吲哚胺-2,3-雙加氧酶/犬尿氨酸通路調(diào)控糖尿病并發(fā)抑郁癥的機(jī)制研究*

阿麗婭·吉力力，再努爾·買合木提，盧雪玲△

（新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科；2.全科醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830054）

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，可引起糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病、心腦血管、抑郁癥等多種并發(fā)癥[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)糖尿病患病人數(shù)已經(jīng)超過(guò)3.5億，預(yù)計(jì)至2030年將超過(guò)5.5億[2]。研究發(fā)現(xiàn)，60%～75%糖尿病患者伴有抑郁情緒，其中10%～35%為重度抑郁[3-4]。抑郁癥狀可導(dǎo)致血糖控制不良，增加糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而糖尿病患者血糖控制不佳又會(huì)加重抑郁癥狀。因此，探索糖尿病并發(fā)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善糖尿病患者的生存質(zhì)量十分重要。

犬尿氨酸（KYN）是一種內(nèi)源性神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸受體拮抗劑，在犬尿氨酸-3-單加氧酶作用下可代謝為神經(jīng)毒性物質(zhì)3-羥基犬尿氨酸，而3-羥基犬尿氨酸可通過(guò)氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞死亡等生物過(guò)程造成神經(jīng)損傷。既往研究表明，KYN代謝途徑（KP）的激活在情緒調(diào)節(jié)中起著重要作用，是連接神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎性反應(yīng)等系統(tǒng)與抑郁癥的主要途徑[5]。研究顯示，大鼠血漿中KYN水平降低可以保護(hù)大腦免受與抑郁癥相關(guān)的應(yīng)激性變化的影響[6]。提示通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子來(lái)降低KYN 水平可達(dá)到治療抑郁癥的目的。

吲哚胺-2,3-雙加氧酶（IDO）是一種色氨酸降解酶，也是色氨酸-KP上的第一個(gè)限速酶，其可通過(guò)裂解色氨酸的吲哚環(huán)，使色氨酸代謝為KYN，最終導(dǎo)致色氨酸的相對(duì)降低和KYN的積累，從而誘導(dǎo)神經(jīng)毒性[7]。已有研究證實(shí)，IDO/KP通路的激活可能與糖尿病并發(fā)抑郁癥有關(guān)[8]，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明?；诖?，本研究旨在探討IDO/KP 通路在糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠中的調(diào)控機(jī)制，以期為該病提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠30 只，6～8 周齡，體重（200±20）g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002。在安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，相對(duì)濕度55%～60%，給予充足清潔飲水，自由攝食。

1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素（STZ）（純度≥98%，規(guī)格：100 mg）購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；IDO抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）（純度≥96%，規(guī)格：250 mg）購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；KYN對(duì)照品（純度≥98%，規(guī)格：10 mg）購(gòu)自成都成科匯博科技有限公司；去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-4、IL-10、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購(gòu)自武漢賽培生物科技有限公司；IDO、GAPDH抗體及HRP標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）均購(gòu)自上海碧云天公司；冰醋酸、醋酸鈉、高氯酸均為分析純，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SA215型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)購(gòu)自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；IX2-UCB型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；Sorvall ST 16R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、Varioskan Flash 型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher 公司；Agilent1200 高效液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司。

1.3 動(dòng)物分組、造模及給藥 將30 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組，每組10只。模型組和干預(yù)組復(fù)制糖尿病抑郁大鼠模型[9]。采用高脂飼料+注射STZ 的方法建立糖尿病模型：高脂飼料喂養(yǎng)4 周后禁食、不禁水12 h，一次性腹腔注射1% STZ溶液（20 mg/kg），10 min 內(nèi)注射完畢，血糖＞16.7 mmol/L 視為造模成功。糖尿病模型成功后每日給予無(wú)規(guī)律的應(yīng)激處理，包括冷水游泳和束縛，即冷水游泳10 min/d或束縛20 min/d，每天一種刺激，連續(xù)刺激4周。以曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為糖尿病抑郁模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)：大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直豎立得分較造模前明顯下降。對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水后正常飼養(yǎng)。

