組織GLUD1表達(dá)與乳腺癌分子分型及臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

劉昊靈，吳玉丹，李貝貝，趙 玥，王 怡，桂憶南

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八七醫(yī)院 病理科，陜西 寶雞721004)

代謝失調(diào)是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要步驟，而谷氨酰胺分解被證明是一種必不可少的代謝途徑。腫瘤細(xì)胞通過(guò)代謝重編程，進(jìn)而最有效地為自身增殖和生存提供所需的能量，這就使得它們高度依賴于谷氨酰胺的代謝過(guò)程[1]。乳腺癌屬于高度異質(zhì)性腫瘤，不同分子亞型的代謝失調(diào)水平可能存在很大的差異，因此，觀察不同分子亞型乳腺癌的腫瘤代謝特征差異可以進(jìn)一步指導(dǎo)或預(yù)測(cè)治療結(jié)局，并為治療方法提供新的靶點(diǎn)[2]。谷氨酸脫氫酶(GLUD)是谷氨酰胺分解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，包括2種同工酶，即GLUD1和GLUD2，其中GLUD1不僅是維持三羧酸循環(huán)(TAC)的關(guān)鍵酶，而且還在雷帕霉素復(fù)合物靶蛋白1(mTORC1)的激活和氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[3]。本研究旨在確定乳腺癌組織中GLUD1 mRNA和蛋白在不同分子亞型中的生物學(xué)和臨床特征相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年3月—2017年10月期間在聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八七醫(yī)院接受乳腺癌手術(shù)的145例患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析，入選患者年齡19.0-87.0歲，平均年齡為(51.34±15.44)歲。所有患者均根據(jù)世界衛(wèi)生組織2012年病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]確診為原發(fā)型單側(cè)乳腺癌且病例臨床資料完整，入院前未接受過(guò)任何治療。排除以下條件的患者：(1)男性乳腺癌患者；(2)妊娠或哺乳期患者；(3)合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤者。術(shù)中收集的新鮮組織標(biāo)本即刻置于液氮中凍存24 h，隨后保存在-70℃直至分析。另外部分組織用4%甲醛溶液固定，制備石蠟包埋蠟塊，用作病理組織檢查或免疫組織化學(xué)(IHC)染色。醫(yī)療記錄和病理報(bào)告用來(lái)檢索關(guān)于腫瘤直徑、位置、腋窩淋巴結(jié)受累等信息，并進(jìn)行全面的病理學(xué)評(píng)估，包括侵襲性、組織類型、分級(jí)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)、Ki67表達(dá)狀態(tài)等。ER和PR核染色率>10%則視為陽(yáng)性。HER2陽(yáng)性結(jié)果定義為HER2/CEP17熒光原位雜交比≥2.0和(或)IHC得分3+。根據(jù)2013年St.Gallen會(huì)議[5]通過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型，根據(jù)ER、PR、HER2狀態(tài)和Ki-67陽(yáng)性率，乳腺癌患者分為4種分子亞型：Luminal A型、Luminal B型、HER2過(guò)表達(dá)型、三陰性。本研究經(jīng)由本院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言。所有參與者均簽署書面的知情同意書。

1.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

使用R 2.15.3軟件，利用Epicalc函數(shù)包從美國(guó)公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA)下載并處理乳腺癌基因組和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，對(duì)1 085例乳腺癌樣本中的GLUD1基因表達(dá)進(jìn)行評(píng)估，并且進(jìn)一步分析了GLUD1基因與ER、PR、HER2受體表達(dá)狀態(tài)的關(guān)系。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)法檢測(cè)組織GLUD1 mRNA表達(dá)

