紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中微生物區(qū)系及揮發(fā)性物質(zhì)組成變化分析

何揚(yáng)波，李國(guó)林,，李詠富，羅興邦，羅其琪，石 彬，段召燕，劉 寧

（1.貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州貴陽(yáng) 550006；2.貴州金農(nóng)輻照科技有限公司，貴州貴陽(yáng) 550006；3.貴州金沙冠香坊調(diào)味食品有限公司，貴州畢節(jié) 551800；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030）

紅酸湯是貴州生態(tài)特色食品之一，以番茄、辣椒為主要原料，經(jīng)清洗、粉碎、發(fā)酵、調(diào)配、磨漿等工藝加工而成。在其實(shí)際生產(chǎn)中，辣椒和番茄往往單獨(dú)發(fā)酵，既可保證原料的多元化利用，又能據(jù)實(shí)調(diào)整產(chǎn)品的酸辣比例，確?？诟羞m中，清爽怡人。文化底蘊(yùn)深厚、原料來(lái)源廣泛、制作工藝簡(jiǎn)單、烹飪方式多樣是紅酸湯的產(chǎn)品特色，與魚肉、牛肉、鴨肉等均能搭配出適口佳肴。因此，相較于其他酸食，紅酸湯具有更加廣闊的市場(chǎng)前景和消費(fèi)受眾。

紅酸湯加工工藝以自然發(fā)酵為主，其發(fā)酵過(guò)程與蔬菜發(fā)酵類似，由腸膜明串珠菌（）啟動(dòng)的異型發(fā)酵為開端，而后以短乳桿菌（）及植物乳桿菌（）的同型發(fā)酵為主導(dǎo)，完成產(chǎn)品發(fā)酵的全部工作。然而，由于原料品種和生長(zhǎng)環(huán)境的差異，附著在原料表面的微生物區(qū)系也不盡相同，導(dǎo)致同類發(fā)酵食品的微生物區(qū)系存在區(qū)別，進(jìn)而影響發(fā)酵食品的產(chǎn)品質(zhì)量。傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物區(qū)系較為復(fù)雜，為進(jìn)一步探索紅酸湯中微生物區(qū)系組成，張璇采用經(jīng)典微生物分析方法發(fā)現(xiàn)紅酸湯半成品（發(fā)酵辣椒醬和發(fā)酵番茄醬）中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳桿菌屬（），優(yōu)勢(shì)酵母菌為酵母屬（）、漢遜氏酵母屬（）和酒香酵母屬（），并鑒定出12 種乳酸菌和3 種酵母菌；王琪琪等則依托Illumina MiSeq 技術(shù)得出了辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳桿菌屬（）和片球菌屬（），優(yōu)勢(shì)真菌為、酵母屬（）、雙足囊菌屬（）、畢赤酵母屬（）的結(jié)論；LIN 等也采用Illumina MiSeq 對(duì)西紅柿酸湯和辣椒酸湯的真菌區(qū)系進(jìn)行了分析，得出了畢赤酵母（）為西紅柿酸湯和辣椒酸湯優(yōu)勢(shì)真菌的結(jié)論。但是，紅酸湯自然發(fā)酵是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，僅對(duì)發(fā)酵成熟的樣品進(jìn)行研究不能全面反映其微生物區(qū)系的更替趨勢(shì)。目前，萬(wàn)寧威等已利用宏基因技術(shù)對(duì)以大米為主要原料制作的白酸湯在發(fā)酵過(guò)程微生物的群落組成進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)白酸湯發(fā)酵過(guò)程中的維氏乳桿菌（）、法式醋酸桿菌（）是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，毛榛畢赤酵母（）是優(yōu)勢(shì)真菌，為白酸湯發(fā)酵過(guò)程的精準(zhǔn)調(diào)控提供了技術(shù)支撐。作為更大體量的紅酸湯，運(yùn)用高通量技術(shù)研究其發(fā)酵過(guò)程中的微生物區(qū)系變化趨勢(shì)對(duì)助力貴州酸湯產(chǎn)業(yè)發(fā)展而言則顯得更加迫切。

