一株西瓜細菌性果斑病生防菌的篩選、鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化

王雪妍，馬 煥，岳丹丹，張志龍，李冠杰，張英濤

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司 鄭州 450008）

瓜類細菌性果斑?。╞acterial fruit blotch，BFB）是危害葫蘆科作物的重要病害之一，也是一類毀滅性細菌病害，其病原菌為西瓜噬酸菌（）。病原菌最初被命名為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜 亞 種（subsp.），1992 年Willems 等將其更名為燕麥噬酸菌西瓜亞種（subsp.），2008 年更名為西瓜噬酸菌（）。細菌性果斑病最早于1969 年美國佛羅里達州被發(fā)現(xiàn)，隨后在澳大利亞、日本、巴西、土耳其、希臘等國家均有發(fā)生的報道。目前，該病害在我國的河南、內(nèi)蒙古、山東、陜西、甘肅、新疆、海南、廣西等地區(qū)均有報道，給西瓜、甜瓜產(chǎn)業(yè)帶來了嚴重威脅，造成了巨大的經(jīng)濟損失。

瓜類細菌性果斑病屬于種傳病害，其病原菌可以在種子中長期存活，具有較強的抗逆能力，給防治帶來了極大的困難。目前，細菌性果斑病的防治主要集中在種子檢疫、抗病品種選育、化學(xué)防治和生物防治等方面。在種子生產(chǎn)上應(yīng)強化種子的消毒處理，確保種子無菌，應(yīng)杜絕帶菌種子進口。另外，使用抗病品種是防治細菌性果斑病的有效措施，但迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)對該病完全免疫或高抗的品種。細菌性果斑病的化學(xué)防治通常以藥劑防治為主，但實際應(yīng)用中很難做到科學(xué)合理地使用殺菌劑，化學(xué)藥劑的大量使用不僅會造成環(huán)境污染，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，而且會使病原菌逐漸產(chǎn)生抗藥性。與化學(xué)防治相比，生物防治具有安全、無污染、對環(huán)境友好的優(yōu)點，是綠色植保的重要內(nèi)容，日益受到人們的青睞。因此，生物防治已成為植物病害防治的重要內(nèi)容之一。目前，針對西瓜細菌性果斑病，國內(nèi)外已報道的生防菌株有熒光假單胞菌（A506）、非 致 病 菌subsp.（AAA99-2）、熒光假單胞菌（）工程菌株（染色體整合了2，4-二乙?；g苯三酚）、酵母菌（），以及芽孢桿菌如解淀粉芽孢桿菌（）、枯草芽孢桿菌（）等。筆者通過對西瓜根際土壤細菌的分離篩選，得到了一株對細菌性果斑病病原菌具有較好拮抗效果的生防菌株HP-24，通過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗和分子生物學(xué)手段對其進行了鑒定，并對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，以期為生防菌劑的開發(fā)利用提供菌株資源，為細菌性果斑病的防治提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣采自河南省周口市太康縣西瓜種植田。病原菌（燕麥噬酸菌西瓜亞種）來自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號為ACCC05732。培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB 培養(yǎng)基），培養(yǎng)溫度為28 ℃。

盆栽試驗西瓜品種為早佳8424，種子購自北京萬豐農(nóng)研科技有限公司。NB 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 值7.3；NA 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂18.0 g，pH 值7.3；KB培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g，甘油10 mL，KHPO1.5 g，MgSO7 mL，HO 1.5 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 值7.2。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集和生防菌初篩 根據(jù)種植西瓜品種不同，從瓜田植株根附近分別采集土壤樣品（采集時間為2020 年8 月9 日），西瓜品種分別為早佳8424、黑美人和美都。2020 年8 月在實驗室各取土樣10 g 加入到裝有90 mL ddHO 和10 個玻璃珠（已滅菌）的三角瓶中，180 r·min振蕩30 min，充分打散土樣，制成土壤懸浮液，用10 倍梯度稀釋法依次稀釋至10，再分別從稀釋倍數(shù)為10、10、10的稀釋液中取100 μL 涂布干NA 平板上，每個稀釋濃度3 次重復(fù)，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后挑取具有明顯差異的菌落，經(jīng)平板劃線純化，編號后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生防菌的復(fù)篩 將病原菌在NB 培養(yǎng)基中活化后制成濃度為10CFU·mL的菌懸液，吸取2 mL于KB 平板上，輕輕晃動平板，使菌液布滿整個平板，隨后將多余的菌液吸出，于生物安全柜的無菌環(huán)境中風(fēng)干培養(yǎng)基平板表面的菌液。將篩選出的生防菌均勻點種到平板上，每個菌株重復(fù)點接3次，28 ℃培養(yǎng)48 h，篩選出具有抑菌圈的菌株。將有拮抗作用的菌株進行多次繼代培養(yǎng)，選擇拮抗作用穩(wěn)定且效果最好的菌株。

