響應(yīng)面法優(yōu)化酶菌協(xié)同制備高抗氧化活性青錢柳發(fā)酵粉工藝

張 良，劉媛潔，嚴(yán)美婷，張超鳳

（1.江西省食品發(fā)酵研究所，江西宜春 336000；2.江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，江西上饒 334000）

青錢柳又名搖錢樹，廣泛分布于浙江、江西、湖北和湖南等地，是中國(guó)特有、國(guó)家二級(jí)保護(hù)的珍惜樹種。青錢柳葉中含有黃酮、多糖、三萜、有機(jī)酸類等多種天然功能性活性物質(zhì)，在降血糖、降血壓、降血脂、抗氧化等方面具有一定的功效?；谇噱X柳葉的藥食兼用的價(jià)值，青錢柳葉茶已通過(guò)美國(guó)食品藥品管理局的認(rèn)證，青錢柳葉已列入中國(guó)新資源食品原料目錄。青錢柳多糖、黃酮、三萜是青錢柳葉中主要的活性物質(zhì)并具有較好的抗氧化活性。

酶菌協(xié)同發(fā)酵是指原料經(jīng)酶解工藝后，再經(jīng)微生物菌種發(fā)酵的過(guò)程。酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝應(yīng)用于青錢柳葉過(guò)程，能提高天然活性物質(zhì)的溶出量，同時(shí)可去除青錢柳的苦澀味。楊潔芳等利用酶菌協(xié)同工藝制備的大豆肽含量與實(shí)驗(yàn)室制備的酶解肽相比，其DPPH 自由基清除率提高106.92%，同時(shí)解決了單一酶解時(shí)酶解產(chǎn)物帶有苦味的問(wèn)題。張倩茹等利用酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米芯制備的木聚糖，與對(duì)照組相比木聚糖含量顯著提高了257%。研究表明酶菌協(xié)同發(fā)酵效果優(yōu)于菌和酶單獨(dú)使用時(shí)的效果。毛傳亮等研究了青錢柳葉醇提后的水提物對(duì)DPPH 自由基的清除率為91.29%，鄭曉杰等發(fā)現(xiàn)浙江文成8 月份青錢柳的DPPH 清除能力為162.26 μmol AAE/g dm。但關(guān)于青錢柳葉酶解或發(fā)酵后的抗氧化活性的研究較少。

本研究以產(chǎn)自江西九江修水縣的青錢柳葉為原料，應(yīng)用酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝制備高抗氧化活性的青錢柳發(fā)酵粉，解決了單一酶解時(shí)青錢柳有苦澀味問(wèn)題和單一微生物發(fā)酵酶系不足等問(wèn)題，對(duì)制備適口性強(qiáng)和高抗氧化活性成分的產(chǎn)品有一定的產(chǎn)業(yè)化意義，為青錢柳葉的精深加工和高值化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青錢柳葉 江西九江市修水縣；半纖維素酶（10 萬(wàn) U/g）、纖維素酶（10 萬(wàn) U/g）寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；植物乳桿菌（）、釀酒酵母（）江西省食品發(fā)酵研究所菌種保藏中心提供；DPPH（純度≥98%）Sigma 公司；MRS 培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)股份有限公司；其他試劑均為分析純。

752N 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析；HHS-6恒溫水浴鍋 南通三思機(jī)電有限公司；FA1204B 電子天平 上海精科天美有限公司；SH-100C 恒溫?fù)u床 英檢達(dá)儀器（重慶）有限公司；KH22R 高速冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；LGJ-100F 凍干機(jī) 上海豫明儀器有限公司；250B 生化培養(yǎng)箱蘇州威爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 挑取4 環(huán)斜面植物乳桿菌接種到裝有80 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶后，恒溫?fù)u床（35 ℃，140 r/min）培養(yǎng)24 h；挑取4 環(huán)斜面釀酒酵母接種到裝有80 mL PDA 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶后，恒溫?fù)u床（30 ℃，140 r/min）培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)完成的植物乳桿菌和釀酒酵母菌液按照一定的質(zhì)量比混合后，制備成發(fā)酵用的混合菌種。