于造模成功后第8天起，干預(yù)組灌胃給予1-MT溶液（用0.9%NaCl溶解配制成10 mg/mL濃度的溶液）100 mg/kg，1 次/d，連續(xù)14 d。對(duì)照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠行為學(xué)改變 準(zhǔn)備80 cm×80 cm×40 cm的敞箱，將其底面劃分成25個(gè)16 cm×16 cm 的方格，實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠從同一位置放于敞箱底面，大鼠適應(yīng)1 min 后，觀察并記錄大鼠3 min 內(nèi)水平運(yùn)動(dòng)格數(shù)（每次四爪皆進(jìn)入記為1次1分）和垂直豎立次數(shù)（每次兩前爪騰空或攀附箱壁記為1次1分）。每次測(cè)評(píng)結(jié)束后，用消毒液擦拭敞箱底面，晾干等待下次使用。水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直豎立得分越低，表示大鼠抑郁程度越嚴(yán)重。

1.5 大鼠海馬組織NE、5-HT及血清炎性因子水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取尾靜脈血2 mL，隨后將大鼠麻醉處死，迅速剝離腦組織，冰上無(wú)菌分離出海馬組織。血液離心，取上層血清；取適量海馬組織制成勻漿液，采用ELISA法檢測(cè)大鼠海馬組織中NE、5-HT水平及TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平。

1.6 高效液相色譜—熒光法測(cè)定大鼠血清KYN水平 取200 μL血清置于EP管內(nèi)，加入5%高氯酸溶液，混勻；室溫放置10 min 以充分沉淀血清中的蛋白質(zhì)，10 000 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一EP管內(nèi)再離心10 min；取上清液20 μL，于高效液相色譜儀上進(jìn)樣分析。流動(dòng)相為0.125 mol/L醋酸鋅∶乙腈（95∶5）。熒光激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。KYN 采用峰保留值比較法和疊加法定性分析，用外標(biāo)法測(cè)定峰面積進(jìn)行定量分析。

1.7 Western blotting法檢測(cè)大鼠海馬組織IDO 蛋白表達(dá) 取海馬組織，RIPA 裂解液提取組織總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，行SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。洗膜，加入IDO 一抗（1∶1 000）稀釋液4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，洗膜，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，洗膜，ECL 發(fā)光液顯影，以GAPDH 為內(nèi)參，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)行為和垂直豎立行為結(jié)果比較 造模第1 周，模型組和干預(yù)組大鼠水平運(yùn)動(dòng)行為得分和垂直豎立行為得分與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；造模第4 周，模型組和干預(yù)組大鼠水平運(yùn)動(dòng)行為得分和垂直豎立行為得分較對(duì)照組下降（均P＜0.05），且模型組與干預(yù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)14 d后，模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)行為得分和垂直豎立行為得分較對(duì)照組下降，且干預(yù)組高于模型組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)行為得分和垂直豎立行為得分比較n=10，分，

表1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)行為得分和垂直豎立行為得分比較n=10，分，

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 各組大鼠海馬組織中NE、5-HT水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織NE、5-HT水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠海馬組織NE、5-HT水平升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠海馬組織中NE、5-HT水平比較n=10，ng/L，

表2 各組大鼠海馬組織中NE、5-HT水平比較n=10，ng/L，

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平及KYN水平比較與對(duì)照組比較，模型組血清TNF-α、IL-6及KYN水平升高，IL-4、IL-10 水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組血清TNF-α、IL-6及KYN水平降低，IL-4、IL-10水平升高（均P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清炎性因子水平及KYN水平比較n=10，

表3 各組大鼠血清炎性因子水平及KYN水平比較n=10，

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.4 各組大鼠海馬組織IDO 蛋白表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組海馬組織IDO蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠海馬組織IDO蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織IDO蛋白表達(dá)量比較

