大果木姜子揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化、成分分析及抗氧化活性

劉 杰，郭江濤，劉 耀，程 純，黃 凱，簡(jiǎn)梨娜，徐 劍,，張永萍,

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州中藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽(yáng) 550025）

大果木姜子（Merr.）為樟科樟屬植物米槁（C）的干燥成熟果實(shí)，又名毛丹母、青吐木等，主要分布在我國(guó)貴州、廣西、云南等西北地區(qū)。大果木姜子為藥食兩用植物，貴州民間多直接將其腌制做泡菜食用。大果木姜子油不僅可以用于調(diào)味、去腥，起到健脾開(kāi)胃的效果，還具有抗心絞痛、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理作用，近年來(lái)陸續(xù)有相關(guān)制劑如：理氣活血滴丸、心胃丹膠囊、米槁心樂(lè)滴丸、米槁精油滴丸上市。研究表明揮發(fā)油類成分是大果木姜子的活性成分，且有報(bào)道揮發(fā)油類成分具有極好的抗氧化作用，可作為潛在的天然抗氧化劑使用，但目前并無(wú)大果木姜子揮發(fā)油抗氧化作用的相關(guān)報(bào)道。

揮發(fā)油常用的提取方法包括水蒸氣蒸餾法、超臨界CO萃取法及超聲輔助提取法，其中，水蒸氣蒸餾法因不使用有機(jī)溶劑、不會(huì)對(duì)提取得到的揮發(fā)油造成污染、成本低等優(yōu)點(diǎn)，仍是使用最為廣泛的經(jīng)典方法，但參考文獻(xiàn)中采用水蒸氣蒸餾法提取大果木姜子揮發(fā)油得率均較低，造成了大果木姜子植物資源的浪費(fèi)?；诖耍緦?shí)驗(yàn)以大果木姜子為原料，采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，同時(shí)采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）對(duì)最優(yōu)工藝提取得到的揮發(fā)油進(jìn)行成分及相對(duì)含量分析，并探討大果木姜子揮發(fā)油清除DPPH·的活性，以期為大果木姜子揮發(fā)油的充分利用及在抗氧化方面的研究及開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，為大果木姜子的合理開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大果木姜子（Merr.）貴州省黔西南州冊(cè)亨縣雙江鎮(zhèn)林木村，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定，該品為樟科樟屬植物米槁（C）的干燥成熟果實(shí)；維生素C（純度≥99.0%）成都第一制藥有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，純度≥97.0%）梯希布（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；無(wú)水乙醇（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.7%）天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

6890-5975C 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；TU-1810 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；JM·A1002 型電子天平 余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；RRH-A1000 型高速多功能粉碎機(jī) 上海綠沃工貿(mào)有限公司，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ZNHW 型數(shù)顯電熱套 上海力辰邦西儀器科技有限公司；GG-17 揮發(fā)油測(cè)定器 蜀牛玻璃儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大果木姜子揮發(fā)油的提取 按2020 版《中國(guó)藥典》（四部）通則2204“揮發(fā)油測(cè)定法甲法”提取大果木姜子揮發(fā)油。取供試品20 g，粉碎至顆粒度為35 目，以水為提取溶劑在一定料液比下浸泡一段時(shí)間，在一定的電熱套功率下提取一定時(shí)間后，靜置1 h，于揮發(fā)油測(cè)定器下端緩慢放掉水層，于水油交界處開(kāi)始收集揮發(fā)油，以13000 r/min 離心10 min 使油水分離后，采用移液槍吸取上層油相，即得大果木姜子揮發(fā)油。

1.2.2 大果木姜子揮發(fā)油提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 浸泡時(shí)間對(duì)得率的影響 精密稱取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比為1:7（g/mL），浸泡時(shí)間分別為0、1、2、3、4、5 h，在電熱套功率為100 kW下提取8 h，靜置1 h 后分離揮發(fā)油，考察浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響。

1.2.2.2 提取功率對(duì)得率的影響 精密稱取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比為1:7（g/mL），浸泡3 h，分別在電熱套功率為60、100、140、180、220 kW 下提取8 h，靜置1 h 后分離揮發(fā)油，考察不同提取功率對(duì)揮發(fā)油得率的影響。

1.2.2.3 料液比對(duì)得率的影響 精密稱取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比分別為1:3、1:4、1:5、1:6、1:7（g/mL），浸泡3 h，在電熱套功率為100 kW 下提取8 h，靜置1 h 后分離揮發(fā)油，考察不同料液比對(duì)揮發(fā)油得率的影響。

