我國瓜類細菌性果斑病研究新進展

季葦芹，葉云峰，張愛萍，楊玉文，關(guān) 巍，趙廷昌

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所·植物病蟲害生物學國家重點實驗室 北京 100193； 2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所 南寧 530007； 3.新疆生產(chǎn)建設兵團第六師農(nóng)業(yè)科學研究所 新疆五家渠 831300）

瓜類細菌性果斑病（Bacterial fruit blotch，BFB）是一種主要危害西瓜和甜瓜的毀滅性細菌病害，于20 世紀末傳入我國，最早報道于陜西省，隨后在許多省份相繼報道。目前，BFB 在我國的新疆、海南、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林等10 余個省份均有發(fā)生，造成嚴重的經(jīng)濟損失，僅海南每年的損失就達5 億元（2021 年西甜瓜產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟大會報告）。由于BFB 發(fā)病快、傳播迅速，而且缺乏有效的抗病品種和針對性防治藥劑，因此使其在生產(chǎn)上難防難治，嚴重阻礙了西瓜、甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。BFB 已被列入我國進境植物檢疫性有害生物名錄及全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單。

近年來，國內(nèi)外對BFB 開展了大量的研究，國內(nèi)5 年以前的研究進展已有研究者進行了相關(guān)綜述，因此筆者整理歸納了近5 年我國對BFB 的研究新進展，以期為制定瓜類細菌性果斑病綜合防治策略提供參考，并為今后研究工作的開展提供思路和方向。

1 病原、癥狀及發(fā)病規(guī)律

1.1 病原菌及其寄主范圍

細菌性果斑病的病原菌為西瓜噬酸菌（），屬于革蘭氏陰性菌。西瓜噬酸菌主要危害葫蘆科作物，對西瓜、甜瓜、苦瓜的致病力極強，侵染率可達到100%；對南瓜、西葫蘆、絲瓜、黃瓜的致病力也較強，但病斑擴展速度不同；對番茄、白菜、辣椒、豇豆不致病。種內(nèi)主要分為2個亞組，不同組菌株在基因組水平上存在差異，在寄主范圍上也表現(xiàn)出明顯的偏好性，Ⅱ組菌株主要分離自西瓜，而Ⅰ組菌株主要分離自除西瓜外的其他葫蘆科作物，如甜瓜、黃瓜、葫蘆、瓠瓜等。

1.2 病害癥狀

瓜類細菌性果斑病可在作物的整個生長發(fā)育期發(fā)生。子葉受害時，初期形成水漬狀病斑，隨后擴延至子葉基部，嚴重時會沿葉脈發(fā)展成黑褐色壞死病斑。真葉受害時，葉片出現(xiàn)水漬狀斑點，病斑受葉脈限制而呈現(xiàn)多種形狀，病斑周圍略微發(fā)黃，但無明顯凹陷和暈圈，多個病斑可融合成大斑且變褐色，嚴重時整個植株枯萎，但葉片不脫落；莖部受害時，常形成凹陷斑，并能分泌菌膿，導致瓜蔓腐爛；果實上的典型病癥是向陽面果皮上出現(xiàn)水浸狀小斑點，逐漸擴大為不規(guī)則的水浸狀斑塊，漸變褐，稍凹陷，后期多龜裂，隨著病原菌向果肉擴展，果肉呈水浸狀腐爛或棉絮狀壞死，流出黏稠的臭味菌膿，隨流水飛濺，可造成二次侵染（圖1）。

圖1 瓜類細菌性果斑病在西瓜及甜瓜上的危害癥狀

1.3 發(fā)病規(guī)律

種子帶菌是BFB 的主要初始侵染源。病菌可附著在種子表面，隨種子的萌發(fā)從傷口或氣孔侵染子葉，引起幼苗發(fā)病，并隨雨水、灌溉水、昆蟲及農(nóng)事操作傳播擴散，形成多次再侵染。發(fā)病瓜是帶菌種子的重要來源，附著在種子或土壤病殘體上越冬的病原菌在來年再次引起侵染，進而形成惡性循環(huán)。此外，受BFB 污染的葫蘆科砧木種子也是引起B(yǎng)FB 傳播的重要傳染源。