微生物代謝產(chǎn)生的酸、醇、酮、酯等化合物是發(fā)酵食品的主要風(fēng)味物質(zhì)。研究表明，紅酸湯的呈酸物質(zhì)主要以乳酸為主，含有少量的乙酸、檸檬酸和酒石酸，且有機(jī)酸的含量是衡量其發(fā)酵程度和品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)。在可揮發(fā)性成分方面，醇、酸、酯、酮、醛、烷烴等是紅酸湯原料及產(chǎn)品中主要的化合物。另外，紅酸湯不良風(fēng)味現(xiàn)象也得到了一定關(guān)注，何揚(yáng)波等采用氣相離子遷移譜技術(shù)對(duì)相關(guān)樣品進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)甕臭樣品中丁酸、戊酸、2-甲基丙酸、己醛和苯甲醛等物質(zhì)含量更高，可能是造成產(chǎn)品不良風(fēng)味的主要原因。上述研究雖然對(duì)紅酸湯的風(fēng)味組成進(jìn)行了系列探索，但仍未從發(fā)酵過(guò)程角度對(duì)其組成變化進(jìn)行研究，以至于紅酸湯加工工藝優(yōu)化尚有較多工作可做?；诖?，本研究采用Illumina MiSeq測(cè)序、總酸滴定和氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中的微生物區(qū)系、酸度及揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行研究，以期為貴州紅酸湯加工發(fā)展提供更多技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵西紅柿、紅辣椒 實(shí)驗(yàn)室自制；E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit 美國(guó)Omega Bio-Tek 公司；Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Life Technologies公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒 愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；2×Hieff? Robust PCR Master Mix，Hieff NGS? DNA Selection Beads 上海翊圣生物科技有限公司；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉 成都金山化學(xué)試劑有限公司。SC-Z2 型仿手工剁菜機(jī) 清鎮(zhèn)市順成機(jī)械廠；12 L 恒溫發(fā)酵罐 宜仟家釀酒設(shè)備有限公司；GL-88B 型漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H 型混勻型干式恒溫器 深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀電源、DYCZ-21 型電泳槽 北京市六一儀器廠；FR-1000 型凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；Q32866 型Qubit?3.0 熒光計(jì) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；ETC 811 型PCR 儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；MiSeq 測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina 公司；PHSJ-4F 型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；JJ323BC 型電子天平常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；Agilent 6890N 型氣相色譜聯(lián)用5975B 型質(zhì)譜儀，DB-5 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）美國(guó)安捷倫公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；固相微萃取支架（手動(dòng)）及萃取頭（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS）美國(guó)Supelco 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅辣椒、西紅柿發(fā)酵工藝 挑選無(wú)明顯劃傷或瘢痕的西紅柿、紅辣椒，摘除柄蒂，清洗干凈后經(jīng)剁菜機(jī)剁碎，分別向西紅柿、紅辣椒中加入4.0%和8.0%食鹽，攪拌均勻后于25～30 ℃環(huán)境中厭氧發(fā)酵。發(fā)酵后第1、7、14、21、28、42、57、72 和87 d采集發(fā)酵紅辣椒（FP）、西紅柿（FT）樣品用于微生物區(qū)系、酸度及風(fēng)味組分分析測(cè)試，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集3 個(gè)平行樣品，分別命名為FP nd1、FP nd2、FP nd3 或FT nd1、FT nd2、FT nd3，n 為采樣天數(shù)，總發(fā)酵時(shí)間為87 d。

1.2.2 微生物的16S/ITS 測(cè)序 紅酸湯DNA 提取、PCR 擴(kuò)增參考HE 等研究方法并作適當(dāng)變化。簡(jiǎn)述如下：取100 g 發(fā)酵樣品在4000 r/min 條件下離心5 min 后濾去上清液取沉淀，采用OMEGA 試劑盒E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit，參照其說(shuō)明書步驟對(duì)紅酸湯樣品中微生物的DNA 進(jìn)行提取。提取到的DNA 樣本送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序和分析。其中，PCR 擴(kuò)增分兩輪完成，第一輪擴(kuò)增：利用Qubit3.0 dsDNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA 精確定量后，以確定PCR 反應(yīng)應(yīng)加入的DNA 量。PCR 所用引物已經(jīng)融合了測(cè)序平臺(tái)的部分接頭序列，目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rRNA 基因V3～V4 和ITS1-ITS2 區(qū)。其中，16S rRNA 基因V3～V4區(qū)擴(kuò)增引物為341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）；ITS 區(qū)引物為ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）。經(jīng)過(guò)兩輪擴(kuò)增后得到的PCR 產(chǎn)物即為測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度符合預(yù)期。然后采用Agencourt AMPure XP 磁珠對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行回收。用Qubit3.0 dsDNA 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)定量，最后按照等摩爾比例混合各個(gè)文庫(kù)。文庫(kù)采用Illumina MiSeq?平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序模式為雙末端各300 bp。