1.2.2.4 提取時(shí)間對(duì)得率的影響 精密稱取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比為1:7（g/mL），浸泡3 h，在電熱套功率為100 kW 下提取，提取時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12 h，靜置1 h 后分離揮發(fā)油，考察不同提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 大果木姜子中油類成分含量高，物料顆粒過(guò)細(xì)將無(wú)法過(guò)篩，故固定物料顆粒度為35 目。選取浸泡時(shí)間（A）、料液比（B）和提取時(shí)間（C）作為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3 個(gè)因素，以大果木姜子揮發(fā)油得率為響應(yīng)值，結(jié)合響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 大果木姜子揮發(fā)油響應(yīng)面因素水平表Table 1 Response surface factor level table of the volatile oil of Litsea lancilimba Merr.

1.2.4 大果木姜子揮發(fā)油得率的計(jì)算 設(shè)定揮發(fā)油質(zhì)量為m，藥材樣品質(zhì)量為m。大果木姜子揮發(fā)油得率按下式計(jì)算：

式中：W 表示大果木姜子揮發(fā)油得率，%；m表示大果木姜子揮發(fā)油重量，g；m表示大果木姜子重量，g。

1.2.5 GC-MS 分析條件 色譜條件：色譜柱為HP-5 MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫70 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至190 ℃，以10 ℃/min 升溫至310 ℃，運(yùn)行時(shí)間：54 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓18.34 psi，載氣流量1.0 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比：50:1；溶劑延遲時(shí)間：6 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI 源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1953 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.2.6 DPPH 自由基清除試驗(yàn) 將大果木姜子揮發(fā)油用無(wú)水乙醇配制成濃度為0.5、1、1.5、2、4、6、8、10 mg/mL 八個(gè)濃度，各取2 mL，加入0.080 mg/mL的DPPH·貯備液2 mL，搖勻，避光靜置30 min 后，以無(wú)水乙醇為參比液，測(cè)定反應(yīng)體系在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度（A），同時(shí)測(cè)定2 mL DPPH·溶液與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度（A）及2 mL 試樣液與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度（A），維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照（濃度分別為0.5、1、1.5、2、4、6、8、10 μg/mL）。

DPPH 自由基清除率按下式來(lái)計(jì)算：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、SPSS 23.0、Prism 8.0.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，0.05 表示差異顯著，0.01 表示差異極顯著，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。Design-Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)得率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1：不同浸泡時(shí)間下?lián)]發(fā)油得率存在顯著性差異（＜0.05）。浸泡時(shí)間在0～3 h 之間時(shí)，揮發(fā)油得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，2 h 和3 h 之間存在顯著性差異；當(dāng)浸泡時(shí)間≥3 h 時(shí)，揮發(fā)油的得率達(dá)到最高，為10.44%，各組之間無(wú)顯著性差異，得率不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。可能是由于此時(shí)浸提液已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，再繼續(xù)浸提會(huì)使雜質(zhì)成分溶出，與揮發(fā)油競(jìng)爭(zhēng)溶出空間導(dǎo)致得率下降?？紤]到實(shí)驗(yàn)時(shí)間及成本，故在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取浸泡時(shí)間為0、2.5 和5.0 h 三個(gè)水平。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)大果木姜子揮發(fā)油得率的影響Fig.1 Effect of soak time on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.2 提取功率對(duì)得率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2：電熱套不同提取功率下?lián)]發(fā)油得率無(wú)顯著性差異（＞0.05）。當(dāng)電熱套提取功率＞100 kW 時(shí)，揮發(fā)油得率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，可能是隨著提取功率的增大，局部提取溫度升高，導(dǎo)致部分揮發(fā)油成分被破壞，得率下降。但總體變化較小，表明提取功率對(duì)揮發(fā)油得率的影響不大。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)固定提取功率為100 kW。

圖2 提取功率對(duì)大果木姜子揮發(fā)油得率的影響Fig.2 Effect of extraction power on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.3 料液比對(duì)得率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖3：不同料液比下?lián)]發(fā)油得率存在顯著性差異（＜0.05）。隨著料液比的增加，揮發(fā)油的得率出現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1:5、1:6 g/mL 時(shí)，揮發(fā)油的得率達(dá)到最高，繼續(xù)增加料液比，揮發(fā)油的得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)樵谝欢ǖ牧弦罕确秶鷥?nèi)，揮發(fā)油的浸出傳質(zhì)系數(shù)升高，但當(dāng)料液比過(guò)大時(shí)，反而減慢了揮發(fā)油的擴(kuò)散速度。結(jié)合實(shí)際情況，在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取料液比1:2、1:4 和1:6 g/mL 作為三個(gè)水平。