1.2.3 盆栽防效的測定 采用盆栽西瓜幼苗噴霧法測定菌株HP-24 的防治效果。選取健康、飽滿的西瓜種子進行催芽處理，然后采用常規(guī)方法播種于盆缽內(nèi)（口徑13 cm×18 cm），試驗在河南省科學(xué)院生物研究所人工環(huán)境氣候箱中進行。待西瓜幼苗長出2～3 片真葉后（2022 年5 月16 日），將活化好的菌液濃度為10CFU·mL的HP-24 菌懸液噴施到真葉上，晾干后采用噴霧法接種菌液濃度為10CFU·mL的西瓜細菌性果斑病病原菌，葉片正、反兩面要均勻噴施。30 ℃保濕24 h 后進行常規(guī)管理，以噴KB 液體培養(yǎng)基的處理為對照，觀察發(fā)病情況。每個處理3 盆重復(fù)，每盆5 棵苗。7 d 后，觀察西瓜幼苗的發(fā)病情況，計算病葉率、病情指數(shù)及防治效果。

1.2.4 生防菌株的鑒定 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定：將拮抗作用最好的菌株HP-24 接種于NA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察菌落和菌體形態(tài)，并參照《常見細菌鑒定手冊》進行生理生化鑒定試驗。

16S rRNA 基因序列分析：提取菌株的基因組DNA，采用通用引物27F/1492R 進行PCR 擴增，引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR 擴增體系為25.0 μL，包括ddHO 18.0 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，正向和反向引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，DNA 聚合酶0.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃4 min，95 ℃1 min，52 ℃30 s，72 ℃2 min，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序，測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 相似性比對。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：測序獲得的16S rRNA 部分序列經(jīng)BLAST 同源比對后，從GenBank 中獲取同源性較高的相鄰的種、屬的序列，同時查找相鄰種、屬中模式種的16S rRNA 序列，使用MEGA 6 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.5 有菌與無菌發(fā)酵液的抑菌試驗 將菌株HP-24 接種到100 mL NB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃180 r·min培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液于4 ℃10 000 r·min離心20 min，再用孔徑為0.22 μm 的細菌過濾器過濾上清液，得到無菌發(fā)酵液。在涂布病原菌液的KB 平板上用無菌打孔器打孔，向孔內(nèi)加入帶菌發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液各50 μL 及離心得到的菌體，于30 ℃培養(yǎng)48 h，每個處理3 次重復(fù)，觀察抑菌效果。

1.2.6 不同濃度發(fā)酵液的抑菌試驗 將菌株HP-24

接種到100 mL NB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃180 r·min培養(yǎng)24 h 后，用無菌的NB 培養(yǎng)基分別稀釋2、4、8倍。在涂好病原菌液的KB 平板上用無菌打孔器打孔，分別向孔內(nèi)加入不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液各50 μL，于30 ℃培養(yǎng)48 h，每個處理3 次重復(fù)，觀察抑菌效果。

1.2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 碳源的優(yōu)化：于250 mL三角瓶中配置100 mL 培養(yǎng)基，其中蛋白胨1.0 g、氯化鈉0.5 g，分別選取牛肉膏、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為碳源，碳源添加量為0.3 g，調(diào)節(jié)pH 值為7.3，接入種子液2 mL，30 ℃180 r·min培養(yǎng)24 h，每個處理3 次重復(fù)，根據(jù)活菌數(shù)確定最佳碳源。配置不同濃度的碳源培養(yǎng)基，其中蛋白胨1.0 g、氯化鈉0.5 g，碳源為經(jīng)優(yōu)化確定的最佳碳源，質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%，調(diào)節(jié)pH 值為7.3，接種量為2%，30 ℃180 r·min培養(yǎng)24 h，每個處理3 次重復(fù)，統(tǒng)計活菌數(shù)并確定最適碳源濃度。

