鐵皮石斛蛋白提取工藝優(yōu)化、活性成分篩選及結構研究

曾 婧，白雪媛，王 悅，趙大慶，王思明

（長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春 130000）

近年來，由于人們飲食的不規(guī)律、不健康和長期酗酒及非甾體抗炎藥的濫用等原因，胃黏膜損傷的概率逐漸呈上升趨勢，導致胃黏膜損傷，出現(xiàn)出血、潰瘍等癥狀，長期可能發(fā)展為胃炎，甚至胃癌。鐵皮石斛（）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。中醫(yī)古籍記載其具有“厚腸胃”、“清胃熱除虛熱”、“健脾開胃”功效，是臨床常用的“胃腸藥”。鐵皮石斛具有一定的藥用價值，目前研究基本上都集中在其多糖、生物堿、類黃酮等對胃黏膜損傷的保護作用。

現(xiàn)有研究表明，鐵皮石斛多糖是發(fā)揮抗胃黏膜損傷活性的關鍵化合物，也有研究表明鐵皮石斛蛋白對胃黏膜損傷具有修復作用。胃黏膜損傷后，IL-6、TNF-等炎癥因子表達量明顯上升，且為了起到修復作用，TFF2、EGF、EGFR 等生長調節(jié)因子表達量升高。鐵皮石斛蛋白在治療損傷時，可通過降低TFF、PPARgama 等因子，對AKT 信號通路產(chǎn)生一定影響，從而調控Bax 和Bcl-2 等凋亡基因，并減少TNF-等炎癥因子的釋放。本課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Tris-HCl 冷提鐵皮石斛水溶性總蛋白對損傷的大鼠胃黏膜的治療效果優(yōu)于鐵皮石斛多糖。且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛鮮品功效優(yōu)于干品，并通過中醫(yī)古籍記載證實了鐵皮石斛鮮品效果更優(yōu)。現(xiàn)在常用的提取鐵皮石斛蛋白的方法為鹽（NaCl）溶液浸提和水提醇沉兩種，且收率都不高，容易出現(xiàn)糖和蛋白一起提出的現(xiàn)象。相較于常用方法，Tris 冷提法得到的蛋白收率較高且蛋白含量高，可作為理想的提取鐵皮石斛蛋白的方法。

本文采用鐵皮石斛鮮品用冷提法提取鐵皮石斛水溶性總蛋白，并在單因素實驗基礎上，使用響應面法優(yōu)化提取條件后，分離純化鐵皮石斛水溶性總蛋白，并在體外建立胃黏膜損傷模型以篩選活性蛋白，最后對其進行初步評價及結構鑒定。試驗結果優(yōu)化了鐵皮石斛蛋白的提取方法，且進一步對鐵皮石斛蛋白的活性研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛 浙江雁蕩山鐵皮石斛種植基地，采集時間8 月；Tris Base、CSA Sigma 公司；硫酸銨、鹽酸、溴化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉 北京化工廠；DEAE 離子交換層析介質（90 μm）中科森輝微球技術有限公司，貨號31-0010-04；大鼠胃黏膜上皮細胞完全培養(yǎng)基 普諾賽，貨號CM-R039；胎牛血清、1%雙抗、磷酸鹽緩沖液 美國BI 公司；0.25%胰酶-EDTA（600 U/mL）美國MRC 公司；普通型透析袋（3000）44 mm 上海源葉公司；無水乙醇 天津市匯杭化工有限公司；P0012S-3BSA（99%）、曲拉通X-100（Triton X 100）、細胞核染色（DAPI dihydrochloride）、上皮細胞抗體（EPCAM Mouse Monoclonal Antibody）、成纖維細胞抗體（Vimentin Mouse Monoclonal Antibody）、山羊抗兔抗體、牛血清白蛋白（BSA）、42613--33-2 分散酶2（5 U/mL，Dispase2）、C8140 膠原酶Ⅰ（246 units/mg solid）、四唑鹽（MTT）北京索萊寶公司；達喜 德國拜耳公司；BCA 試劑盒 碧云天生物技術公司；24 h SD 大鼠乳鼠 長春市億斯實驗動物技術有限責任公司（SCXK（吉）-2020-0002）。