1.2.2 青錢柳酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝 將經(jīng)干燥粉碎后過(guò)20 目篩的青錢柳葉，按照一定的料液比，將青錢柳葉細(xì)粉和蒸餾水裝于250 mL 三角瓶中搖勻。按照青錢柳葉細(xì)粉質(zhì)量的百分比添加復(fù)合酶（纖維素酶和半纖維素酶）于裝有青錢柳細(xì)粉液的三角瓶中，在55 ℃、pH5.0 條件下，恒溫水浴酶解3.0 h。按照酶解后酶解液總質(zhì)量的百分比添加蔗糖，經(jīng)121 ℃、0.12 MPa 高壓滅菌20 min 后冷卻，按照酶解液總質(zhì)量的百分比接種混合菌（植物乳桿菌和釀酒酵母按一定質(zhì)量比混合），置于恒溫?fù)u床內(nèi)（32 ℃，140 r/min）培養(yǎng)36 h。在5 ℃和8000 r/min 條件下，發(fā)酵液離心15 min 后取上清液，50 ℃下旋轉(zhuǎn)濃縮后，真空冷凍干燥（預(yù)凍溫度為-40 ℃，預(yù)凍時(shí)間為6 h，干燥氣壓為50 Pa，干燥時(shí)間48 h）獲得青錢柳發(fā)酵粉。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.2 的工藝條件，固定單因素實(shí)驗(yàn)條件：料液比為1:8 g/mL，復(fù)合酶添加量為0.6%，復(fù)合酶（纖維素酶和半纖維素酶）質(zhì)量比為1:1 g/g，酶解時(shí)間為3.0 h，蔗糖添加量為6%，混合菌添加量為4%，混合菌（植物乳桿菌和釀酒酵母）質(zhì)量比為1:1 g/g，發(fā)酵時(shí)間為36 h。

分別考察料液比（1:4、1:8、1:12、1:16、1:20、1:24 g/mL）、復(fù)合酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、復(fù)合酶質(zhì)量比（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1 g/g）、酶解時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、蔗糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、混合菌添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、混合菌質(zhì)量比（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1 g/g）和發(fā)酵時(shí)間（20、28、36、42、50、58 h）對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響。

1.2.4 PB 試驗(yàn) 在1.2.3 的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比、復(fù)合酶添加量、復(fù)合酶質(zhì)量比、酶解時(shí)間、蔗糖添加量、混合菌添加量、混合菌質(zhì)量比、發(fā)酵時(shí)間為因素水平值，采用PB 試驗(yàn)來(lái)篩選青錢柳發(fā)酵粉對(duì)DPPH自由基清除率影響顯著的因素。PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels of PB test design

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在1.2.4 實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以具有顯著性的響應(yīng)因素復(fù)合酶添加量、復(fù)合酶質(zhì)量比和混合菌添加量為自變量，以青錢柳發(fā)酵粉對(duì)DPPH 自由基清除率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Box-Behnken test design

1.2.6 DPPH 自由基清除率的測(cè)定 參照王珊珊等的方法進(jìn)行測(cè)定。青錢柳發(fā)酵粉用85%的乙醇配制成不同濃度（5、10、20、40、80 mg/mL）的待測(cè)液。取20 mg/mL 濃度的待測(cè)液，按照A、A和A的實(shí)驗(yàn)方法，溶液混勻避光靜置30 min 后測(cè)吸光度（517 nm）。

式中，A為2 mL 的待測(cè)液與等體積DPPH乙醇溶液混合反應(yīng)后的吸光值；A為2 mL 待測(cè)液與等體積乙醇（85%）溶液混合后的吸光值；A為2 mL 乙醇（85%）溶液與等體積DPPH 乙醇溶液混合后的吸光值。

1.2.7 青錢柳發(fā)酵粉中主要成分的測(cè)定

1.2.7.1 青錢柳多糖含量的測(cè)定 苯酚-硫酸法，參照SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》。