BFB 在高溫高濕的環(huán)境中易暴發(fā)流行，特別是炎熱季節(jié)伴隨暴風雨的條件，有利于病原菌的繁殖和傳播。BFB 最適發(fā)病溫度為25～32 ℃，在24～28 ℃條件下接種1 h 后就能侵入葉片。另外，地勢低洼、排水不良、多年連作、密度過大、管理粗放的地塊發(fā)病嚴重。

1.4 病原菌鑒定方法

近年來，主要通過病害癥狀觀察、菌落形態(tài)觀察、生理生化特性測定、病原菌血清學鑒定、16S rRNA/rDNA 測定、特異性引物鑒定、煙草過敏反應測定、致病性測定、亞群鑒定等方法，對BFB 病原菌進行鑒定。利用這些方法能夠準確、便捷地鑒定出病原菌是否為，以及所屬亞組，為生產(chǎn)上對該病的識別及針對性治理提供重要依據(jù)。

2 致病機制

研究的致病機制是了解病原-寄主互作過程、研發(fā)靶向藥劑及制定環(huán)境友好型高效防治策略的重要基礎。近年來，對致病機制的研究主要集中在三型分泌系統(tǒng)（type Ⅲsecretion system，T3SS）、六型分泌系統(tǒng)（type Ⅵsecretion system，T6SS）、鞭毛、生物膜、調(diào)控因子、群體感應系統(tǒng)和細胞代謝過程等方面。

T3SS 廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，在病原菌致病過程中至關(guān)重要。毛云等利用生物信息學，分析了3 個三型（hypersensitive response and pathogenicity）蛋白和6 個未知蛋白的理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)，為后續(xù)對這些蛋白的研究奠定了基礎。在基因功能方面，T3SS 分泌裝置基因、結(jié)構(gòu)基因和（-associated）基因及的缺失會顯著減弱致病力并影響致病相關(guān)表型。在調(diào)控方面，Zhang 等發(fā)現(xiàn)基因和是T3SS 的關(guān)鍵調(diào)控基因，調(diào)控下游基因的表達，且在上游正向調(diào)控的表達。在三型效應蛋白（T3Es）的篩選與鑒定方面，目前篩選到的T3Es 有Ace1、Ace0201、AopN 和AopP。其中，Ace1 和Ace0201 均可抑制本氏煙的細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）及活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)，促進對寄主西瓜發(fā)揮致病作用。AopN 能顯著抑制ROS 爆發(fā)并誘導細胞程序性死亡，與西瓜的Cl-HIPP 和ClLTP 蛋白互作；AopP 可通過抑制蛋白ClWRKY6 來抑制西瓜的免疫反應。隨著研究的深入，針對T3SS 抑制劑的研發(fā)將為BFB 精準防治開辟道路。

T6SS 影響細菌間的相互競爭，也是導致病原菌產(chǎn)生毒力的原因之一。基因是T6SS 的重要組成部分，也是T6SS 介導毒力作用的關(guān)鍵因子。研究表明，的3 個基因（//）和4 個同 源 基 因（///）在T6SS 介導的病原菌毒力作用中發(fā)揮重要作用，影響毒力和抗菌活性。

鞭毛是病原菌的重要運動器官，鞭毛可促進病原菌對寄主細胞的黏附與侵襲，在致病過程中起重要作用。研究表明，鞭毛基因、及鞭毛轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對鞭毛絲的形成、游動性、菌膜形成能力、黏附能力、生長速率、致病性等具有調(diào)控作用。同時，研究鞭毛基因和趨化性核心基因時發(fā)現(xiàn)，趨化性核心基因通過調(diào)控鞭毛運動影響的運動能力。

細菌生物膜與其致病性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素可以影響生物膜的形成，以LB（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）為培養(yǎng)基、聚苯乙烯孔板為載體，初始pH 值為7、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)時間24 h、葡萄糖濃度為30.0 mmol·L時，的生物膜形成能力最強。

脂多糖運輸系統(tǒng)（lipopolysaccharide transport system，Lpt）將胞內(nèi)裝配完整的脂多糖運輸?shù)酵饽?，實現(xiàn)脂多糖的阻滲、有機溶劑和疏水性抗生素耐受性、膜通透性等功能?；虼鼐幋a的Bam 復合體為Lpt 的重要組成，基因和缺失降低了的生物膜形成能力和胞外多糖產(chǎn)生能力，使蛋白酶活性增強，從而直接影響細胞外膜合成。