氮源的優(yōu)化：于250 mL 三角瓶中配置100 mL培養(yǎng)基，其中牛肉膏0.3 g、氯化鈉0.5 g，分別選取蛋白胨、酵母粉、蛋白胨+酵母粉、尿素、麩皮、硫酸銨作為氮源，氮源的添加量為1.0 g，調(diào)節(jié)pH 值為7.3，接入種子液2 mL，30 ℃180 r·min培養(yǎng)24 h，每個處理3 次重復(fù)，根據(jù)活菌數(shù)確定最佳氮源。配置不同濃度的氮源培養(yǎng)基，其中牛肉膏0.3 g、氯化鈉0.5 g，氮源為經(jīng)優(yōu)化確定的最佳氮源，質(zhì)量分數(shù)分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%，調(diào)節(jié)pH值為7.3，接種量為2%，30 ℃180 r·min培養(yǎng)24 h，每個處理3 次重復(fù)，統(tǒng)計活菌數(shù)并確定最適氮源濃度。

無機鹽的優(yōu)化：于250 mL 三角瓶中配置100 mL 培養(yǎng)基，其中牛肉膏0.3 g、蛋白胨1.0 g，分別選取氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀作為無機鹽，無機鹽的添加量為0.5 g，調(diào)節(jié)pH 值為7.3，接入種子液2 mL，30 ℃180 r·min培養(yǎng)24 h，每個處理3 次重復(fù)，根據(jù)活菌數(shù)確定最佳無機鹽種類。配置不同濃度的無機鹽培養(yǎng)基，其中牛肉膏0.3 g、蛋白胨1.0 g，無機鹽為經(jīng)優(yōu)化確定的最佳無機鹽，質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%，調(diào)節(jié)pH 值為7.3，接種量為2%，30 ℃180 r·min培養(yǎng)24 h，每個處理3 次重復(fù)，統(tǒng)計活菌數(shù)并確定最適無機鹽濃度。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，分別選擇牛肉膏、麩皮和氯化鉀作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和無機鹽，以其在單因素試驗中確定的濃度為標準，分別設(shè)定3 個不同的濃度，用3 因素3 水平的正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基的主要成分，得到最佳的培養(yǎng)基組成成分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用Excel 2010 和SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用LSD 法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的篩選

從周口市太康縣種植西瓜的土壤中采用稀釋涂板法分離純化得到82 個菌株，通過平板對峙法篩選獲得對西瓜果斑病病原菌有拮抗作用的16 個菌株。對這16 個菌株采用抑菌圈法測定抑菌效果，結(jié)果如表1 所示，菌株HP-24 的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到2.40 cm（圖1）。顯著高于其他菌株的抑菌圈直徑。

表1 菌株抑菌圈大小

圖1 菌株HP-24 對西瓜果斑病病原菌的抑菌圈

2.2 盆栽防效的測定

盆栽試驗結(jié)果（表2）表明，菌株HP-24 對西瓜細菌性果斑病具有較好的防治效果。在接種細菌性果斑病病原菌后7 d，對照組的病情指數(shù)為62.03，而菌株HP-24 處理的西瓜苗病情指數(shù)為14.44，與對照組相比，發(fā)病率顯著降低了73.01%，其防治效果達76.72%。

表2 菌株HP-24 對西瓜細菌性果斑病的防治效果

2.3 生防菌的鑒定

如圖2 所示，HP-24 菌株的菌落呈白色，近圓形，表面突起有褶皺，不透明，在顯微鏡下觀察呈桿狀，產(chǎn)芽孢，芽孢卵圓形。革蘭氏染色為陽性，生理生化特性為接觸酶陽性，明膠水解陽性，淀粉水解陽性，卵磷脂酶反應(yīng)陰性，甲基紅試驗陰性，VP 試驗反應(yīng)陽性，檸檬酸鹽利用為陽性。