150i 細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo 公司；Infinite 200 酶標儀 瑞士Tecan 公司；XS 105DU 電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Mini Protean Powerpac蛋白電泳儀 美國伯樂公司；AKTA START 蛋白純化儀 美國GE 公司；FE20 pH 計 美國梅特勒-托利多公司；SX-700 蒸汽滅菌器 日本Tomy Digital Biology 公司；CKX53iPC 倒置顯微鏡 上海通灝光電科技有限公司；VERTEX 70 傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker 公司；Chirascan Plus 圓二色譜儀 英國應用光物理公司；Shimadzu UV-1800 分光光度計 日本島津公司；SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵皮石斛蛋白提取工藝流程 采用堿提酸沉法提取鐵皮石斛蛋白。取新鮮鐵皮石斛，加20 mmol/L、pH=7.4 的Tris-HCl 勻漿，至于4 ℃冰箱中冷提，加入一定飽和度的硫酸銨，鹽析，7000 r/min 離心10 min，沉淀即為鐵皮石斛粗蛋白。透析袋透析脫鹽3 d，凍干，得到脫鹽的鐵皮石斛蛋白粗蛋白，備用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 提取時間對鐵皮石斛蛋白收率的影響 在料液比1:25 g/mL，硫酸銨飽和度80%條件下，按1.2.1中提取流程，分析提取時間3、6、9、12、15 h 對鐵皮石斛粗蛋白收率的影響。

1.2.2.2 料液比對鐵皮石斛蛋白收率的影響 在提取時間6 h，硫酸銨飽和度80%條件下，按1.2.1 中提取流程，分析料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL 對鐵皮石斛粗蛋白收率的影響。

1.2.2.3 硫酸銨飽和度對鐵皮石斛蛋白收率的影響在提取時間6 h，料液比1:25 g/mL 條件下，按1.2.1中提取流程，分析飽和度40%、50%、60%、70%、80%、90%的硫酸銨，探對鐵皮石斛粗蛋白收率的影響。

1.2.3 響應面試驗 依據(jù)單因素實驗結果，選取提取時間（A）、料液比（B）、硫酸銨飽和度（C）為考察因素，以鐵皮石斛粗蛋白收率為響應值，采用三因素三水平分析方法，利用Design Expert 8.0.6 進行試驗設計，優(yōu)化鐵皮石斛蛋白提取工藝，每個樣品處理重復三次，并通過 Design-Expert V8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合。設計見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平Table 1 Box-Behnken experimental design factors and levels

1.2.4 鐵皮石斛蛋白收率的計算 蛋白收率（%）=凍干蛋白重量/鐵皮石斛重量×100

1.2.5 鐵皮石斛蛋白含量測定 采用BCA 試劑盒法，配制不同濃度的標準品，繪制標準曲線。配制不同濃度的鐵皮石斛蛋白，每個濃度設置3 個平行樣，37 ℃放置30 min，測定吸光度值。帶入標準曲線得鐵皮石斛粗蛋白含量。

1.2.6 鐵皮石斛蛋白分離純化及鑒定

1.2.6.1 陰離子交換柱層析法 先配制不同流動相，流動相A：20 mmol/L Tris-HCl，流動相B：20 mmol/L Tris-HCl+1 mol/L NaCl。均用雙蒸水溶解，pH 用HCl 調節(jié)至6.5。采用DEAE 弱陰離子交換柱層析法，將響應面優(yōu)化條件下制備的鐵皮石斛水溶性總蛋白用流動相A 配制成5 mg/mL 的溶液，并用微膜過濾（孔徑0.45 μm），每次以100 mg 的鐵皮石斛水溶性總蛋白通過DEAE 陰離子交換柱（粒徑90 μm）。以3 mL/min 的流速用流動相A 10 倍柱體積洗脫，然后逐漸增大流動相B 的濃度進而通過增加鹽的濃度進行梯度洗脫（即NaCl 濃度范圍0～0.5 mol/L），20 倍柱體積洗脫，最后用流動相B 10 倍柱體積洗脫，分別逐級的將蛋白依次洗脫下來。用透析袋透析脫鹽2 d，凍干，備用。

1.2.6.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）將1.2.6.1 凍干后的蛋白用雙蒸水配制成濃度為1 mg/mL 的溶液，在分離膠濃度為12%和濃縮膠濃度為5%條件下進行電泳實驗，每孔上樣量為20 μL，空泳道上電極緩沖液。

