常是細(xì)胞衰老的一個(gè)關(guān)鍵病理特征，衰老細(xì)胞表現(xiàn)出永久性細(xì)胞周期阻滯，并主要由P16INK4A 蛋白和P53-P21-RB 蛋白調(diào)節(jié)。因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組細(xì)胞中P16 和P21 蛋白表達(dá)水平。如圖8 結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組細(xì)胞P16 和P21 蛋白表達(dá)極顯著增加（＜0.01）。與模型組相比，天麻素組細(xì)胞P16 和P21 蛋白表達(dá)極顯著降低（＜0.01）。此外，與天麻素組相比，SIRT3 抑制劑+天麻素組中細(xì)胞P16 和P21 蛋白表達(dá)顯著增加（＜0.05）。這提示天麻素能夠降低D-半乳糖處理的BV2 細(xì)胞中P16 和P21 蛋白水平，但是抑制SIRT3 表達(dá)后，天麻素降低BV2 細(xì)胞中衰老相關(guān)蛋白P16 和P21蛋白的作用被部分減弱，因此SIRT3 可能是天麻素發(fā)揮抗衰老作用的重要靶點(diǎn)。

圖8 天麻素對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中SIRT3、P16 和P21 蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of gastrodin on the expression of SIRT3,P16 and P21 proteins in BV2 cells induced by D-galactose

3 討論與結(jié)論

隨著預(yù)期壽命的逐漸延長(zhǎng)，人體各器官的生理機(jī)能狀態(tài)漸進(jìn)性下降，直至功能喪失。衰老通常不被視為一種疾病，但它卻是心血管疾病、代謝性疾病，尤其是神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病的重要危險(xiǎn)因素。在衰老的組織器官中，衰老細(xì)胞大量積累，并以不可逆的方式失去增殖能力，導(dǎo)致組織的再生潛能喪失、導(dǎo)致炎癥和器官功能障礙。在正常的條件下，衰老細(xì)胞通常在一個(gè)稱為免疫監(jiān)視的過程中被免疫細(xì)胞清除，然而隨著年齡的增長(zhǎng)，衰老的免疫細(xì)胞也出現(xiàn)漸進(jìn)性的功能失調(diào)，引起其他衰老的細(xì)胞清除減少，最終導(dǎo)致整個(gè)器官和系統(tǒng)功能水平障礙。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細(xì)胞，以持續(xù)和動(dòng)態(tài)的方式監(jiān)察健康的腦組織環(huán)境，并能夠清除其他受損的神經(jīng)細(xì)胞，在衰老大腦的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性病變中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，衰老的大腦呈現(xiàn)出低級(jí)炎癥狀態(tài)。在大腦衰老的過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞也發(fā)生衰老并逐漸積累，產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子TNF-、白細(xì)胞介素IL-1和白細(xì)胞介素IL-6，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，使用D-半乳糖處理BV2 細(xì)胞以建立衰老細(xì)胞模型，證實(shí)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了-半乳糖苷酶染色增加和細(xì)胞周期阻滯的典型衰老病理特征，并且衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞活力下降，釋放的炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-水平增加，引起了神經(jīng)炎癥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致。在對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)的實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)使用前期研究已經(jīng)證實(shí)具有抗炎和抗衰老作用的天麻素。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，改善衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠增加細(xì)胞活力，減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)。因此，調(diào)節(jié)衰老小膠質(zhì)細(xì)胞的功能以減少炎癥因子的釋放，已經(jīng)成為調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥、改善大腦衰老的一種重要策略。

NAD+依賴的脫乙酰蛋白SIRT3 是主要的線粒體脫乙酰酶，能夠調(diào)節(jié)線粒體功能和氧化應(yīng)激，并保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。最近的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SIRT3 與炎癥的進(jìn)展有關(guān)，研究結(jié)果顯示LPS 和TNF-能夠顯著抑制人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)，引起小鼠心肺組織周細(xì)胞的丟失和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的增加。在小鼠腦中敲低SIRT3 表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)IL-1的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)退行性變。同時(shí)，SIRT3 在衰老條件下表達(dá)受到抑制，恢復(fù)SIRT3 表達(dá)能夠通過恢復(fù)線粒體功能增加小膠質(zhì)細(xì)胞的活力，改善神經(jīng)炎癥反應(yīng)。與之一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)衰老的BV2 細(xì)胞中SIRT3 蛋白表達(dá)下降，進(jìn)一步使用SIRT3 抑制劑抑制SIRT3 蛋白表達(dá)后，小膠質(zhì)細(xì)胞的衰老細(xì)胞數(shù)量增加、細(xì)胞周期阻滯的程度加重，加劇了小膠質(zhì)細(xì)胞的衰老進(jìn)程，同時(shí)也引起了更多線粒體ROS 水平產(chǎn)生和炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平增加，這也驗(yàn)證了SIRT3 與神經(jīng)炎癥反應(yīng)之間具有調(diào)控作用。

天麻素作為天麻的主要活性成分之一，大量的研究證明天麻素具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗衰老的作用，能夠降低脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2 和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)，并且能夠通過調(diào)控TLR4/NFB 信號(hào)通路減少BV2細(xì)胞的過度激活。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究天麻素對(duì)衰老的BV2 細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)天麻素能夠劑量依賴性改善衰老的BV2 細(xì)胞活力，并且能夠減少衰老的BV2 細(xì)胞數(shù)量和改善細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而發(fā)揮抗衰老作用。此外，天麻素還能通過降低衰老的BV2細(xì)胞中ROS 水平和炎癥因子IL-1，IL-6 和TNF-水平發(fā)揮抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)在同時(shí)給予SIRT3抑制劑和天麻素處理后，天麻素對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎和抗衰老作用減弱，表明天麻素可能通過增高SIRT3 表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)首次研究天麻素對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎和抗衰老作用，發(fā)現(xiàn)天麻素能增加衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞活力，減少-半乳糖苷酶染色面積和衰老相關(guān)蛋白P16 和P21 表達(dá)水平。此外，天麻素還能降低衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS 水平和神經(jīng)炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-水平，提高SIRT3 蛋白表達(dá)水平。由此推測(cè)天麻素對(duì)衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞的抗衰老和抗炎作用可能與上調(diào)SIRT3 蛋白表達(dá)有關(guān)，為研究天麻素的神經(jīng)保護(hù)作用提供了新的方向，但有關(guān)天麻素抗衰老和抗炎的具體作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步闡明。