圖2 菌株HP-24 菌落形態(tài)

將HP-24 的16S rRNA 序列通過BLAST 軟件進行同源性比較，選取同源性較高的參考菌株16S rRNA 序列，通過MEGA6 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。菌株HP-24 為芽孢桿菌屬，且與貝萊斯芽孢桿菌（）親緣關(guān)系較近（圖3）。

圖3 根據(jù)HP-24 菌株16S rRNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.4 有菌與無菌發(fā)酵液抑菌效果測定

不同的發(fā)酵液對病原菌的抑制效果如圖4 所示，有菌發(fā)酵液及菌體對病原菌有抑制作用，而無菌發(fā)酵液對病原菌無抑制作用。

圖4 有菌發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液及菌體對病原菌的抑制作用

2.5 不同濃度發(fā)酵液的抑菌效果測定

菌株HP-24 的不同濃度菌液對病原菌的抑制作用如表3 所示，結(jié)果表明高濃度的發(fā)酵液抑菌效果最好，隨著稀釋倍數(shù)的增加，抑菌圈直徑逐漸變小，說明發(fā)酵液菌液濃度越高，抑菌效果越好。

表3 不同濃度發(fā)酵液抑菌圈的大小

2.6 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.6.1 碳源的優(yōu)化 如圖5 所示，當(dāng)牛肉膏為唯一碳源時，菌株生長最好，培養(yǎng)24 h 后活菌數(shù)最高，且顯著高于其他碳源條件下的活菌數(shù)，即最適碳源為牛肉膏。圖6 為當(dāng)牛肉膏為唯一碳源時，不同濃度的牛肉膏對菌株生長的影響。結(jié)果顯示，不同濃度的碳源對菌株生長影響差異顯著，當(dāng)牛肉膏的質(zhì)量分數(shù)為0.9%時，發(fā)酵液中菌落數(shù)顯著高于其他濃度牛肉膏中的菌落數(shù)，即最適碳源為0.9%的牛肉膏。

圖5 不同碳源對菌株生長的影響

圖6 牛肉膏濃度對菌株生長的影響

2.6.2 氮源的優(yōu)化 如圖7 所示，當(dāng)?shù)礊辂熎r，發(fā)酵液中活菌數(shù)最高，且顯著高于其他氮源條件下的菌落數(shù)。其次是蛋白胨和酵母粉的混合物，蛋白胨和酵母粉的混合物作為氮源時，效果較單一的蛋白胨或酵母粉要好。當(dāng)?shù)礊槟蛩貢r，菌株發(fā)酵液中活菌數(shù)最低，即最佳氮源為麩皮。圖8 為麩皮為唯一氮源時，不同濃度的麩皮對菌株生長的影響。由圖8 可以看出，在供試濃度范圍內(nèi)，當(dāng)麩皮的質(zhì)量分數(shù)為1.2%時，發(fā)酵液中的活菌數(shù)顯著高于其他麩皮濃度，當(dāng)濃度偏高或偏低時均不利于菌株的生長，即最適氮源為1.2%的麩皮。

圖7 不同氮源對菌株生長的影響

圖8 麩皮濃度對菌株生長的影響

2.6.3 無機鹽的優(yōu)化 無機鹽優(yōu)化結(jié)果如圖9 所示，當(dāng)無機鹽為氯化鉀時，菌株發(fā)酵液中的活菌數(shù)最高，且與無機鹽為氯化鈉、磷酸二氫鉀相比活菌數(shù)差異顯著，即最佳無機鹽為氯化鉀。圖10 為當(dāng)氯化鉀為唯一無機鹽時，不同濃度的氯化鉀對菌株生長的影響。當(dāng)氯化鉀的質(zhì)量分數(shù)為0.7%時，菌株發(fā)酵液中活菌數(shù)顯著高于其他氯化鉀濃度，即最適無機鹽為0.7%的氯化鉀。