1.2.7 乙醇損傷大鼠原代胃黏膜上皮細胞模型建立及純化蛋白活性篩選

1.2.7.1 大鼠原代胃黏膜上皮細胞的提取及培養(yǎng) 取大鼠乳鼠的胃，將胃剪開，用含有青鏈雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，轉移至用含有0.21%牛血清白蛋白（BSA）、0.17%分散酶2（Dispase2）和0.12%膠原酶Ⅰ的磷酸鹽緩沖液（PBS）配制的消化酶中，乳鼠胃的個數(shù)與消化酶毫升數(shù)為1:3。于37 ℃，160 r/min的搖床中消化1 h。用吹管反復吹打后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min。將胃組織取出，于4 ℃，1050 r/min 將消化液離心5 min。棄上清，用培養(yǎng)基重懸，過0.22 μm 的細胞篩網(wǎng)，4 ℃，1050 r/min，離心5 min。棄上清，用培養(yǎng)基重懸，轉移到T25 細胞培養(yǎng)瓶中，及時查看情況并換液。當原代細胞鋪滿瓶底，細胞融合達80%以上時，可進行傳代。傳代前先用PBS 清洗細胞1 次，加入1 mL 0.25%胰酶-EDTA對細胞進行消化，在倒置顯微鏡下觀察，當細胞間隙變大，細胞變圓時，吸棄胰酶，加入2 mL 培養(yǎng)基終止消化，并充分吹打，使細胞脫落。將細胞轉入1.5 mL EP 管中以1100 r/min 進行離心，吸棄上層培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基將細胞重懸，按照1:3 的比例接種于T25 細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.7.2 大鼠原代胃黏膜上皮細胞免疫熒光鑒定在細胞傳代時，將多余細胞轉至細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)1～2 d 直至細胞融合達80%，吸棄培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次。用4%多聚甲醛于室溫下固定細胞15 min，再用PBS 清洗3 次，加入0.5% 曲拉通X 100（Triton X 100，用PBS 配制），室溫下孵育30 min，吸棄0.5%Triton X 100，加入上皮細胞抗體（EPCAM）或成纖維細胞抗體（VIM）于4 ℃孵育過夜。吸棄抗體，PBS清洗3 次，加入山羊抗兔抗體，37 ℃避光孵育1 h。加入細胞核染色（DIPA）染細胞核15 min。倒置顯微鏡下觀察。

1.2.7.3 乙醇損傷大鼠原代胃黏膜上皮細胞模型建立及純化蛋白活性篩選 取對數(shù)生長期的大鼠胃黏膜上皮細胞（GECs-1）細胞，按接種密度5×10個/mL均勻接種于96 孔板中，至于37 ℃，5%CO的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設置空培養(yǎng)基無細胞的空白組、0%無水乙醇的對照組和1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%乙醇模型組，每組設置6 個平行樣孔，損傷3 h，更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，每孔加入四唑鹽（MTT）溶液20 μL，37 ℃，5%CO的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO溶液，用酶標儀振搖180 s，于490 nm 波長下檢測吸光度值。細胞存活率（%）=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100。

對純化后的三種蛋白做體外活性試驗。同上述方法接種96 孔板并培養(yǎng)24 h 后，除空白組外，用上述方法對大鼠胃黏膜上皮細胞進行損傷造模，損傷3 h 后，吸棄培養(yǎng)基，空白組和模型組加完全培養(yǎng)基，陽性藥組加用培養(yǎng)基配制的終濃度為0.05 mg/mL 的達喜，其他各組加入純化后用培養(yǎng)基配制的終濃度為0.005 mg/mL 的不同蛋 白（TPSHP-1、TPSHP-2、TPSHP-3）。培養(yǎng)24 h 后，用MTT 法測得各組的存活率。配制終濃度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007 mg/mL 的TPSHP-2 用于乙醇損傷3 h 后的細胞，培養(yǎng)24 h 后，再用MTT 法測得各組的存活率。

1.2.8 鐵皮石斛蛋白結構表征

1.2.8.1 紫外吸收光譜檢測 取凍干后的TPSHP-2用雙蒸水配制成1 mg/mL 溶液，用分光光度計在室溫下測量溶液在200～600 nm 范圍內的紫外光譜。