圖3 料液比對(duì)大果木姜子揮發(fā)油得率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)得率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖4：不同提取時(shí)間下?lián)]發(fā)油得率存在顯著性差異（＜0.05）。隨著提取時(shí)間的增加，得率逐漸增加。當(dāng)提取時(shí)間為8 h時(shí)，增幅變緩；當(dāng)提取時(shí)間≥10 h 時(shí)，得率不再增加，可能是因?yàn)榇藭r(shí)揮發(fā)油溶液趨于飽和，繼續(xù)提取反而導(dǎo)致?lián)]發(fā)油中的成分損失?？紤]到提取時(shí)間為8 h后的得率增幅較小，結(jié)合實(shí)際提取成本，選取浸泡時(shí)間6、8 和10 h 作為三個(gè)水平。

圖4 提取時(shí)間對(duì)大果木姜子揮發(fā)油得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析 以浸泡時(shí)間、料液比和提取時(shí)間為自變量，大果木姜子的揮發(fā)油得率為因變量，采用Design-Expert 軟件對(duì)各因素回歸分析，以確定大果木姜子揮發(fā)油的最優(yōu)提取工藝，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大果木姜子揮發(fā)油響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.2.2 響應(yīng)面方差結(jié)果分析 模型＜0.01，表明回歸模型極顯著。失擬項(xiàng)＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著。從值可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，料液比對(duì)揮發(fā)油得率的影響最大，提取時(shí)間影響次之，浸泡時(shí)間的影響最小。在此模型中，一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A、B和C、交互項(xiàng)AC 對(duì)結(jié)果影響極顯著（＜0.01），一次項(xiàng)A、C 對(duì)結(jié)果影響顯著（＜0.05），其他各項(xiàng)均對(duì)試驗(yàn)影響不顯著，提示各試驗(yàn)因子與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。對(duì)各因素進(jìn)行擬合，得到二次回歸方程：Y=10.27+0.30A+0.39B+0.32C+0.16AB-0.49AC+0.23BC-0.51A-0.85B-0.60C。模型中回歸方程的決定系數(shù)=0.9536，校正測(cè)定系數(shù)adj=0.8939，說(shuō)明模型精確度高，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，可準(zhǔn)確地對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，變異系數(shù)CV=2.87%，表明試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)值存在2.87%的偏差，模型可靠性較高。噪音信號(hào)比為10.824（＞4），說(shuō)明本模型能真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大果木姜子揮發(fā)油響應(yīng)面方差分析Table 3 Response surface variance analysis of volatile oil of Litsea lancilimba Merr.

2.2.3 因素間的交互作用 三維響應(yīng)面圖曲線越陡，顯示得率受該因素影響越大；反之，曲線越緩，表明得率受該因素影響越小。等高線圖橢圓表示該兩兩因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較重，若較圓的話則影響較小。由圖5 可見(jiàn)浸泡時(shí)間和提取時(shí)間的等高線圖呈橢圓形，三維響應(yīng)面圖曲線較陡，表明二者的交互作用對(duì)得率的影響明顯。提取時(shí)間與料液比交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響次之，料液比和浸泡時(shí)間交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響最小。

圖5 各兩因素交互影響揮發(fā)油得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface diagram and contour diagram of the interaction of two factors affecting volatile oil yield

2.3 大果木姜子揮發(fā)油提取工藝的驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 8.0.6 對(duì)回歸方程求解，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需要確定大果木姜子揮發(fā)油的最佳提取條件為浸泡時(shí)間5 h，料液比1:5 g/mL，提取時(shí)間8 h，此條件下得率的理論值為10.15%。按照上述響應(yīng)面軟件分析的大果木姜子揮發(fā)油的最佳提取工藝平行提取5 次，其得率分別為10.64%、10.80%，10.54%、11.08%、10.29%，平均得率為10.67%，與預(yù)測(cè)值10.15%差距較小，RSD 為0.29%，表明該實(shí)驗(yàn)提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 GC-MS 分析大果木姜子揮發(fā)油成分