調(diào)控因子作為調(diào)控樞紐，調(diào)控病原菌的生長、致病等多項生命活動，保障病原菌的生存、生長和繁殖，是解析病原菌致病過程不可缺少的研究對象。研究發(fā)現(xiàn)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因在致病過程中具有重要作用；環(huán)境應激調(diào)控因子和血紅素氧化酶（heme oxygenase）基因缺失可顯著減弱的生長、運動和致病能力；紅光受體蛋白和缺失可減弱在光照條件下的生長和致病能力，中的GTP 結(jié)合蛋白HflX 可通過調(diào)控等T3SS 關(guān)鍵基因參與對寄主的定殖和侵染。MarR 家族轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控的表達及生物膜形成來影響的致病能力。這些調(diào)控因子雖然功能各不相同，但都不同程度地參與了調(diào)控的致病過程。

群體感應系統(tǒng)是病原菌為應對外界環(huán)境變化對自身進行的調(diào)控，與病原菌的生長發(fā)育和致病過程密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，群體感應系統(tǒng)中LuxR 家族轉(zhuǎn)錄因子AryR 和AclR 對的運動性、致病力、生物膜形成以及生長能力都有影響，而轉(zhuǎn)錄因子AcrR 能特異性地調(diào)控鞭毛的形成，在生長模式調(diào)節(jié)中具有重要作用。環(huán)二鳥苷酸（cyclic diguanylate,c-di-GMP）代謝是群體感應過程中重要的信號傳遞系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)c-di-GMP 代謝相關(guān)基因缺失可顯著降低致病力、生物膜形成能力和生長能力，減弱運動能力及在非寄主煙草上的過敏性反應能力。

鐵代謝和銅代謝都是病原菌中的重要代謝過程，鐵/銅代謝紊亂不利于病原菌的生存，是研制靶向防治藥劑的重要靶標。研究表明，中鐵吸收調(diào)控因子（ferric uptake regulator,Fur）缺失后，顯著降低產(chǎn)鐵載體能力、致病力以及對Fe和HO的耐受能力，使鐵離子調(diào)控機制紊亂。中可能存在與大腸桿菌（）等相似的銅離子外排系統(tǒng)（Cue 系統(tǒng)），且轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和銅代謝相關(guān)基因缺失均顯著降低抗銅能力，是銅代謝過程中重要的功能基因。

在病原-寄主互作過程方面，張艷艷等發(fā)現(xiàn)不同亞組的西瓜噬酸菌菌株侵染相同寄主時引起的植物感病途徑不同。優(yōu)麗圖孜·乃比等對西瓜噬酸菌-黃瓜互作體系進行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，接種48 h 后，中致病相關(guān)基因顯著富集在群體感應及細菌趨化性途徑，且群體感應系統(tǒng)基因下調(diào)更顯著。寄主黃瓜以Ca信號激活的防御反應為主應對侵染，苯丙氨酸裂解酶基因和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因在此過程中發(fā)揮重要作用。

此外，黃成文等發(fā)現(xiàn)載體pBBR1MCS-5 對菌株FC440 的生物學特性未表現(xiàn)出顯著影響，而載體pHC60 則會影響FC440 的生長速率及游動能力。這為遺傳改良過程中選擇合適的表達載體提供了重要基礎。

3 防治技術(shù)

近年我國對BFB 防治技術(shù)的研究主要集中在檢疫檢測、化學藥劑防治、生物防治、抗病育種以及農(nóng)業(yè)管理措施等方面。

3.1 檢疫檢測

BFB 可通過帶菌種子、幼苗進行遠距離傳播，植物檢疫是BFB 防控的第一道防線。針對我國BFB 防控形勢，應推進疫情分區(qū)防控，加強種子及砧木檢疫監(jiān)管，強化監(jiān)測預警，建立聯(lián)防聯(lián)控工作機制。