3 討論

研究顯示，抑郁癥發(fā)生機(jī)制可能與神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和增殖、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)等有關(guān)，其中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂和炎癥反應(yīng)與糖尿病并發(fā)抑郁癥的機(jī)制最為關(guān)聯(lián)[10-11]。NE 作為一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在腦中含量降低會(huì)導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生[12]；5-HT 能夠控制神經(jīng)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)情緒，從而防止認(rèn)知和行為障礙。研究表明，5-HT 水平降低與抑郁癥嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，監(jiān)測(cè)5-HT水平有助于評(píng)估抑郁癥患者病情發(fā)展及預(yù)后[13-14]。本研究建立糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠行為學(xué)改變，并檢測(cè)大鼠海馬組織中NE、5-HT水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模第4周模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直豎立行為得分較對(duì)照組均顯著下降，且模型組大鼠海馬組織中NE、5-HT 水平均顯著降低。表明本研究糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型構(gòu)建成功。

IDO主要存在于淋巴細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥小鼠血清中IDO 活性升高，5-HT 活性降低，血清IDO 活性與5-HT水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[17-18]。通過(guò)藥物抑制抑郁癥小鼠體內(nèi)IDO 活性，可減輕小鼠抑郁樣行為。此外，IDO活性抑制可使小鼠抑郁敏感性降低，神經(jīng)發(fā)生良好。該結(jié)果提示IDO 參與了抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，IDO 抑制劑1-MT 干預(yù)后糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直豎立行為得分均顯著升高，同時(shí)大鼠海馬組織中NE、5-HT 水平顯著升高。提示抑制IDO 活性可減輕糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠抑郁樣行為，提高大鼠海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平。

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥過(guò)程與抑郁癥發(fā)生的病理生理學(xué)有關(guān)[19]。促炎因子TNF-α、IL-6 被發(fā)現(xiàn)在抑郁患者外周血中水平升高[20]；血清抗炎因子IL-4、IL-10水平越低，抑郁癥患者抑郁發(fā)作速度越快[21]。本研究中，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高，IL-4、IL-10水平降低；1-MT干預(yù)后，大鼠血清炎性因子水平得到明顯改善。表明抑制IDO 活性有助于改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

Da 等[8]評(píng)估了選擇性5-HT 再攝取抑制劑氟西汀、IDO 直接抑制劑1-MT、IDO 間接抑制劑米諾環(huán)素及非選擇性環(huán)氧化酶抑制劑布洛芬對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥的作用，結(jié)果證實(shí)上述藥物均可下調(diào)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬組織中IDO 表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬組織中IDO蛋白表達(dá)水平升高，1-MT 干預(yù)后大鼠海馬組織中IDO蛋白表達(dá)水平降低，與Da等[8]研究結(jié)果相符。色氨酸是產(chǎn)生多種具有重要生理作用的神經(jīng)活性代謝物的底物，其主要分解代謝途徑是KP途徑，由色氨酸生成KYN 是KP 途徑的第一個(gè)限速步驟，受IDO等酶的介導(dǎo)[22]。失調(diào)的KP 途徑與抑郁癥的病理進(jìn)程有關(guān)，KYN水平升高是抑郁行為的一個(gè)致病生物標(biāo)志物[23-24]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠血清KYN 水平升高，1-MT 干預(yù)后大鼠血清KYN 水平降低。表明抑制IDO 活性能夠降低糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠體內(nèi)KYN水平，從而減少大鼠抑郁行為。

綜上所述，抑制IDO/KP 通路可能通過(guò)提高NE和5-HT水平、減輕炎性反應(yīng)來(lái)抑制大鼠糖尿病并發(fā)抑郁癥的發(fā)生。IDO/KP 通路有望成為糖尿病并發(fā)抑郁癥治療的有效靶點(diǎn)。本研究不足之處是未評(píng)估糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠體內(nèi)色氨酸濃度以及神經(jīng)損傷情況，后續(xù)將深入探索糖尿病并發(fā)抑郁癥中IDO/KP 信號(hào)通路上、下游調(diào)控因子變化以及IDO活性變化與神經(jīng)損傷的相關(guān)性。