1.2.8.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）檢測 將凍干后的TPSHP-2 與KBr 按質量比1:100 研磨混合，壓片后以VERTEX 70 傅里葉紅外光譜儀于4000～400 cm波數(shù)范圍下掃描，獲得紅外光譜圖。

1.2.8.3 圓二色譜（CD）檢測 取凍干后的TPSHP-2 用20 mmol/L PB 配制成0.2 mg/mL 分散液，采集分散液在180～340 nm 波長間的遠近紫外吸收，采集分散液在190～260 nm 波長間的遠紫外吸收，獲得圓二色譜圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Prism 9、Origin 9.0 軟件作圖，Image-J 軟件對圖進行分析。數(shù)據(jù)用SPSS17.0 軟件進行分析，結果用“平均值±標準差”表示，數(shù)據(jù)用ANOVA 方法作差異分析（＜0.05）。實驗均做3 次平行。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對鐵皮石斛蛋白收率的影響 如圖1可知，增加提取時間，鐵皮石斛粗蛋白的收率總體呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在提取時間為6 h 時，鐵皮石斛粗蛋白收率達到最大。當提取時間超過6 h，則出現(xiàn)蛋白質凝聚沉積現(xiàn)象，導致收率降低。故選擇提取時間為6 h 進行后續(xù)實驗。

圖1 提取時間對收率的影響Fig.1 Effect of extraction time on yield

2.1.2 料液比對鐵皮石斛蛋白收率的影響 如圖2可知，在提取液體積較小時，鐵皮石斛藥材溶解擴散不完全，從而導致蛋白收率較低。隨著提取液體積逐漸增加，鐵皮石斛粗蛋白收率呈上升趨勢，當料液比為1:25 g/mL 時，鐵皮石斛中蛋白能充分析出，此時蛋白收率達到最大。當繼續(xù)增大料液比時，使得溶液中蛋白質濃度較低，泡沫穩(wěn)定性較差，蛋白質收率降低。故選擇料液比為1:25 g/mL 進行后續(xù)實驗。

圖2 料液比對收率的影響Fig.2 The effect of material-liquid ratio on yield

2.1.3 硫酸銨飽和度對鐵皮石斛蛋白收率的影響如圖3 可知，隨著硫酸銨飽和度逐漸增加，鐵皮石斛蛋白收率呈上升趨勢。這是因為隨著鹽濃度的增加，使得蛋白質表面電荷增加。當硫酸銨飽和度為80%時，鐵皮石斛蛋白提取效果最好，收率最大。當硫酸銨飽和度大于80%后，由于鹽含量過高而導致蛋白質表面雙電層和水化層遭到破壞使得蛋白溶解度降低，導致鐵皮石斛蛋白的收率呈下降趨勢。故選擇硫酸銨飽和度為80%進行后續(xù)實驗。

圖3 硫酸銨飽和度對收率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate saturation on yield

2.2 響應面試驗

2.2.1 回歸模型的建立與數(shù)據(jù)分析 從單因素實驗的結果可以看出，當提取時間為6 h、料液比為1:25 g/mL、硫酸銨飽和度為80%時，分別有最佳收率。在單因素實驗的基礎上，以鐵皮石斛粗蛋白收率為評價指標，對提取時間（A）、料液比（B）和硫酸銨飽和度（C）進行三因素三水平響應面優(yōu)化設計，結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface test design and results

得到二次多元回歸方程：Y=8.57+0.059A+0.42B+0.41C+0.54AB-0.1AC-0.27BC-1.31A-0.76B-1.22C。該試驗模型的顯著性分析見表3。由方差分析結果可知，模型=88.44，＜0.0001，說明該回歸模型差異極顯著。方程失擬項=4.78，＞0.05，表明失擬項對純誤差影響不顯著。該模型的復決定系數(shù)=0.9913，校正決定系數(shù)=0.9801，說明回歸模型與實驗擬合度好，說明其他因素對試驗結果干擾較小，根據(jù)值可知，影響蛋白收率的三個因素大小順序為B＞C＞A，即料液比＞硫酸銨飽和度＞提取時間，交互項AC 不顯著（＞0.05），交互項BC 交互作用顯著（＜0.05），交互項AB 交互作用極顯著（0.01）。二次項A、B、C的影響極顯著（0.01）。