1.2.7.2 青錢柳總黃酮含量的測(cè)定 分光光度計(jì)法，參照SN/T 4592-2016《出口食品中總黃酮的測(cè)定》。

1.2.7.3 青錢柳總?cè)坪康臏y(cè)定 分光光度計(jì)法，參照NY/T 3676-2020《靈芝中總?cè)坪康臏y(cè)定 分光光度法》。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019 整理并作圖。采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行PB 和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖1 可知，隨著料液比的逐漸增加，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率呈先增大后略減小的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1:12 g/mL 時(shí)，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率最大。分析原因可能是隨著料液比的增加，利于青錢柳抗氧化活性物質(zhì)從組織細(xì)胞內(nèi)溶出到周圍溶液中，但過(guò)大的料液比也會(huì)造成有效成分的損失，從而導(dǎo)致青錢柳發(fā)酵粉的DPPH自由基清除率降低。同時(shí)，料液比太小則不利于青錢柳的充分發(fā)酵，料液比太大會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中青錢柳抗氧化活性物質(zhì)含量的相對(duì)減少。選擇料液比為1:8～1:16 g/mL 進(jìn)行PB 試驗(yàn)。

圖1 料液比對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.2 復(fù)合酶添加量對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖2 可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先增加后逐漸減少的趨勢(shì)。當(dāng)復(fù)合酶添加量為0.8%時(shí)，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率達(dá)到最大值。分析原因可能是復(fù)合酶添加量低時(shí)，青錢柳抗氧化活性物質(zhì)等溶出較少，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)元素也不是發(fā)酵菌的最佳生長(zhǎng)條件。隨著復(fù)合酶添加量的增加，底物和酶的酶解效果較好，青錢柳抗氧化活性物質(zhì)等溶出較多，但發(fā)酵菌生長(zhǎng)較快，一些活性物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分消耗也較快，導(dǎo)致青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率略微下降。選擇復(fù)合酶添加量為0.6%～1.0%進(jìn)行PB 試驗(yàn)。

圖2 復(fù)合酶添加量對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of compound enzyme added amount on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.3 復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖3 可知，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH自由基清除率隨著復(fù)合酶（纖維素酶與半纖維素酶）中纖維素酶的質(zhì)量比的增大而增加，即當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量比為2:1 時(shí)，DPPH 自由基清除率達(dá)最大值。繼續(xù)增加纖維素酶的質(zhì)量占比，DPPH 自由基清除率略有下降。分析原因可能是，隨著纖維素酶質(zhì)量比的增加，酶解出的青錢柳多糖、黃酮等抗氧化活性物質(zhì)逐漸增加。發(fā)酵菌在較低的纖維素酶質(zhì)量比時(shí)，生長(zhǎng)較慢，水解出的青錢柳活性成分較少；發(fā)酵菌在較高的纖維素酶質(zhì)量比時(shí)，生長(zhǎng)較快，消耗青錢柳多糖、黃酮等營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)較快，DPPH 自由基清除率略有降低。選擇復(fù)合酶質(zhì)量比為1:1～3:1 g/g 進(jìn)行PB 試驗(yàn)。

圖3 復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of compound enzyme mass ratio on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖4 可知，隨著酶解時(shí)間的增加，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先增加后緩慢減少的趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)2.5 h 后，繼續(xù)增加酶解時(shí)間，青錢柳發(fā)酵液中抗氧化活性物質(zhì)會(huì)受酶解作用的影響發(fā)生部分水解，導(dǎo)致青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率降低。選擇酶解時(shí)間為2.0～3.0 h 進(jìn)行PB 試驗(yàn)。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.5 蔗糖添加量對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖5 可知，隨著蔗糖添加量的增加，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率呈先遞增后略降低的趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖添加量為8%時(shí)，DPPH 自由基清除率達(dá)最大值。分析原因可能是作為培養(yǎng)基的蔗糖濃度過(guò)高，發(fā)酵菌種的細(xì)胞的滲透壓過(guò)大，菌體生長(zhǎng)緩慢，青錢柳發(fā)酵液中抗氧化活性成分含量減少，導(dǎo)致DPPH 自由基清除率降低。選擇蔗糖添加量為6%～10%進(jìn)行PB 試驗(yàn)。