1.2.3 總酸及pH 分析 原料及發(fā)酵過(guò)程中酸湯樣品的總酸采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定中的酸堿指示劑滴定法進(jìn)行測(cè)定，pH 采用酸度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 揮發(fā)性成分測(cè)定 原料及發(fā)酵過(guò)程中酸湯樣品的揮發(fā)性成分分析參考XIE 等方法并做細(xì)微調(diào)整。具體步驟如下：稱取2.0 g 待測(cè)樣品于頂空瓶中，壓蓋，置于80 ℃水浴中平衡20 min。向頂空瓶中插入固相微萃取針，80 ℃水浴中20 min，上機(jī)解析5 min 后進(jìn)行分析。

色譜條件：頂空不分流進(jìn)樣，載氣為氦氣，流速為1 mL/min。程序升溫按如下參數(shù)進(jìn)行：60 ℃保持3 min，以3.5 ℃/min 升溫至100 ℃保持5 min，再以8 ℃/min 升溫至200 ℃保持5 min，最后再以15 ℃/min 升溫至280 ℃保持15 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量為70 eV，掃描方式為全掃，質(zhì)量范圍為40～650 amu，接口溫度為250 ℃，離子源溫為230 ℃，四級(jí)桿溫度為200 ℃。

定量定性分析：氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜數(shù)據(jù)借助NIST 05 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析比對(duì)，各取匹配度高于70%的前3 種組分，結(jié)合文獻(xiàn)分析進(jìn)行鑒定；各組分定量采用面積百分比法求取相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Illumina MiSeq?平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序結(jié)果采用SMRT Link（版本號(hào)10.0）、PRINSEQ（版本號(hào)0.20.4）、R 軟件（版本號(hào)3.6.0）、R 軟件安裝包dada2（版本號(hào)1.14.0）、R 軟件安裝包Vegan（版本號(hào)2.5-6）、RDP classitifier（版本號(hào)2.12）、Mothur（1.43.0）等軟件或數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理及多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物區(qū)系分析

為進(jìn)一步理清紅酸湯發(fā)酵過(guò)程中的微生物區(qū)系變化，采用Illumina MiSeq 三代測(cè)序技術(shù)，通過(guò)-多樣性，-多樣性及相對(duì)豐度等內(nèi)容對(duì)辣椒紅酸湯和西紅柿酸湯的微生物區(qū)系動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

2.1.1 辣椒酸湯微生物區(qū)系分析 發(fā)酵14～72 d 期間，辣椒酸湯的Shannon 指數(shù)均高于西紅柿酸湯，表明在這段時(shí)間內(nèi)發(fā)酵紅辣椒的微生物群落多樣性更高，詳見表1。-多樣性分析則以PCoA 主坐標(biāo)分析圖為主，樣品間距離越近，則表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。比較可知：紅辣椒在發(fā)酵1 d 及7 d 的細(xì)菌物種組成高度重合，除42 d 外，從14 d 開始，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所獲樣品的細(xì)菌物種組成均差異顯著；辣椒酸湯的真菌物種組成則呈現(xiàn)3 個(gè)較為明顯的階段特征，分別為1～14 d，21～57 d，72～87 d，詳見圖1。辣椒酸湯原料中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為，相對(duì)豐度為78.92%，含有少量的泛菌（，5.15%），假單胞桿菌（，0.42%），腸膜明串珠菌（，0.29%）和果膠桿菌（，0.30%）。隨著發(fā)酵啟動(dòng)，納木雷氏乳桿菌（）出現(xiàn)，逐漸演變?yōu)榘l(fā)酵體系中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌并參與其21～87 d 的全過(guò)程發(fā)酵，相對(duì)豐度最高時(shí)達(dá)到27.67%，詳見圖2a。辣椒酸湯原料中含有真菌共計(jì)17 種，在發(fā)酵中期，璞膜畢赤酵母（）、德巴利酵母（）和孢漢遜氏酵母（）為發(fā)酵體系中的優(yōu)勢(shì)真菌，相對(duì)豐對(duì)和為95.88%（42 d）。發(fā)酵后期，璞膜畢赤酵母（）和孢漢遜氏酵母（）含量急劇減少，漢遜德巴利酵母（）成為優(yōu)勢(shì)真菌，相對(duì)豐度達(dá)76.05%（87 d），詳見圖2b。