表3 響應面方差分析Table 3 Response surface variance analysis

2.2.2 響應面各因素交互作用分析 利用Design Expert 8.0.6，根據(jù)回歸方程，分析響應面各因素交互試驗結果，生成等高線和響應面圖，分析提取時間、料液比和硫酸銨飽和度交互作用對鐵皮石斛粗蛋白收率的影響。從圖4 可以看出，三個因素在所選范圍內存在極值，即等高線中最小橢圓的中心點。響應面坡度越陡，等高線密集形成橢圓形則表明2 個因素的交互作用的影響就越大。

圖4 各因素間交互作用圖Fig.4 Diagram of interaction between factors

經(jīng)軟件分析優(yōu)化，預測出最優(yōu)條件為：提取時間6.22 h，料液比1:27.81 g/mL，硫酸銨飽和度81.35%?？紤]實際情況，將該模型得到的最優(yōu)條件修正為：提取時間6 h，料液比1:27 g/mL，硫酸銨飽和度80%。分析結果預測鐵皮石斛粗蛋白收率為8.66%。對修正后的工藝參數(shù)進行3 次驗證試驗，鐵皮石斛粗蛋白平均收率為8.65%±0.13%，與理論值接近，說明該模型能夠較好的預測出鐵皮石斛粗蛋白的收率，可用于優(yōu)化鐵皮石斛粗蛋白過程。

2.3 蛋白純化結果及結果分析

2.3.1 鐵皮石斛蛋白含量 BCA 試劑盒檢測原理為堿性條件下蛋白質與二價銅離子形成藍紫色絡合物，562 nm 波長下檢測為最佳吸光度值，帶入標準曲線y=0.7977x+0.0024（=0.999）。測定鐵皮石斛粗蛋白中蛋白含量為11.64%。其余成分為多糖。

2.3.2 鐵皮石斛蛋白分離純化 將凍干的鐵皮石斛粗蛋白經(jīng)DEAE 陰離子交換柱層析后，先用Buffer A 洗脫10 倍柱體積，然后用Buffer B 梯度洗脫。當流動相pH=6.5，電導（cod）=1894，選擇流速為3 mL/min 時，NaCl 濃度為0 mol/L 出現(xiàn)未被結合的蛋白TPSHP-1；在梯度洗脫過程中，即隨著NaCl 濃度逐漸增加，出現(xiàn)蛋白TPSHP-2；在NaCl 濃度為1 mol/L 時出現(xiàn)蛋白TPSHP-3。如圖5 所示。對TPSHP-1、TPSHP-2、TPSHP-3 蛋白做SDS-PAGE，配制濃度為1 mg/mL。結果顯示TPSHP-2 蛋白為單一蛋白，分子量大小約為12 kDa。如圖6 所示。

圖5 鐵皮石斛蛋白純化圖Fig.5 Dendrobium officinale protein purification diagram

圖6 純化后TPSHP-1、TPSHP-2、TPSHP-3 蛋白電泳Fig.6 TPSHP-1、TPSHP-2、TPAHP-3 protein electrophoresis after purification

2.4 體外建模及活性篩選

2.4.1 大鼠原代胃黏膜上皮細胞免疫熒光鑒定 如圖7 所示，可以明顯的看出，該方法提出的細胞為大鼠胃黏膜上皮細胞，用Image-J 軟件計算純度為99%，即該細胞可用于后續(xù)試驗。

圖7 大鼠原代胃黏膜上皮細胞免疫熒光鑒定結果（10 ×）Fig.7 Immunofluorescence identification results of rat primary gastric mucosal epithelial cells (10 ×)

2.4.2 乙醇損傷大鼠原代胃黏膜上皮細胞模型建立如圖8 所示，當乙醇濃度達到5%時，細胞存活率為60%，符合實驗條件。此時得到的細胞狀態(tài)為理想的損傷模型。因此后續(xù)試驗選擇5%乙醇進行造模。

圖8 不同乙醇濃度對GECs-1 細胞存活率的影響Fig.8 Effect of different ethanol concentrations on the survival rate of GECs-1 cells

2.4.3 純化蛋白活性篩選 如圖9 所示，基于前期方法對細胞進行損傷，與空白組相比較，模型組細胞的存活率極顯著降低（＜0.01）。當鐵皮石斛蛋白給藥濃度為0.005 mg/mL，陽性藥給藥濃度為0.05 mg/mL 時（前期發(fā)現(xiàn)當濃度為0.005 mg/mL 時沒有效果），與模型組相比較，結果顯示，純化后的TPSHP-2 蛋白對損傷的大鼠胃黏膜上皮細胞的修復作用最好（＜0.01）。