圖5 蔗糖添加量對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of sucrose addition on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.6 混合菌添加量對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖6 可知，青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率隨著混合菌添加量的增加呈先增加后略降低的趨勢(shì)。當(dāng)混合菌添加量為5%時(shí)，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率達(dá)最大值。繼續(xù)增加混合菌添加量，DPPH 自由基清除率略下降。分析原因可能是混合菌添加量達(dá)到一定量后繼續(xù)增加，會(huì)使培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)，同時(shí)消耗培養(yǎng)基中的多糖、黃酮等活性物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)滿足菌種的生長(zhǎng)，導(dǎo)致青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率降低。選擇混合菌添加量為4%～6%進(jìn)行PB 試驗(yàn)。

圖6 混合菌添加量對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of mixed bacteria added amount on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.7 混合菌質(zhì)量比對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖7 可知，DPPH 自由基清除率隨混合菌（植物乳桿菌和釀酒酵母）中植物乳桿菌的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)?；旌暇谏L(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)分泌不同的水解酶，有利于細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)中抗氧化活性物質(zhì)釋放到發(fā)酵液中?；旌暇|(zhì)量比的不同，菌種自身生長(zhǎng)和代謝所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不一樣，菌種間相互生長(zhǎng)和代謝的制約程度不一樣，由圖7 可以看出，當(dāng)混合菌質(zhì)量比為2:1 時(shí)，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率達(dá)最大值。選擇混合菌質(zhì)量比為1:1～3:1 g/g 進(jìn)行PB 試驗(yàn)。

圖7 混合菌質(zhì)量比對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of mass ratio of mixed bacteria on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖8 可知，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為42 h 時(shí)，DPPH 自由基清除率達(dá)最大值，為69.2%。發(fā)酵時(shí)間超過(guò)42 h 后，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率有所下降，分析原因可能是發(fā)酵菌種進(jìn)入生長(zhǎng)的衰老期，分泌的酶量不再增加，同時(shí)發(fā)酵菌產(chǎn)生了能降解青錢柳抗氧化活性物質(zhì)的酶，使DPPH 自由基清除率有所降低。選擇發(fā)酵時(shí)間為36～50 h 進(jìn)行PB 試驗(yàn)。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響Fig.8 Effect of fermentation time on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.2 PB 試驗(yàn)結(jié)果

表3 與表4 分別為PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果和方差分析。

表3 PB 設(shè)計(jì)的各因素水平及響應(yīng)值Table 3 Experimental design and response results of PB design

表4 PB 設(shè)計(jì)方差分析Table 4 Analysis of variance of PB design

對(duì)表3 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。模型的值為0.0178，表示該模型（＜0.05）顯著；從各因素的值可以看出B（復(fù)合酶添加量）、C（復(fù)合酶質(zhì)量比）和F（混合菌添加量）對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響顯著（＜0.05）。因此選擇復(fù)合酶添加量、復(fù)合酶質(zhì)量比和混合菌添加量共3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 在2.1 和2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定不顯著影響因素料液比1:12 g/mL、酶解時(shí)間2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌質(zhì)量比2:1 g/g、發(fā)酵時(shí)間42 h。以復(fù)合酶添加量（X）、復(fù)合酶質(zhì)量比（X）和混合菌添加量（X）3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

對(duì)表5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)而獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析（見(jiàn)表6）。經(jīng)多元回歸擬合，模型的二次多項(xiàng)式方程為：

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 6 Analysis of variance in Box-Behnken experiment

由表6 可知，該模型＜0.0001，表明建立的模型極顯著（＜0.01）；失擬項(xiàng)值不顯著，表明建立的模型擬合度較好；方程的校正決定系數(shù)和決定系數(shù)分別為0.9764 和0.9897，表明約有97.64%的響應(yīng)值變化能由該模型進(jìn)行解釋，實(shí)際實(shí)驗(yàn)與模型建立的方程擬合度較好，能用于分析和預(yù)測(cè)青錢柳酶菌協(xié)同發(fā)酵的工藝優(yōu)化。對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響極顯著（＜0.01）的因素為X、X、XX、X、X、X，對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率影響顯著的因素為XX（＜0.05），其他因素均不顯著（＞0.05）。模型的值越大對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響越大。可見(jiàn)，各因素對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響程度為：X（混合菌添加量）＞X（復(fù)合酶添加量）＞X（復(fù)合酶質(zhì)量比）。