圖1 辣椒紅酸湯中微生物區(qū)系主坐標(biāo)分析圖Fig.1 PCoA of microflora in pepper sour soup

圖2 辣椒酸湯發(fā)酵過(guò)程中微生物區(qū)系豐度變化圖Fig.2 Variation of microflora abundance of pepper sour soup during fermentation

表1 發(fā)酵紅辣椒及西紅柿樣品中微生物群落豐富度及α-多樣性分析Table 1 Microbial community richness and α-diversity analysis in fermented red pepper and tomato samples

2.1.2 西紅柿酸湯微生物區(qū)系分析 發(fā)酵過(guò)程中，西紅柿酸湯微生物區(qū)系變化的規(guī)律性較強(qiáng)。具體而言，細(xì)菌、真菌的種類組成在7 d 內(nèi)基本沒有變化，從14 d開始，樣品中的微生物組成隨發(fā)酵時(shí)間推移而表現(xiàn)出連續(xù)性的變化趨勢(shì)，詳見圖3。相對(duì)豐度是對(duì)樣品中微生物-多樣性及-多樣性分析的直觀補(bǔ)充。與辣椒酸湯類似，西紅柿酸湯原料中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌依然為（55.77%），同時(shí)含有泛菌（，15.74%），成團(tuán)泛菌（，1.30%）和稻皮假單胞菌（，0.88%）。結(jié)果顯示，戊糖乳桿菌（）是番茄酸湯發(fā)酵的主要功能微生物。發(fā)酵早期（7 d），戊糖乳桿菌的相對(duì)豐度為0.36%。隨著發(fā)酵周期延長(zhǎng)，其相對(duì)豐度不斷增加，達(dá)到了41.75%（21 d）。另外，在發(fā)酵中期及后期，短乳桿菌（）、植物乳桿菌（）、耐酸乳桿菌（）、棒狀乳桿菌（）、面包乳桿菌（）及也參與了番茄酸湯的乳酸發(fā)酵。除了細(xì)菌外，真菌也是番茄酸湯發(fā)酵過(guò)程的重要參與者。在番茄中，共檢測(cè)到漢遜德巴利酵母（）、璞膜畢赤酵母（）、、等真菌共計(jì)22 種。雖然漢遜德巴利酵母和璞膜畢赤酵母均為辣椒酸湯和番茄酸湯中的優(yōu)勢(shì)真菌，但它們?cè)趦煞N酸湯發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)截然不同，從21 d 開始，番茄酸湯中的璞膜畢赤酵母相對(duì)豐度不斷增加并成為其絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌，相對(duì)豐度最高可達(dá)80.88%（72 d），具體詳見圖4。

圖3 西紅柿酸湯中微生物區(qū)系主坐標(biāo)分析圖Fig.3 PCoA of microflora in tomatoes sour soup

圖4 西紅柿酸湯發(fā)酵過(guò)程中微生物區(qū)系豐度變化圖Fig.4 Variation of microflora abundance of tomatoes sour soup during fermentation

2.2 發(fā)酵酸度分析

從微生物區(qū)系動(dòng)態(tài)分析結(jié)果及部分文獻(xiàn)可知，乳酸菌是紅酸湯發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)功能微生物，其代謝產(chǎn)物乳酸是紅酸湯的主要呈味物質(zhì)之一。以pH及總酸作為考核指標(biāo)，可對(duì)酸湯發(fā)酵酸度的變化趨勢(shì)進(jìn)行綜合研判。

2.2.1 辣椒酸湯酸度變化 隨著發(fā)酵期的變化，辣椒酸湯的pH 和總酸含量呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。其中，pH 在第21 d 時(shí)下降至最低值3.57，保持一周后呈現(xiàn)緩慢回升趨勢(shì)，直至第87 d 變成了3.80?？偹幔ㄒ匀樗嵊?jì)）則在28～42 d 期間達(dá)到最高峰42.87 g/kg 并保持穩(wěn)定直至72 d 后出現(xiàn)一定程度的減少，具體見圖5。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中辣椒酸湯pH 及總酸的變化Fig.5 The trend of pH and total acid in pepper sour soup during fermentation