Tian 等于2010—2018 年間檢測了我國13 個主產(chǎn)區(qū)的4839 份商品西瓜和其他瓜類種苗攜帶的情況，發(fā)現(xiàn)樣本總體帶菌率為18.00%。不同年份樣本帶菌率在6.71%～40.76%之間。種子檢測是預防果斑病發(fā)生的首要環(huán)節(jié)，因此建立快速、簡便、靈敏的帶菌種子檢測方法非常重要。

當前國內(nèi)對帶菌種子的檢測主要有PCR、血清學檢測、試紙條等方法。Yang 等根據(jù)基因設計了引物BFB/BFB1/BFB2/BFB3，可通過普通PCR區(qū)分不同亞組菌株。Bi 等利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）實現(xiàn)與CGMMV等病原的多重檢測。閆莉春根據(jù)基因設計了特異性引物AC-F/AC-R，可區(qū)分和其他近緣種燕麥噬酸菌等，靈敏度為10CFU·mL。闞玉敏等利用Bio-PCR 篩選出對特異性最好的引物SEQID4m/SEQID5。李菊芬等認為帶菌種子用無菌水振蕩培養(yǎng)3 h 后進行PCR 擴增，操作簡單且特異性最好，建議普通PCR 選用BX-L1/BX-SR2 引物，RT-qPCR 選用SEQID4m/SEQID5 引物。將RT-qPCR 應用于微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）檢測，可提高檢測靈敏度。趙子婧等應用ddPCR 建立了同時檢測瓜類種子攜帶和黃瓜角斑病菌（pv.）的方法，混合菌懸液和DNA 的最低檢出限分別為10CFU·mL和10ng·μL，可檢測到帶菌率0.2%（=500）的西瓜、甜瓜種子樣品，優(yōu)于RT-qPCR 法。

血清學檢測也是常用的BFB 檢測方法。Kuo等利用改造的綠色熒光蛋白GfED 與IGg 的結(jié)合開發(fā)出一種血清學檢測法，操作簡單，速度快，結(jié)果肉眼可見。

在實際檢測中，試紙條由于操作簡便、耗時短，不需設備和復雜程序，可實現(xiàn)BFB 的快速檢測和初步篩選。Zeng 等開發(fā)的異硫氰酸熒光素免疫試紙條，可快速、靈敏地檢測。薛娟娟建立了一種檢測限為1×10CFU·mL的免疫層析分析（ICA）檢測法，與黃瓜細菌性角斑病菌無交叉反應，特異性較好。Fang 等開發(fā)的免疫層析熒光試紙條可在和等的雜交細胞中檢測到，結(jié)果準確而用時短。曾海娟等制備了一種檢出限為3.1×10CFU·mL的檢測熒光免疫層析試紙條，提供了新的快速檢測方法。周佩等發(fā)現(xiàn)中國檢驗檢疫科學研究院研制的BFB 膠體金檢測試紙條和市場上已商品化但價格較貴的美國Agdia 公司的同類試紙條的靈敏度和特異性相當，適用于檢測出現(xiàn)疑似果斑病癥狀的葉片和果實，也可用于種子帶菌檢測，但易受種子包衣劑或處理藥劑的影響，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

由于不適的溫度條件（如溫湯浸種或低溫儲存）和藥劑（如銅離子制劑）處理可誘導進入VBNC 狀態(tài)（有活力但不可培養(yǎng)狀態(tài)），建議運用多種檢測方法進行種子帶菌檢測和病害診斷，避免由菌量低或進入VBNC 狀態(tài)導致的假陰性結(jié)果。

3.2 種子處理

種子處理是預防BFB 的有效措施。對種子進行適宜溫度及時間的干熱處理（如60 ℃處理甜瓜種子6、8 d 及60 ℃處理西瓜種子12 d）或溫湯浸種，可顯著抑制帶菌種子和幼苗的發(fā)病率；控制發(fā)酵溫度不能減少對種子感染，減少發(fā)酵時間才是減少病菌增殖感染種子的防控關(guān)鍵。此外，西瓜汁發(fā)酵可能不是有效降低傳播的方法。

用鹽酸、過氧乙酸等藥劑，特別是殺菌劑1 號處理種子，對BFB 均有很好的防治效果。楊奎等發(fā)現(xiàn)包衣成分BF 配方肥+硫酸銅對BFB 有良好防效，且可促進幼苗生長。