將-80℃環(huán)境中的乳腺癌組織及癌旁組織樣本根據(jù)制造商說(shuō)明，使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))提取組織總RNA，通過(guò)納米滴吸收光度法檢測(cè)以確定RNA質(zhì)量，后續(xù)反應(yīng)僅使用A260/280>2.0的RNA片段。經(jīng)miScript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen公司，德國(guó))逆轉(zhuǎn)錄后，使用ABI-prism 7700系統(tǒng)(PE Applied Biosystems,美國(guó))進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，所有樣品50℃孵育2 min，95℃孵育10 min，擴(kuò)增條件為95℃15 s，60℃退火延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。之后使用Sequence DetectorTM軟件(PE Applied Biosystems,美國(guó))根據(jù)閾值周期數(shù)(threshold cycle number，CT)檢測(cè)熒光信號(hào)，以2-ΔΔCT法計(jì)算結(jié)果。線蟲miR-39作為組織表達(dá)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化控制，所有反應(yīng)均平行進(jìn)行三次。GLUD1 mRNA引物序列：上游引物5’-GGG GTA GAG CTG CTT CAC TTT-3’，下游引物5’-AGC CCC GAG GTT GTT GTT TT-3’。

1.4 IHC染色法檢測(cè)組織GLUD1蛋白表達(dá)

用福爾馬林固定BC組織及鄰近正常組織，石蠟包埋。切片用二甲苯脫蠟，不同濃度的乙醇和ddH2O進(jìn)行再水化。然后用3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，并將切片與GUD1一級(jí)抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。在室溫下加入二級(jí)抗體培養(yǎng)1 h，用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物檢測(cè)組織標(biāo)本。每例標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野的著色情況。使用修正的組織化學(xué)評(píng)分法(H-score)對(duì)IHC染色結(jié)果進(jìn)行判斷，在染色強(qiáng)度方面，采用0、1、2、3分別對(duì)應(yīng)于陰性、弱、中、強(qiáng)染色，并主觀估計(jì)各分值的百分比，另外陽(yáng)性染色比計(jì)分為：0分為無(wú)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞；1分為<10%，2分為11%-30%，3分為31%-70%，4分為70%以上。最終計(jì)算強(qiáng)度和百分比得分的乘積，免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS)是兩個(gè)參數(shù)的乘積。使用這種評(píng)估方法，通過(guò)測(cè)定IRS來(lái)評(píng)估GDH表達(dá)，評(píng)分為0、1、2、3、4、6、8、9或12。樣本分為以下兩組：低(IRS)組為0-4分，高(IRS)組為≥6分(免疫反應(yīng)評(píng)分為0、1、2、3、4、6、8、9或12分，≥6分為高表達(dá)，1-4分為低表達(dá)，0分為陰性表達(dá))。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘GLUD1在乳腺癌組織中的表達(dá)情況乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達(dá)量顯著低于正常乳腺組織中的表達(dá)量(P<0.05)；在1 085例乳腺癌組織中，14例(1.29%)表現(xiàn)為復(fù)制數(shù)增加，但是有32例(2.95%)表現(xiàn)為復(fù)制數(shù)減少。另外，756例ER+組乳腺癌組織中，GLUD1 mRNA表達(dá)量顯著高于228例ER-組組織中的表達(dá)量(P<0.05)；656例PR+組乳腺癌組織中，GLUD1 mRNA表達(dá)量顯著高于325例PR-組組織中的表達(dá)量(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析GLUD1 mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)情況

2.2 乳腺癌患者不同組織中GLUD1 mRNA以及GLUD1蛋白表達(dá)比較經(jīng)QPCR法檢測(cè)，乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達(dá)量顯著低于癌旁乳腺組織(1.00±0.17 vs.0.63±0.27，P<0.05)。同時(shí)經(jīng)IHC染色法檢測(cè)，GLUD1蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿中，腫瘤組織中GLUD1蛋白高表達(dá)率顯著低于癌旁乳腺組織[28.28%(41/145)vs.53.79%(78/145)，P<0.05，圖2]。另外GLUD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組織中GLUD1 mRNA表達(dá)量高于陰性表達(dá)組織(P<0.05)，經(jīng)Pearson法分析，GLUD1蛋白表達(dá)與GLUD1 mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為0.735，P<0.001)。

圖2 乳腺癌組織中GLUD1蛋白的表達(dá)