2.2.2 西紅柿酸湯發(fā)酵酸度變化 在西紅柿酸湯里，pH 和總酸含量在第21 d 時(shí)分別達(dá)到最低值3.25 和最高值47.52 g/kg，相較于辣椒酸湯，西紅柿酸湯擁有更高的酸度。但是，與辣椒酸湯的酸度變化趨勢(shì)不同，西紅柿酸湯在發(fā)酵后28～57 d 期間，總酸含量表現(xiàn)出明顯減少的趨勢(shì)，在57 d 后趨于穩(wěn)定，處于33.43～33.52 g/kg 水平，具體詳見圖6。

圖6 西紅柿酸湯發(fā)酵過(guò)程中pH 及總酸變化趨勢(shì)圖Fig.6 The trend of pH and total acid in tomato sour soup during fermentation

2.3 酸湯發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性物質(zhì)變化

結(jié)合微生物區(qū)系的組成變化，分別采集發(fā)酵初期（1 d）、中期（28 d）和后期（87 d）樣品并分析其揮發(fā)性物質(zhì)的組成和相對(duì)含量，以便于了解酸湯發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味變化。

2.3.1 辣椒酸湯揮發(fā)性物質(zhì)的變化 辣椒酸湯的揮發(fā)性物質(zhì)主要包括醇類、酮類、醛類、酯類、酸類、烯萜類、醚類、烷烴類及其他成分共計(jì)156 種，但不同發(fā)酵階段其具體種類差異較大，僅有乙醇、芳樟醇、-松油醇、大馬士酮和a,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-乙醛等化合物在發(fā)酵初期、中期和后期樣品中被連續(xù)檢測(cè)到，其他成分則因發(fā)酵期差異而各有不同。從揮發(fā)性物質(zhì)的組成來(lái)看，早期辣椒酸湯中酯類、萜烯類、酮類化合物含量較高，分別占總揮發(fā)物總量的24.99%、20.21%和17.60%。其中，十六酸乙酯（8.43%）、g-雪松烯（11.89%）、大馬士酮（11.60%）分別是3 類物質(zhì)中含量最高的化合物。發(fā)酵后期，辣椒酸湯中醇類物質(zhì)含量由初期的12.32%增加到34.75%，主要醇類物質(zhì)為芳樟醇（10.43%）、-松油醇（7.68%）、苯乙醇（6.44%）和乙醇（4.03%），除乙醇是穩(wěn)步增加外，其他醇類物質(zhì)在發(fā)酵中期及末期均發(fā)生了較大變化；酮類、醛類、萜烯類化合物相對(duì)含量分別下降至5.68%、4.78%和1.49%，2-乙基環(huán)丁酮（2.04%）、a,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-乙醛（2.99%）和2-蒈烯（0.88%）為辣椒酸湯發(fā)酵末期含量最高的酮、醛及萜烯類的代表物質(zhì)。另外，在發(fā)酵末期檢出的酯類和酸類化合物較發(fā)酵初期種類少，但整體含量有所提升，分別由24.99%、3.44%增加至34.41%和5.43%，具體詳見表2。

表2 不同發(fā)酵期辣椒酸湯揮發(fā)性化合物種類及相對(duì)含量Table 2 The types and contents of flavor substances in pepper sour soup at different fermentation stages

續(xù)表 2

續(xù)表 2

續(xù)表 2

2.3.2 西紅柿酸湯揮發(fā)性物質(zhì)的變化趨勢(shì) 西紅柿酸湯中檢出揮發(fā)性物質(zhì)共計(jì)92 種（表3），與辣椒酸湯不同，整個(gè)發(fā)酵期未檢出醚類和酯類化合物，但在發(fā)酵中期和后期出現(xiàn)了2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、2,4-二叔丁基苯酚、愈創(chuàng)木酚等多種酚類化合物。醛類和酮類化合物是西紅柿酸湯早期的主要成分，分別占揮發(fā)物總量的41.30%和20.28%，含量最高的醛、酮化合物分別為青葉醛（29.75%）和6-甲基庚烯酮（10.21%）。隨著發(fā)酵周期變化，醇類、酚類、酸類和烷烴類化合物相對(duì)含量分別增加至54.24%、11.88%、6.64%和3.36%。與辣椒酸湯不同，西紅柿酸湯中的主要醇類化合物為苯乙醇（31.93%）、乙醇（8.83%）和異戊醇（5.28%），酚類化合物為4-乙基苯酚（8.71%）。酮類、醛類化合物的種類及相對(duì)含量呈現(xiàn)出劇烈減少趨勢(shì)，發(fā)酵后期分別為1.28%、3.72%，但酮類化合物仍以6-甲基庚烯酮為主，醛類物質(zhì)則以2,4-二甲基苯甲醛為代表。酸類化合物則隨發(fā)酵時(shí)間變化呈現(xiàn)出多元化趨勢(shì)，辛酸、trans-3-己烯酸、月桂酸等均在87 d 樣品中被檢測(cè)到。其他化合物中，2-異丁基噻唑含量最高（2.04%），直到發(fā)酵中期其含量均較為穩(wěn)定。

