榨菜根腫病菌拮抗菌株的分離篩選及促生特性分析

唐愷言,何硯秋,申枚琳,黃 琴,韋宇新，黃 銳,趙 珂

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院微生物學(xué)系，成都 611130)

根腫病自1737年于英國(guó)地中海西岸和歐洲南部發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已對(duì)世界各地十字花科作物的生產(chǎn)和發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重影響。隨著我國(guó)近年來(lái)對(duì)十字花科作物栽培數(shù)量和種類的不斷擴(kuò)大，十字花科植物根腫病的發(fā)生概率和面積也在不斷上升[1-2]。根腫病是由專性寄生菌蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)導(dǎo)致的土傳性病害[3]。根腫病菌可通過(guò)昆蟲(chóng)活動(dòng)、灌溉水流動(dòng)、帶病植株等多種方式在十字花科植物中進(jìn)行傳播，其休眠孢子囊可在土壤存活8～15年，病菌極強(qiáng)的傳染性以及孢子超長(zhǎng)的存活能力等原因?qū)е赂[病的防治工作非常困難[4]。

對(duì)于根腫病的防治技術(shù)，目前主要集中在化學(xué)農(nóng)藥篩選、田間管理、抗病植株培育等方面[5]?；瘜W(xué)藥劑雖然可以一定程度上殺死病原菌，但長(zhǎng)期施用易造成土壤環(huán)境污染[6]。此外通過(guò)施用生石灰、輪作等田間管理手段也極耗人力、物力，抗病植株的篩選更需要較長(zhǎng)時(shí)間，且由于病原菌存在生理小種，培育出的抗病植株也無(wú)法大規(guī)模耕種[2, 7]。近年來(lái)隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)投入加大，生物防治因其高效、安全、成本低廉等特點(diǎn)在農(nóng)業(yè)病害防治中備受關(guān)注。研究表明植物內(nèi)生枝頂孢屬真菌(Acremoniumalternatum)、枯草芽抱桿菌XF-1(Bacillussubtilis)、放線菌等對(duì)根腫病的防治都具有顯著效果[8-11]。芽孢桿菌作為生物防治領(lǐng)域的典型代表可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、分泌抗菌或溶菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等多種方法對(duì)植物病害進(jìn)行防治。本研究以主要的十字花科作物榨菜為研究對(duì)象，采集成都平原主要榨菜種植區(qū)的植株根際土壤，分離榨菜根際土壤中的芽孢桿菌，并篩選具有抗根腫病和促生潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 實(shí)驗(yàn)所用根際土土壤樣品、患病榨菜的根組織、榨菜種子均采集自成都郫縣唐昌鎮(zhèn)柏木村榨菜種植區(qū)。

1.1.2 儀器設(shè)備 采用電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)對(duì)樣品進(jìn)行干燥處理；采用全自動(dòng)蒸汽滅菌鍋(北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；采用光學(xué)顯微鏡(ZEISS公司)進(jìn)行根腫菌休眠孢子活性觀察。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 根際芽孢桿菌分離培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，分別加入制霉菌素50mg/L；純化保種培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；根腫病菌拮抗菌株初篩培養(yǎng)基。MM-Chitin培養(yǎng)基；根腫病菌拮抗菌株復(fù)篩培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基。

1.2.2 根際芽孢桿菌分離、純化 將采集的根際土樣用80℃高溫預(yù)處理10min后用無(wú)菌水稀釋成10-4、10-5、10-6共3個(gè)濃度梯度。分別取100μL菌懸液均勻涂布于3種分離培養(yǎng)基，每組重復(fù)3次。涂布后的平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3d。對(duì)分離出的具有不同形態(tài)的細(xì)菌菌落進(jìn)行純化，并進(jìn)行革蘭氏染色[12]，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的顏色及顯微形態(tài)，去除非芽孢桿菌的菌株。將鏡檢后的純培養(yǎng)芽孢桿菌菌株用LB斜面試管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 根腫病菌拮抗菌株初篩 菌株初篩以其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的強(qiáng)度作為標(biāo)準(zhǔn)，供試菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的活性檢測(cè)方法參照劉翠萍等的方法。

1.2.4 根腫病菌拮抗菌株復(fù)篩 菌株復(fù)篩以其對(duì)病原菌休眠孢子囊活性的抑制情況和對(duì)病原菌根毛侵染抑制情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 菌株促生功能檢測(cè) 菌株產(chǎn)IAA能力參考Gordon[13]方法進(jìn)行測(cè)定；定性測(cè)定菌株產(chǎn)鐵載體能力參照Schwyn和Shin[14-15]的方法進(jìn)行；菌株溶磷能力采用PKO培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)[16]；菌株降解纖維素能力采用纖維素剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)[17]；菌株產(chǎn)蛋白酶活性采用無(wú)脂蛋白酶培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)[18]；菌株固氮能力采用NFM無(wú)氮培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 20.0軟件對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 根際芽孢桿菌的分離與純化