2.3 乳腺癌患者組織GLUD1蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系經(jīng)單因素分析，乳腺癌組織GLUD1蛋白表達(dá)與臨床T分期、N分期、腫瘤分級(jí)、ER和PR表達(dá)狀態(tài)有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌患者組織GLUD1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 不同分子分型患者組織GLUD1 mRNA和GLUD1蛋白表達(dá)比較比較不同分子亞型中GLUD1 mRNA和GLUD1蛋白表達(dá)水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)在Luminal A型及Luminal B型中GLUD1 mRNA和蛋白表達(dá)較其他分子分型高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同分子分型患者組織GLUD1 mRNA和GLUD1蛋白表達(dá)分析

3 討論

目前臨床對(duì)乳腺癌異質(zhì)性的研究逐漸深入，異質(zhì)性與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、腫瘤微環(huán)境均密切相關(guān)，谷氨酰胺分解被證明是維持細(xì)胞增殖和存活的一種必需代謝途徑[6]。在乳腺癌中，不同分子亞型之間存在一定的代謝差異性，本研究發(fā)現(xiàn)GLUD1在mRNA和蛋白水平上表達(dá)量均下調(diào)，尤其是在高分級(jí)(Ⅲ級(jí))和三陰性或HER2過(guò)表達(dá)型乳腺癌的腫瘤組織中。

根據(jù)最新報(bào)告的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2019年新增乳腺癌病例約占全部癌癥病例的30%左右，根據(jù)受體(ER、PR、HER2)表達(dá)狀態(tài)，高達(dá)70% 的乳腺癌被歸類為ER陽(yáng)性，這意味著雌激素在乳腺癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[7]。因此，ER信號(hào)傳導(dǎo)通路成為大多數(shù)乳腺癌患者開發(fā)新療法的潛在靶點(diǎn)。例如Wang等學(xué)者[8]通過(guò)整合TCGA和Metabric公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息確定了部分與ER+相關(guān)的氨基酸代謝限速酶，證實(shí)ER+乳腺癌的預(yù)后與氨基酸代謝的限速基因及其下游網(wǎng)絡(luò)之間存在密切聯(lián)系，例如氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性增加、?；撬岷痛闻；撬?、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝途徑失調(diào)等。因此氨基酸代謝譜的差異能夠區(qū)分ER+和ER-性乳腺癌。關(guān)于GLUD1對(duì)谷氨酰胺代謝潛在影響的研究仍然有限。因此，本研究首先基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)信息，利用大量乳腺腫瘤的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平研究了GLUD1，以便更好地了解GLUD1在乳腺癌及其分子亞型中的潛在作用。結(jié)果顯示乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達(dá)量顯著低于正常乳腺組織；在1085例乳腺癌組織中，14例(1.29%)表現(xiàn)為復(fù)制數(shù)增加，但是有32例(2.95%)表現(xiàn)為復(fù)制數(shù)減少。另外，ER+組乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達(dá)量顯著高于ER-組組織中的表達(dá)量，同樣PR+組乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達(dá)量顯著高于PR-組組織中的表達(dá)量(P<0.05)，本研究結(jié)果與其基本一致。本研究中發(fā)現(xiàn)在Luminal A型及Luminal B型中GLUD1 mRNA和GLUD1蛋白表達(dá)量較其他分子分型較高，說(shuō)明檢測(cè)GLUD1表達(dá)可以有助于區(qū)分不同分子亞型的乳腺癌組織，但本研究中并未追蹤患者的治療效果，不能證明GLUD1表達(dá)是否與患者預(yù)后或治療反應(yīng)有關(guān)，這也是本研究的局限性之一。