表3 不同發(fā)酵期西紅柿酸湯揮發(fā)性化合物種類及相對(duì)含量Table 3 The types and contents of flavor substances in tomato sour soup at different fermentation stages

續(xù)表 3

續(xù)表 3

3 討論與結(jié)論

從原料開始，本研究對(duì)酸湯加工過(guò)程進(jìn)行了周期為87 d 的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分析了紅酸湯半成品（辣椒酸湯、西紅柿酸湯）的微生物區(qū)系、酸度及揮發(fā)性物質(zhì)組成變化。酸湯原料中優(yōu)勢(shì)微生物為，該細(xì)菌是Lamprinou 等從希臘及西班牙洞穴中于2011 年發(fā)現(xiàn)的新種，在微生物分類學(xué)上屬藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria），極大概率是由辣椒植株由產(chǎn)地土壤中富集而來(lái)。作為極端條件下的先鋒物種，在破碎紅辣椒及西紅柿的豐富營(yíng)養(yǎng)條件下，豐度在早期的發(fā)酵鹽水中得到了一定程度增長(zhǎng)，而后隨著發(fā)酵環(huán)境中酸度增加、微生物區(qū)系多元增殖而得到抑制，但依然以15.98%～38.65%的相對(duì)豐度存在，這需要在后續(xù)研究中對(duì)其微生物安全性加以關(guān)注。辣椒酸湯和西紅柿酸湯分別以納木雷氏乳桿菌（）和戊糖乳桿菌（）、短乳桿菌（）為優(yōu)勢(shì)乳酸菌，與王琪琪等報(bào)道的耐酸乳酸菌（）和有所不同，這可能與樣品加工環(huán)境、溫度及原料表面附帶的微生物和發(fā)酵體系中的內(nèi)生菌有關(guān)。漢遜德巴利酵母（）和膜璞畢赤酵母（）為原料發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)真菌，且在辣椒和西紅柿中相對(duì)豐度正好相反，這與王琪琪及Lin 等的研究結(jié)果在種類及相對(duì)豐度上均有一定差異，進(jìn)一步證明了環(huán)境條件、原料狀況對(duì)紅酸湯發(fā)酵的直接影響。因此，雖然Carl 等提出了蔬菜發(fā)酵是由腸膜明串珠菌啟動(dòng)，經(jīng)片球菌、短乳桿菌、植物乳桿菌的分階段混合發(fā)酵的結(jié)果，但針對(duì)不同的原料、環(huán)境和加工工藝，加強(qiáng)紅酸湯功能微生物的動(dòng)態(tài)研究依然具有重要意義。

紅酸湯中，以乳酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸為代表的有機(jī)酸既具有抗氧化活性，又是產(chǎn)品發(fā)酵的成熟指標(biāo)之一。本研究中，辣椒和西紅柿酸湯的總酸和pH 在第21 d 時(shí)達(dá)到峰值，明顯晚于與韋明明和鄭莎莎等報(bào)道的酸湯pH 及總酸峰值出現(xiàn)時(shí)間，這主要是因?yàn)楸狙芯克釡谱鞴に囃耆捎米匀话l(fā)酵，未加入老湯“引子”和外接發(fā)酵劑的緣故。pH 和總酸變化趨勢(shì)呈現(xiàn)差異的原因主要在于pH 是指氫離子的實(shí)際濃度而總酸表示可滴定型酸的存在狀態(tài)，兩者會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)品中乳酸和檸檬酸等有機(jī)酸的強(qiáng)弱及含量情況而導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果存在偏差。在發(fā)酵前14 d，酸湯樣品的pH 和總酸變化極快，但微生物結(jié)果顯示此階段內(nèi)乳酸菌的數(shù)量及種類較少，故而紅酸湯發(fā)酵初期微生物活動(dòng)及其產(chǎn)酸機(jī)制有待深入研究。

