螢火蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的馬爾尼菲籃狀菌的構(gòu)建與應(yīng)用*

羅 強(qiáng)，韋吳迪,,3，王 剛，何錦豪，張 洪，包秀麗，陳麗香，蔣俊俊,,3，葉 力,,3，梁 浩,,3△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.中國(guó)（廣西）-東盟新發(fā)傳染病聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

馬爾尼菲籃狀菌（talaromyces marneffei，TM）是一種溫度依賴型二相真菌，作為一種機(jī)會(huì)性的致病性真菌，可在免疫系統(tǒng)功能低下人群中引起感染性疾病，尤其是在HIV/AIDS 人群[1]。HIV/AIDS 合并TM感染可導(dǎo)致高復(fù)發(fā)率與病死率[2]，是一種嚴(yán)重危害人類健康的病原體。目前的研究主要聚焦于TM與宿主間的相互作用[3]，但關(guān)于TM潛伏感染與復(fù)發(fā)的機(jī)制尚未闡明。傳統(tǒng)真菌相關(guān)研究主要涉及細(xì)胞與動(dòng)物感染模型構(gòu)建，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需在特定時(shí)間處死小鼠并取材，觀察臟器變化和真菌負(fù)荷等指標(biāo)，進(jìn)而評(píng)估TM的感染進(jìn)程[4-6]。然而，該手段無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)TM感染全過(guò)程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。因此建立一種可追蹤的工具菌來(lái)實(shí)時(shí)評(píng)估TM的感染進(jìn)程尤為重要。

生物發(fā)光成像作為一種非侵入性的成像方法，廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞、細(xì)菌、真菌及病毒的實(shí)時(shí)追蹤。其中，基于螢火蟲(chóng)熒光素—熒光素酶（firefly luciferase，Luc）的報(bào)告系統(tǒng)研究最為廣泛，該方法涉及腫瘤進(jìn)展的監(jiān)測(cè)、疾病診斷與治療、病原微生物感染的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等多個(gè)方面[7-10]。該技術(shù)已應(yīng)用在白色念珠菌的研究中，以基因組學(xué)技術(shù)將Luc 基因整合至真菌基因組，實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌的標(biāo)記，可視化真菌在宿主體內(nèi)的定植部位以及評(píng)價(jià)藥物對(duì)真菌的清除效果[11]。然而，尚未有利用Luc標(biāo)記TM菌株的報(bào)道。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（agrobacteriun tumefaciens-mediated transformation，ATMT）將Luc基因插入TM基因組，使TM菌株可穩(wěn)定表達(dá)Luc基因，并在形態(tài)與功能上與TM標(biāo)準(zhǔn)株比較，探究TMLuc作為工具菌的效果及潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與菌株 TM 標(biāo)準(zhǔn)株ATCC18224，購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)ATCC；pASP-hyg 質(zhì)粒購(gòu)于武漢銳志魔方生物科技有限公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105 購(gòu)于上海維地生物技術(shù)有限公司；THP-1 細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（NEB），2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）（Vazyme），ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit（Vazyme），HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme），EHA105（pSoup）（唯地生物），LB培養(yǎng)基（海博生物），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（青島海博），卡那霉素（索萊寶），利福平（索萊寶），As 乙酰丁香酮（索萊寶），潮霉素B（索萊寶），DMEM basic 高糖培養(yǎng)液（Gibco），RPMIMedium 1640 basic培養(yǎng)液（Gibco）。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀（ABI），北京六一電泳儀（DYY-7C），哈東聯(lián)恒溫?fù)u床（DLHR-X250），化學(xué)成像系統(tǒng)（Bio-Rad Chem Doc），冷凍離心機(jī)（Beckman Microfuge 20R），微量移液器（瑞寧），微量分光光度計(jì)（Thermo Nanodrop 2000），活體成像動(dòng)物儀（PerkinElmer），Cyto FLEX2 流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdALuc的構(gòu)建 以pGL3-basic質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)Luciferase 引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。對(duì)pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP載體骨架進(jìn)行雙酶切。37 °C 反應(yīng)1 h，80 °C 失活10 min，之后通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的載體骨架，將回收的PCR 產(chǎn)物與酶切后回收的pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP 載體骨架進(jìn)行重組連接。37°C 反應(yīng)30 min 后迅速置于冰上冷卻；隨后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TranT1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基上，37°C 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h；挑取重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上若干個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定，引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增后進(jìn)行電泳驗(yàn)證，隨后對(duì)目標(biāo)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行小質(zhì)粒提取并進(jìn)行測(cè)序。