腫瘤細(xì)胞具有無(wú)限分裂和持續(xù)生長(zhǎng)的潛力。這個(gè)過(guò)程依賴于從饑餓和缺氧的微環(huán)境中獲取必需的營(yíng)養(yǎng)成分。腫瘤細(xì)胞的代謝修正能力取決于它們?cè)谀[瘤微環(huán)境中通過(guò)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和細(xì)胞間相互作用改變合成和分解代謝途徑的能力。氨基酸是蛋白質(zhì)合成能量和代謝物的來(lái)源，氨基酸降解酶的過(guò)度表達(dá)已經(jīng)在許多癌癥中被檢測(cè)到[9]。例如Spinelli等學(xué)者[10]認(rèn)為GLUD催化的氨同化作用會(huì)刺激乳腺癌細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，同時(shí)癌細(xì)胞主要通過(guò)GLUD催化的還原胺化作用吸收氨，其次反應(yīng)可以使其他氨基酸直接獲取氮，為乳腺癌新陳代謝提供氮源。降解的氨基酸為細(xì)胞能量和合成代謝過(guò)程提供代謝產(chǎn)物，也是癌細(xì)胞免疫逃避的調(diào)節(jié)劑。在腫瘤微環(huán)境中，吲哚胺-2,3-雙加氧酶和精氨酸酶的高表達(dá)分別導(dǎo)致色氨酸和精氨酸的缺失。降低色氨酸和精氨酸水平抑制腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖[11]。乳腺癌細(xì)胞通過(guò)使用氨基酸降解酶作為免疫抑制因子來(lái)提高其生存能力。其中一些氨基酸相關(guān)基因編碼與代謝病相關(guān)的限速酶。在本研究中，乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達(dá)量與GLUD1蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)性，說(shuō)明GLUD1蛋白的表達(dá)受到GLUD1 mRNA的調(diào)控。而GLUD1在蛋白水平上參與乳腺癌細(xì)胞的惡性化進(jìn)展并不令人驚訝。GLUD1是谷氨酰胺分解第二脫氨基階段的關(guān)鍵酶，它被亮氨酸激活，使谷氨酸脫氨到α-酮戊二酸，然后并入TCA循環(huán)，這是增殖細(xì)胞中的一個(gè)關(guān)鍵的過(guò)程[12]。亮氨酸可激活mTORC1，該蛋白在腫瘤細(xì)胞中具有多種功能，包括調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、防止細(xì)胞凋亡和腫瘤細(xì)胞增殖[13]。一些研究也已經(jīng)證實(shí)了谷氨酰胺分解在mTOR信號(hào)通路中的重要性，當(dāng)mTORC1被過(guò)度激活時(shí)，它被認(rèn)為在促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖方面有重要作用。mTORC1是兩種多蛋白復(fù)合物之一，受多種上行信號(hào)調(diào)節(jié)，包括生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸和葡萄糖。亮氨酸被認(rèn)為是mTORC1的關(guān)鍵激活因子，它通過(guò)刺激 RagA/B復(fù)合體的GTP狀態(tài)，進(jìn)而將mTORC1吸收到蛋白質(zhì)中，在蛋白質(zhì)中被溶酶體結(jié)合蛋白R(shí)heb激活[14]。谷氨酰胺也被認(rèn)為是mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)的重要氨基酸，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)增加亮氨酸的攝取間接刺激這一途徑。例如Duran等[15]證明，谷氨酰胺與亮氨酸結(jié)合，增加了Ragb基因表達(dá)，促進(jìn)了GLUD1的激活，增強(qiáng)了谷氨酰胺分解和α-酮戊二酸的合成。由于亮氨酸直接結(jié)合并調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，因此GLUD1可能是通過(guò)調(diào)節(jié)mTORC1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響腫瘤細(xì)胞的增殖，因此據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論推斷，GLUD1有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。但是GLUD1影響腫瘤細(xì)胞生存的作用機(jī)制尚不明確，這就需要在將來(lái)的研究工作中對(duì)其進(jìn)行更深入的分析，從而為臨床轉(zhuǎn)化提供更可靠的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，乳腺癌患者腫瘤組織中GLUD1 mRNA表達(dá)量及GLUD1蛋白高表達(dá)率均較癌旁組織普遍降低，尤其是多見(jiàn)于惡性化程度更高或ER-/PR-乳腺癌組織中，這有望成為指導(dǎo)乳腺癌個(gè)性化治療的新靶點(diǎn)。