市售紅酸湯為辣椒酸湯和西紅柿酸湯發(fā)酵成熟后按比例調(diào)配得到的酸辣調(diào)味料。因此，掌握辣椒和西紅柿酸湯在發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性物質(zhì)變化對(duì)研究紅酸湯的風(fēng)味組成具有重要意義。辣椒酸湯中，醇類、酮類、醛類、酯類化合物為主要風(fēng)味貢獻(xiàn)物，這與其他研究人員的結(jié)果較為一致。稍有區(qū)別的是風(fēng)味物質(zhì)的具體種類與對(duì)照文獻(xiàn)相比存在較大區(qū)別，另外在發(fā)酵初期的辣椒酸湯中檢出了較多萜烯類化合物，以雪松烯為主，這可能與使用的辣椒品種差異有關(guān)。發(fā)酵中、后期，醇類與酯類化合物含量變化趨勢(shì)相反，這可能是厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸與醇作用生成酯的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醛、酮、酯是西紅柿酸湯中的主要風(fēng)味物質(zhì)且青葉醛和己醛相對(duì)含量達(dá)到了29.75%和3.50%，這與其他人報(bào)道青葉醛、己醛等9 類物質(zhì)是西紅柿中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)相互應(yīng)證。發(fā)酵后期，西紅柿酸湯中出現(xiàn)大量的醇類和酚類物質(zhì)，這可能與真菌中畢赤酵母和德巴利酵母的活動(dòng)有關(guān)，具體相關(guān)性需采取更多措施予以探究。

綜上所述，紅酸湯發(fā)酵過(guò)程以乳酸菌和酵母菌為優(yōu)勢(shì)微生物。其中，納木雷氏乳桿菌（）和戊糖乳桿菌（）分別為辣椒酸湯和西紅柿酸湯的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，相對(duì)豐度最高時(shí)達(dá)到27.67%（57 d）和41.75%（21 d）；漢遜德巴利酵母（）和膜璞畢赤酵母（）為兩種酸湯的優(yōu)勢(shì)酵母菌，其變化趨勢(shì)隨發(fā)酵期變化各不相同。在發(fā)酵后期，辣椒酸湯以漢遜德巴利酵母為主，相對(duì)豐度為76.05%（87 d）；西紅柿酸湯則以膜璞畢赤酵母為優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度可達(dá)80.88%（72 d）。本文對(duì)辣椒和西紅柿酸湯的總酸及pH 變化情況進(jìn)行了跟蹤分析，兩種酸湯的總酸和pH 均于21～28 d 期間達(dá)到或接近極值（總酸：辣椒酸湯42.87 g/kg，西紅柿酸湯47.52 g/kg；pH：辣椒酸湯3.57，西紅柿酸湯3.25），與乳酸菌優(yōu)勢(shì)菌群形成的時(shí)間保持一致。在揮發(fā)性物質(zhì)組成方面，辣椒和西紅柿酸湯中分別檢測(cè)到醇、酮、醛、酯等各類化合物157 和92 種。酯類、萜烯類、酮類化合物是早期辣椒酸湯中含量較高幾類化合物，分別占總揮發(fā)物總量的24.99%、20.21%和17.60%；西紅柿酸湯在發(fā)酵初期的主要揮發(fā)性物質(zhì)為醛類（41.30%）、酮類（20.28%）化合物。隨著發(fā)酵期的變化，辣椒酸湯的主要風(fēng)味物質(zhì)為醇類、酯類化合物，以芳樟醇（10.43%）、-松油醇（7.68%）和十六酸乙酯（12.12%）及乙酸乙酯（4.63%）等為代表；西紅柿酸湯中則以醇類和酚類為優(yōu)勢(shì)，其中，苯乙醇（31.93%）、4-乙基苯酚（8.71%）為西紅柿酸湯風(fēng)味貢獻(xiàn)了重要作用。通過(guò)對(duì)辣椒、西紅柿酸湯發(fā)酵過(guò)程中的微生物區(qū)系、酸度及揮發(fā)性成分進(jìn)行上述研究，可以為酸湯直投式發(fā)酵劑的研制提供優(yōu)勢(shì)菌株參考，為進(jìn)一步優(yōu)化紅酸湯加工工藝奠定理論基礎(chǔ)。