從根際土壤樣品中共分離獲得110株菌，通過(guò)觀察菌株菌落形態(tài)以及顯微鏡特征，如菌株細(xì)胞革蘭氏染色情況、產(chǎn)芽孢情況等，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。結(jié)果顯示有86株菌為芽孢桿菌，菌落大多呈乳白色，表明具有褶皺或粗糙，質(zhì)地干燥，少數(shù)菌株具有分泌粘液、色素的特性，顯微鏡下觀察到菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性，且大部分菌體中央有卵圓狀芽孢(圖1)。

圖1 芽孢桿菌形態(tài)

2.2 根腫病菌拮抗菌株初篩

對(duì)根際芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，分離出的86株菌株中有18株芽孢桿菌菌落周圍出現(xiàn)了不同大小的透明水解圈，其中菌株A1的水解圈最大，水解圈>15mm，此外菌株A2、A5、A7三株菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力也較強(qiáng)，水解圈>10mm(表1)。

表1 菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)結(jié)果

2.3 根腫病菌拮抗菌株的復(fù)篩

2.3.1 病原菌休眠孢子囊活性的抑制檢測(cè)結(jié)果 對(duì)篩選的28株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的芽孢桿菌進(jìn)行病原菌休眠孢子囊活性抑制實(shí)驗(yàn)，通過(guò)顯微鏡鏡檢失活休眠孢子囊數(shù)，并統(tǒng)計(jì)失活率(表2)。經(jīng)沸水浴致死處理后失活率達(dá)86%，對(duì)照組失活率為4.80%，實(shí)驗(yàn)組失活率在3.47%～13.56%之間，其中菌株A14、A5、A23、A10、A22、A13這6株菌株對(duì)休眠孢子囊的活性抑制率明顯高于對(duì)照組，且A14抑制率最高，為13.56%，表明這6株菌具有潛在抑制休眠孢子囊活性的能力。

表2 菌株對(duì)休眠孢子囊活性的抑制結(jié)果

2.3.2 病原菌根毛侵染抑制檢測(cè)結(jié)果 對(duì)篩選的6株具有潛在抑制病原菌休眠孢子囊活性的菌株進(jìn)行根毛侵染抑制實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)根毛染色觀察分別統(tǒng)計(jì)處理7d和14d后的受侵染率(表3)。結(jié)果表明處理7d后實(shí)驗(yàn)組侵染率為14.00%～53.33%，其中菌株A5處理(14.00%)明顯低于對(duì)照組(59%)；處理14d后，實(shí)驗(yàn)組侵染率為34.23%～80.00%，菌株A5(42%)、A10(34.23%)兩個(gè)處理組明顯低于對(duì)照組(87.66%)，表明A5和A10兩株菌對(duì)于抑制病原菌侵染根毛具有一定能力。

表3 菌株對(duì)根毛侵染的抑制效果

2.4 菌株促生功能檢測(cè)結(jié)果

對(duì)篩選的6株具有潛在抑制病原菌休眠孢子囊活性的菌株進(jìn)行促生功能檢測(cè)(表4)。結(jié)果表明6株菌均可產(chǎn)IAA，其中菌株A5產(chǎn)IAA濃度最高，達(dá)到了13.20mg/L。6株菌中只有A10、A14、A22具有固氮能力，溶磷檢測(cè)結(jié)果顯示除A10和A23外，其余4株菌均具有溶磷效果，但溶磷能力并不強(qiáng)，溶磷水解圈均低于5mm。產(chǎn)鐵載體能力檢測(cè)結(jié)果顯示除A23外其余5株菌都能產(chǎn)生鐵載體，其中菌株A22水解圈最大。產(chǎn)蛋白酶檢測(cè)結(jié)果顯示除A14以外其余菌株均具有產(chǎn)蛋白酶能力，且都大于10mm，說(shuō)明這些菌株以利用蛋白質(zhì)作為碳源的能力較強(qiáng)。降解纖維素能力檢測(cè)結(jié)果顯示，6株菌纖維素降解圈都大于10mm，都有高效降解纖維素能力，6株菌都具有2種及以上的促生功能。