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist 17 和Wiley 275 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定各化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。大果木姜子揮發(fā)油中共分離得到81 個(gè)化合物，最終鑒定出74 個(gè)化合物，主要包括烴類（27 種）、醇類（19 種）、酮類（10 種）、酯類（4 種）、醛類（3 種）、萜類（3 種）、酸類（2 種）、酚類（2 種）、其它（4 種），占總揮發(fā)油的93.175%。總離子流圖見(jiàn)圖6，分析結(jié)果見(jiàn)表4。

圖6 大果木姜子揮發(fā)油GC-MS 總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

表4 大果木姜子揮發(fā)油化學(xué)成分及含量Table 4 Chemical constituents and contents of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

續(xù)表 4

由大果木姜子揮發(fā)油各成分相對(duì)含量可知以烴類（23.729%）、萜類（22.129%）、醇類（16.77%）、酸類（16.627%）成分為主。其中1,8-桉葉素的含量達(dá)到了21.854%，其它相對(duì)含量高于3%的分別為正癸酸（12.893%）、-蒎烯（4.873%）、對(duì)傘花烴（4.579%）、-蒎烯（4.452%）、月桂酸（3.734%）、-萜品烯醇（3.188%）。文獻(xiàn)報(bào)道1,8-桉葉素、月桂酸、-蒎烯均具有抑菌作用，其中月桂酸及其酯類是食品和化妝品中最有效的抗菌劑。-萜品烯醇則具有平喘抗炎的效果。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取得到的大果木姜子揮發(fā)油中1,8-桉葉素、月桂酸、-蒎烯含量明顯高于其它文獻(xiàn)所報(bào)道（其它文獻(xiàn)報(bào)道1,8-桉葉素最高含量為9.87%，月桂酸最高含量為3.184%，-蒎烯最高含量為1.012%），上述分析表明該產(chǎn)地大果木姜子揮發(fā)油可能具有較好的抑菌平喘效果。

2.5 大果木姜子揮發(fā)油成分的DPPH 自由基清除能力

不同濃度的大果木姜子揮發(fā)油對(duì)DPPH 自由基的清除率見(jiàn)圖7。結(jié)果表明大果木姜子揮發(fā)油抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高，在質(zhì)量濃度達(dá)到6.0 mg/mL 后對(duì)DPPH 自由基清除率的增幅變緩，當(dāng)質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL 時(shí)，樣品清除率為95.80%，此時(shí)的抗氧化能力接近于質(zhì)量濃度為6 μg/mL 的V。采用Prism 8.0.1 計(jì)算得其IC值為0.2434 mg/mL，結(jié)果表明大果木姜子揮發(fā)油對(duì)DPPH 自由基具有較好的清除能力，說(shuō)明其具有一定的體外抗氧化活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，1,8-桉葉素、-蒎烯等均具有較高的抗氧化活性，推測(cè)這些成分可能與大果木姜子揮發(fā)油的抗氧化活性有一定的關(guān)系。

圖7 大果木姜子揮發(fā)油及維生素C 對(duì)DPPH·的清除作用（n=3）Fig.7 DPPH·scavenging test results of Vc and Litsea lancilimba Merr.volatile oil (n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法確定了大果木姜子揮發(fā)油最優(yōu)提取工藝為浸泡時(shí)間5 h，料液比1:5 g/mL，提取時(shí)間8 h，得率可達(dá)10.67%，與理論值比較無(wú)顯著性差異，表明該提取工藝穩(wěn)定可行，提高了大果木姜子揮發(fā)油的得率。對(duì)該產(chǎn)地的大果木姜子揮發(fā)油化學(xué)組成及相對(duì)含量進(jìn)行了分析，共鑒定了74 種成分，占總揮發(fā)油量的93.175%，主要為烴類（23.729%）、萜類（22.129%）、醇類（16.77%）、酸類（16.627%），為后續(xù)大果木姜子揮發(fā)油生物活性研究提供了依據(jù)?？寡趸饔醚芯勘砻鞔蠊窘訐]發(fā)油對(duì)DPPH 自由基的具有較好的清除作用，具有一定的抗氧化活性。后續(xù)將繼續(xù)對(duì)大果木姜子揮發(fā)油進(jìn)行更為全面的抗氧化作用研究，同時(shí)進(jìn)行量效相關(guān)性分析，以期得到具有較強(qiáng)抗氧化作用的天然活性成分。