對(duì)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析，自變量因素相互間交互作用的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖9。自變量因素對(duì)響應(yīng)值的影響與響應(yīng)面坡度陡峭程度呈正相關(guān)；等高線呈橢圓形的程度與兩個(gè)自變量交互作用的程度呈正相關(guān)。由圖9 可知，對(duì)響應(yīng)值的影響較大的交互作用為XX和XX。隨著各因素?cái)?shù)值的增大，青錢柳發(fā)酵粉對(duì)DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，響應(yīng)面呈凸型陡峭曲面，對(duì)應(yīng)的等高線呈橢圓形，表明XX和XX的交互作用顯著，DPPH自由基清除率存在極大值。

圖9 交互項(xiàng)對(duì)青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface analysis of the effects of interaction terms on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.3.2 最優(yōu)工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)模型的回歸方程分析獲得最佳的青錢柳酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝條件為：料液比1:12 g/mL、復(fù)合酶添加量0.76%、復(fù)合酶質(zhì)量比2.17:1 g/g、酶解時(shí)間2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌添加量5.83%、混合菌質(zhì)量比2:1 g/g、發(fā)酵時(shí)間42 h。在此最佳條件下，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率理論上可達(dá)82.84%。考慮具體實(shí)驗(yàn)的可操作性，修正最佳條件為：料液比1:12 g/mL、復(fù)合酶添加量0.80%、復(fù)合酶質(zhì)量比2.20:1 g/g、酶解時(shí)間2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌添加量5.80%、混合菌質(zhì)量比2:1 g/g、發(fā)酵時(shí)間42 h，在此條件下，得出實(shí)際的DPPH 自由基清除率為82.17%（RSD=1.19%），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.81%，說(shuō)明該模型準(zhǔn)確度良好。

2.4 青錢柳發(fā)酵粉主要成分分析

按照1.2.2 工藝條件，對(duì)青錢柳葉細(xì)粉未進(jìn)行酶解和發(fā)酵工藝，制備成青錢柳粉對(duì)比樣品，再與青錢柳發(fā)酵粉進(jìn)行主要活性成分比對(duì)，見(jiàn)表7。

表7 青錢柳發(fā)酵粉的主要活性成分分析Table 7 Analysis of main active components of Cyclocarya paliurus fermented powder

由表7 可知，青錢柳葉細(xì)粉經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后，與未經(jīng)處理的青錢柳粉相比，青錢柳發(fā)酵粉中的多糖、總黃酮和總?cè)频瓤寡趸钚晕镔|(zhì)成分含量顯著增加（＜0.05）。在酶解過(guò)程中，青錢柳葉細(xì)粉經(jīng)纖維素酶和半纖維素酶的作用后釋放出多糖等活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，再經(jīng)植物乳桿菌和酵母菌的發(fā)酵后，進(jìn)一步促進(jìn)了功能性活性成分的溶出，同時(shí)一些抗氧化活性物質(zhì)由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，抗氧化活性成分含量增加的同時(shí)，DPPH 自由基清除率也顯著增加（＜0.05）。

3 結(jié)論

以青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)后通過(guò)PB 和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了青錢柳酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝，最終獲得最佳的工藝條件為：料液比1:12 g/mL、復(fù)合酶添加量0.80%、復(fù)合酶質(zhì)量比2.20:1 g/g、酶解時(shí)間2.5 h、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.80%、混合菌質(zhì)量比2:1 g/g、發(fā)酵時(shí)間42 h。在此條件下，青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率為82.17%。

青錢柳葉細(xì)粉經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后，與未處理的青錢柳粉對(duì)比，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率增加了159.9%；青錢柳多糖含量為8.26 g/100 g，增加了194.0%；青錢柳總黃酮含量為9.15%，增加了72.0%；青錢柳總?cè)坪繛?.28%，增加了52.6%?？梢?jiàn)，經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵制備的青錢柳發(fā)酵粉中多糖、總黃酮、總?cè)频瓤寡趸镔|(zhì)顯著增加，為青錢柳的精深加工和高效利用提供新的開發(fā)思路和途徑。