表1 Luciferase引物序列

1.2.2 潮霉素濃度篩選 將TM標(biāo)準(zhǔn)株涂布于含有不同濃度潮霉素（0 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，60 μg/mL，80 μg/mL，100 μg/mL）沙氏葡萄糖培養(yǎng)基平板中，在37°C溫箱中培養(yǎng)3 d，篩選出無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低潮霉素濃度。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)及TM-Luc轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建 取適量重組質(zhì)粒與EHA105 感受態(tài)細(xì)胞，加入無(wú)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基在28°C 環(huán)境下培養(yǎng)2～3 h，離心留取上清，將上清涂布于含50 μg/mL 卡那霉素，20 μg/mL 利福平的LB 平板繼續(xù)培養(yǎng)2 d，挑取陽(yáng)性克隆株于含20 mg/LAs 的LB 液體培養(yǎng)基，28°C震蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.8左右待用。將含有質(zhì)粒的EHA105感受態(tài)細(xì)胞與TM標(biāo)準(zhǔn)株按比例進(jìn)行共培養(yǎng)24 h，收集懸液涂布至含潮霉素的沙氏葡萄糖培養(yǎng)基平板上，放入37°C 溫箱培養(yǎng)至有菌落產(chǎn)生，隨后挑取菌落至新的含潮霉素的沙氏葡萄糖培養(yǎng)基平板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組進(jìn)行PCR 鑒定，引物見(jiàn)表2。

表2 TM-Luc引物序列

1.2.4 TM 標(biāo)準(zhǔn)株與TM-Luc 生長(zhǎng)形態(tài)對(duì)比 根據(jù)說(shuō)明書(shū)配比配置PDA與BHI培養(yǎng)基，121°C，20 min高壓后，倒入培養(yǎng)皿中，待其冷卻后分別在培養(yǎng)皿中央滴加10 μL TM 標(biāo)準(zhǔn)株菌液或TM-Luc 菌液，PDA和BHI培養(yǎng)基分別放入27°C和37°C培養(yǎng)箱，持續(xù)培養(yǎng)18 d；每日取出培養(yǎng)皿進(jìn)行拍照，采用十字交叉法量取菌落直徑。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)與感染模型構(gòu)建 使用RPMIMedium 1640 basic（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液）完全培養(yǎng)液培養(yǎng)THP-1 細(xì)胞，并置于37 °C、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。使用含有PMA的DMEM（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液）完全培養(yǎng)液刺激48 h，即可轉(zhuǎn)化為T(mén)HP-1 來(lái)源的巨噬細(xì)胞。隨后用TM標(biāo)準(zhǔn)株與TM-Luc感染THP-1巨噬細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)為1∶3，分別收集感染后24 h、48 h的總RNA進(jìn)行后續(xù)炎癥因子檢測(cè)，同時(shí)收集24 h、48 h和72 h的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞死亡情況的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8與SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），假設(shè)檢驗(yàn)采用Student t檢驗(yàn)與雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdALuc的構(gòu)建及驗(yàn)證

使 用NcoI、BstEII酶切pCAMBIA1303-TrpCHygro-gpdA-GFP 質(zhì)粒（圖1A），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后與擴(kuò)增的Lucifera 產(chǎn)物（圖1D）進(jìn)行重組連接，構(gòu)建pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-Luc 重組質(zhì)粒（圖1B），挑取重組反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR 鑒定，在12 個(gè)單克隆菌落中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)菌落在目的位置出現(xiàn)條帶（圖1C）。隨后挑選其中一個(gè)單克隆菌落（泳道7）進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取少量質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，比對(duì)結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Luc質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的構(gòu)建與驗(yàn)證

2.2 TM標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)潮霉素的敏感性篩選

在早期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上[12]，本課題組摸索了TM標(biāo)準(zhǔn)株在含不同濃度的潮霉素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示TM 標(biāo)準(zhǔn)株在含有80 μg/mL 的潮霉素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，見(jiàn)圖2。

圖2 潮霉素濃度對(duì)TM標(biāo)準(zhǔn)株的生長(zhǎng)影響

2.3 農(nóng)桿菌侵染TM標(biāo)準(zhǔn)株

通過(guò)ATMT 法將Luc 基因插入TM 標(biāo)準(zhǔn)株的基因組中，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和Luciferase 的檢測(cè)，電泳結(jié)果在500～750 bp 之間出現(xiàn)條帶（圖3A）；成像結(jié)果見(jiàn)圖3B，在D-熒光素鉀鹽底物存在時(shí)，TM-Luc 可發(fā)出明顯的熒光，證明TM-Luc 構(gòu)建成功。