表4 菌株促生功能檢測(cè)結(jié)果

3 討論

芽孢桿菌廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中，因具有抗逆性極強(qiáng)的內(nèi)生孢子而具有較強(qiáng)生命力。研究表明芽孢桿菌在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種有機(jī)物質(zhì)，不僅能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)還能對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)起到良好促進(jìn)作用[20]。周京龍等[21]研究發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌在防治棉花枯萎病的同時(shí)對(duì)其還具有促生能力。Lahlali等[22]發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)油菜根腫病具有良好防治效果的枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisQST713)。本研究對(duì)分離自榨菜根際土壤的芽孢桿菌進(jìn)行了根腫病病原菌抑菌性實(shí)驗(yàn)以及促生功能分析，結(jié)果表明86株根際芽孢桿菌中僅有18株菌具有產(chǎn)幾丁質(zhì)能力，對(duì)18株菌進(jìn)行病原菌休眠孢子囊活性的抑制檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)僅有6株菌對(duì)孢子活性具有明顯抑制效果，且6株菌都具有產(chǎn)IAA和纖維素酶能力，其中A5的IAA產(chǎn)量最高，為13.20mg/L，除固氮能力外，A5其余促生功能指標(biāo)都較好。

休眠孢子囊的萌發(fā)是導(dǎo)致根腫病泛濫的重要原因，通過(guò)使休眠孢子囊失活可有效降低根腫病的發(fā)生。將篩選的18株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶根際芽孢桿菌制備成菌液處理榨菜根腫病原菌休眠孢子囊，結(jié)果顯示僅有A5、A10、A13、A14、A22、A23 6組處理的休眠孢子囊失活率明顯高于對(duì)照組(4.80%)，具有使休眠孢子失活的潛力，其失活率為9.54%～13.56%。劉翠萍等[23]在對(duì)甘藍(lán)根腫病的生防菌篩選結(jié)果中顯示其篩選出的菌株對(duì)休眠孢子囊的失活率為14.23%～31.36%，遠(yuǎn)高于本研究的最高失活率，但其對(duì)照組失活率(21.84%)也遠(yuǎn)高于本研究的4.80%，這種差異可能與病原菌的植物寄主不同、采樣地區(qū)差異等因素有關(guān)。對(duì)6株具有顯著失活效果的菌株進(jìn)行不同時(shí)間病原菌根毛侵染抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，病原菌根毛的侵染率呈上升趨勢(shì)，處理7d后只有菌株A5處理(14.00%)顯著低于對(duì)照組(59%)，處理14d后，菌株A5(42%)和A10(34.23%)2個(gè)處理組顯著低于對(duì)照組(87.66%)，表明A10和A5號(hào)菌對(duì)于抑制病原菌侵染根毛具有一定能力。這可能是因?yàn)橄噍^于其他幾株菌，A10和A5有更高的吸附根系的能力，定值能力強(qiáng)，更大的占領(lǐng)了植物根系表面的生態(tài)位，并產(chǎn)生更豐富的次生代謝物，對(duì)病原菌的侵染有更強(qiáng)的抑制效果[24-25]。

根際微生物可通過(guò)分泌多種代謝物促進(jìn)植物生長(zhǎng)進(jìn)而達(dá)到抑制病害侵襲的，增強(qiáng)植物抗病的作用[26]。本研究對(duì)篩選出的6株對(duì)根腫病具有防治潛力菌株開(kāi)展了促生功能檢測(cè)，結(jié)果顯示6株菌均具有降解纖維素和產(chǎn)IAA的能力，且纖維素水解圈都大于10mm，除A14外，其余5株菌均具有產(chǎn)蛋白酶能力，除A23外其余5株菌均具有產(chǎn)鐵載體能力，6株菌中分別有4株菌具有溶磷能力和3株菌具有固氮能力。篩選的兩株具有抗根腫病潛力的菌株A10和A5都具備5種促生功能。因此，芽孢桿菌A5和A10在抑制榨菜根腫病，促進(jìn)榨菜生長(zhǎng)上具有一定潛力，結(jié)果可為十字花科植物根腫病生防試劑菌株資源的篩選提供科學(xué)參考。

4 結(jié)論

從榨菜根際土壤中共分離出86株根際芽孢桿菌，其中僅有18株菌具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力，對(duì)這18株菌進(jìn)行病原菌休眠孢子囊活性的抑制檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，選出了6株與對(duì)照組相比具有顯著抑制效果的菌株，在此基礎(chǔ)上對(duì)6株菌病原菌根毛侵染抑制實(shí)驗(yàn)以及菌株促生功能進(jìn)行了探究。綜合比較結(jié)果獲得了具有較好抗菌能力及促生效果的兩株根際芽孢桿菌菌株為A5和A10。