圖9 不同蛋白同一濃度對損傷細胞的修復作用Fig.9 The repair effect of different proteins at the same concentration on damaged cells

為探究最佳給藥濃度，配制不同的TPSHP-2 蛋白濃度用于細胞給藥，由圖10 可知，相較于其他濃度對損傷的大鼠胃黏膜上皮細胞的存活率結果來看，當TPSHP-2 蛋白給藥濃度為0.005 mg/mL 時作用效果最好（＜0.01）。

圖10 TPSHP-2 蛋白不同濃度對損傷細胞修復作用Fig.10 Effects of different concentrations of TPSHP-2 protein on repairing damaged cells

2.5 蛋白結構表征

2.5.1 紫外吸收光譜檢測結果 OD/OD＞1.5，通過公式，蛋白濃度=1.45OD-0.75OD求得蛋白含量為0.629 mg/mL。如圖11 所示，TPSHP-2 在280 nm 處有最大吸收峰，表明存在蛋白質。

圖11 TPSHP-2 的紫外吸收光譜檢測結果Fig.11 UV absorption spectrum detection result of TPSHP-2

2.5.2 傅里葉變換紅外吸收光譜（FTIR）檢測結果如圖12 所示，可以清楚地觀察到三條蛋白質特征帶。酰胺Ⅰ：在1638 cm處有強吸收峰，表明由于C=O 拉伸而具有-螺旋結構；酰胺Ⅱ：兩個強吸收峰（1404、1553 cm）分別代表N-H 彎曲和C-N 拉伸；酰胺Ⅲ：1297 cm處有吸收峰，表明由于存在NH 彎曲而具有-折疊結構。在598 cm處有強吸收峰，可能是由磷酸基團的影響而引起的。紅外特征吸收峰酰胺Ⅰ帶進一步證明了TPSHP-2 具有典型的蛋白質結構。

圖12 TPSHP-2 的FTIR 檢測結果Fig.12 FTIR test results of TPSHP-2

2.5.3 圓二色譜（CD）檢測結果 如圖13 所示，在195 nm 附近有一個強的正帶，在225 nm 附近有一個強的負帶，表明TPSHP-2 主要是類蛋白質。如表4 所示，TPSHP-2 的二級結構由-螺旋（8.9%）、-折疊（50.2%）、轉角（15.7%）和無規(guī)則卷曲（30.0%），通過酰胺Ⅲ區(qū)（1297 cm）可以反映出TPSHP-2 不受水分子干擾，具有疏水作用。

圖13 TPSHP-2 的CD 檢測結果Fig.13 CD test results of TPSHP-2

表4 TPSHP-2 的二級結構含量Table 4 The secondary structure content of TPSHP-2

3 結論

本研究對實驗室前期鐵皮石斛蛋白提取工藝進行優(yōu)化，當提取時間6 h，料液比1:27（g/mL），硫酸銨飽和度80%時鐵皮石斛粗蛋白收率最大為8.65%±0.13%。并對優(yōu)化工藝后的鐵皮石斛蛋白進行分離純化，采用DEAE 陰離子交換柱層析法，選用當流動相為pH=6.5，流速為3 mL/min 時，得到TPSHP-2蛋白，對TPSHP-2 蛋白做凝膠電泳后，只有單一條帶，蛋白分子量大致為12 kDa。當TPSHP-2 蛋白濃度為0.005 mg/mL 時，對損傷的大鼠胃黏膜上皮細胞的修復作用最好，從損傷后細胞存活率結果可以看出，用TPSHP-2 蛋白治療后的細胞可以很好地修復損傷。相比較于鐵皮石斛多糖對損傷的修復所需濃度0.5 mg/mL，TPSHP-2 蛋白所需濃度更低，從治療效果和用量層面來看，TPSHP-2 蛋白效果優(yōu)于比鐵皮石斛多糖。初步探究TPSHP-2 是以-折疊為主要結構的蛋白質。下一步將對TPSHP-2 蛋白進行物理性質、化學性質及生物學性質的深入研究。