圖9 不同無機鹽對菌株生長的影響

圖10 氯化鉀濃度對菌株生長的影響

2.6.4 正交試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果選擇最佳碳源、氮源及無機鹽，對影響發(fā)酵液菌落數(shù)的最適碳源、氮源及無機鹽各因素按不同濃度進行正交試驗（表4），用3 因素3 水平的正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基的主要成分，得到最佳培養(yǎng)基組成。

表4 L9（3×3）正交試驗因素水平

根據(jù)正交試驗結(jié)果比較3 種因素的R 值可知B>A>C（表5），因此，影響發(fā)酵液菌落數(shù)多少的主次因素依次為麩皮濃度>牛肉膏濃度>氯化鉀濃度。為確定各因素對試驗結(jié)果的影響，對正交試驗進行方差分析。結(jié)果如表6 所示，牛肉膏、麩皮濃度對發(fā)酵液菌落數(shù)的影響顯著，氯化鉀濃度對菌落數(shù)影響不顯著。根據(jù)正交試驗結(jié)果得出的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為A3B3C2，即牛肉膏1.0%，麩皮1.3%，氯化鉀0.7%。

表5 正交試驗結(jié)果

表6 正交試驗結(jié)果方差分析

2.6.5 正交試驗結(jié)果驗證 當(dāng)培養(yǎng)基組成為牛肉膏1.0%、麩皮1.3%、氯化鉀0.7%時，在30 ℃180 r·min條件下，培養(yǎng)24 h 后測菌落數(shù)為1.17×10CFU·mL。

3 討論與結(jié)論

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，隨著環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及抗藥性等問題的產(chǎn)生，生物防治技術(shù)在農(nóng)業(yè)病蟲害防治中的應(yīng)用越來越受到青睞。目前，許多有益微生物已應(yīng)用于植物病害的生物防治中，而植物根際中的微生物在植物的生長發(fā)育和抵御病害的過程中起著重要重用，具有巨大的開發(fā)價值。國內(nèi)外關(guān)于植物根際微生物防治植物病害的報道很多。芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，是植物病害生物防治中應(yīng)用較為普遍的生防細菌。其中貝萊斯芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一個新種，與枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌親緣關(guān)系密切，目前已有利用貝萊斯芽孢桿菌防治花生白絹病、棉花枯萎病、辣椒疫霉病、西瓜枯萎病等多種植物病害的報道。然而，未見有利用貝萊斯芽孢桿菌防治細菌性果斑病的報道。本試驗篩選到一株對西瓜細菌性果斑病致病菌具有抑制作用的貝萊斯芽孢桿菌HP-24，為細菌性果斑病的生物防治提供了新的菌種資源。芽胞桿菌的防病機制一般包括代謝產(chǎn)物含抗菌物質(zhì)、寄生于病原菌與之競爭營養(yǎng)和空間、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性等。謝心悅等研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌BJ-10 的無菌發(fā)酵液稀釋5 倍后對甜瓜細菌性果斑病的防效仍能達到87.5%。而筆者研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌HP-24 的無菌發(fā)酵液對細菌性果斑病病原菌無抑制作用，菌株HP-24 所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可能為胞內(nèi)代謝產(chǎn)物；此外，生防菌與病原菌之間進行營養(yǎng)和空間的競爭，也會導(dǎo)致對病原菌的抑制作用，產(chǎn)生抑菌圈，具體的抑制機制有待進一步研究。

筆者結(jié)合平板對峙試驗和盆栽試驗，篩選到西瓜細菌性果斑病的拮抗菌株貝萊斯芽孢桿菌HP-24。該菌對西瓜細菌性果斑病病原菌的抑菌圈直徑可達到2.40 cm，盆栽防效為76.72%，可作為西瓜細菌性果斑病的生物防治菌株。另對生防菌株HP-24 的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到菌株最優(yōu)培養(yǎng)基組成為牛肉膏1.0%、麩皮1.3%、氯化鉀0.7%，優(yōu)化后的菌株HP-24 培養(yǎng)基組成可顯著提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)量，為后期生防菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌HP-24 在防治西瓜細菌性果斑病方面具有極大的潛力，可以為細菌性果斑病的防治提供菌株資源。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化也為生防菌劑的后續(xù)開發(fā)提供了技術(shù)支撐。