圖3 TM-Luc的驗(yàn)證

2.4 TM-Luc 與TM 標(biāo)準(zhǔn)株生長(zhǎng)形態(tài)與生長(zhǎng)速率的對(duì)比

兩種菌株分別放置于27°C 與37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)14 d記錄菌落生長(zhǎng)情況。二者在PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)形態(tài)均為扁平絨毛狀，可在菌落底部觀察到特征性紅色素?cái)U(kuò)散現(xiàn)象（圖4A）；在BHI培養(yǎng)基上呈深褐色，表面光滑（圖4A）。培養(yǎng)14 d后，在PDA培養(yǎng)基中，TM 標(biāo)準(zhǔn)株生長(zhǎng)直徑為（6.54 ± 0.22）cm，TM-Luc 生長(zhǎng)直徑為（6.45 ± 0.23）cm，兩者之間的生長(zhǎng)曲線（P=0.273）與生長(zhǎng)速率曲線（P=0.49）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4B、圖4C）。熒光顯微鏡下觀察二者形態(tài)相似，均可發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的帚狀枝形態(tài)（圖4A）。

圖4 TM標(biāo)準(zhǔn)株與TM-Luc生長(zhǎng)情況

2.5 TM標(biāo)準(zhǔn)株與TM-Luc對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞的影響

在比較了二者的生長(zhǎng)情況后，本課題組探索了兩種菌株對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞的影響。TM標(biāo)準(zhǔn)株和TM-Luc 與THP-1 來(lái)源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測(cè)24 h 和48 h 的炎癥因子TNFA、IL1B和IL10的表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5A）；在細(xì)胞死亡的檢測(cè)中，觀察到TM-Luc 對(duì)于THP-1 巨噬細(xì)胞的殺傷稍少于TM 標(biāo)準(zhǔn)株（圖5B），雖在48 h 時(shí)有差異，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，二者對(duì)細(xì)胞殺傷效果趨于一致。

圖5 TM標(biāo)準(zhǔn)株與TM-Luc感染THP-1巨噬細(xì)胞

3 討論

本研究采用ATMT 法將Luc 基因轉(zhuǎn)入TM 的基因組，從而構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的TM-Luc。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法受體材料廣泛，分生孢子、原生質(zhì)體、菌絲體等材料都可進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。相較于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方法，ATMT 轉(zhuǎn)化難度低、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定高，并且T-DNA 隨機(jī)整合至基因組，這些優(yōu)點(diǎn)讓ATMT廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的真菌疾病病理研究中[13]。在TM基因組插入誘變的研究中，發(fā)現(xiàn)T-DNA在TM基因組的整合方式為隨機(jī)整合，并且部分突變體表現(xiàn)出形態(tài)方面的異質(zhì)性，如可溶性紅色素產(chǎn)生缺陷、分生孢子較少甚至無(wú)分生孢子等現(xiàn)象[14]。這表明T-DNA 的插入可能會(huì)對(duì)宿主的基因組造成影響，從而影響宿主的形態(tài)或功能。

本課題組將農(nóng)桿菌LB 與RB 序列間的T-DNA替換為L(zhǎng)uc 基因，從而將Luc 基因整合至TM 基因組，因其在整合過(guò)程中的隨機(jī)性，筆者針對(duì)TM-Luc與TM標(biāo)準(zhǔn)株之間的形態(tài)與部分功能特征進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TM-Luc 可產(chǎn)生特征性的可溶性紅色素，并且菌落形態(tài)、生長(zhǎng)直徑等與TM 標(biāo)準(zhǔn)株無(wú)差異。TM-Luc 和TM 標(biāo)準(zhǔn)株與THP-1 來(lái)源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，TNFA、IL10等炎癥因子的表達(dá)趨勢(shì)一致；在TM 殺傷巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)TM-Luc 對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷較弱于TM 標(biāo)準(zhǔn)株，在48 h 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而72 h時(shí)細(xì)胞死亡趨勢(shì)趨于一致。

Luc 在動(dòng)物活體成像領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛，同一批次的動(dòng)物可得到所有動(dòng)物的橫向?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)，也可得到單個(gè)動(dòng)物的縱向?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)，避免了批次間的誤差，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加真實(shí)。本研究構(gòu)建的TM-Luc目前僅用于細(xì)胞感染模型的構(gòu)建，和TM 標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行了部分形態(tài)與功能學(xué)特征進(jìn)行了對(duì)比。后續(xù)將TM-Luc應(yīng)用于動(dòng)物感染模型的構(gòu)建，可為T(mén)M的體內(nèi)機(jī)制研究提供新的手段。