3.3 化學防治和生物防治

化學防治是現(xiàn)階段BFB 防治的主要手段。不同殺菌劑對的毒力差異較大，同一殺菌劑在離體和活體試驗中的結(jié)果也不同。在發(fā)病前或發(fā)病初期，可選用適宜濃度的雙氧水、蘇納米、過氧乙酸、BX6、四霉素、乙蒜素、氫氧化銅、氧化亞銅、溴硝醇、春雷·王銅、噻霉酮等藥劑進行噴霧防治，但要注意用量，避免藥害。比較幼苗發(fā)病前預防和發(fā)病后防治的效果發(fā)現(xiàn)，提前預防能較好地控制病害。

生物防治方面，目前畢赤酵母菌（）0732-1 代謝產(chǎn)物乙酸、枯草芽孢桿菌（）9407、皺紋假單胞菌（）S58、熒光假單胞菌（）和溶磷伯克氏菌（sp.）N3等對有良好防效。

3.4 抗病育種

選育抗性品種是防控BFB 最經(jīng)濟、有效的途徑。近年來，國內(nèi)不斷挖掘抗性基因和篩選抗性材料，為抗病品種的選育奠定了基礎。

在抗性基因挖掘方面，葛宗燦等發(fā)現(xiàn)基因Ⅰ不是無毒基因，不能起到作用；俞志杰等在甜瓜上篩選出1 對與抗性基因連鎖的標記BCM184，遺傳距離為12.4 cM，初步定位到連鎖群Ⅳ上；魯思夢等在甜瓜上篩選出1 個BFB 抗性數(shù)量性狀位點，位于CMMS35-4 與DE1851 之間，為后續(xù)利用抗性品種進行品種改良提供了理論依據(jù)。

在抗性材料篩選方面，劉夢華等將菌株LG08 接種到50 份甜瓜材料上，發(fā)現(xiàn)薄皮甜瓜系列和玉菇類型對有相對較強的抗性，哈密瓜類型易感病。羅群等將菌株XS0901 接種到50 份瓠瓜材料上，發(fā)現(xiàn)沒有對BFB高抗或免疫的瓠瓜品種，且市場商品性最優(yōu)的勻棒瓠瓜（608）和其他江浙主栽品種對BFB 的抗性較差，瓠瓜新品種浙蒲9 號對BFB 表現(xiàn)中抗。

3.5 農(nóng)業(yè)管理措施

科學合理的農(nóng)業(yè)管理措施是BFB 防治的重要手段，主要包括：選擇3 年內(nèi)無病的通風良好、排灌方便的砂性壤土；在露水干后進行農(nóng)事操作，工具、操作人衣物和手部需消毒；起壟栽培，使用滴灌，嚴禁大水漫灌，果實膨大期及成瓜后少澆或不澆水；及時通風排濕；及時將病株帶出棚外深埋作無害化處理；合理施肥，不偏施氮肥；與非葫蘆科作物進行3 年以上輪作，或水旱輪作倒茬。洪纖纖等在與西瓜套種的甘薯上分離出了，因此套種非寄主作物有可能無法隔絕BFB 在西瓜植株間的傳播。

4 展 望

近年來，由于生產(chǎn)上對BFB 高效防治的迫切需求，科研工作者對BFB 開展了大量研究，并取得了很大進展。在病原菌鑒定與檢測方面，技術(shù)和設備的飛速發(fā)展，使病原鑒定和檢測實現(xiàn)操作方便、結(jié)果即測即得和可視化，為生產(chǎn)上BFB 的快速檢測奠定了堅實基礎。在致病機制方面，通過對病原菌分泌系統(tǒng)、群體感應、毒力因子、細胞代謝的研究，以及對病原-寄主互作過程的研究，初步解析了的致病機制，但具體的致病機制尚未明確，還有許多問題尚待研究解決。

在病害防控方面，研究主要集中在種子處理、種苗保護、病苗治療及抗性材料選育等方面。目前生產(chǎn)上多以化學藥劑防治措施為主，缺乏針對性，存在藥物過量使用甚至濫用的問題，加重了環(huán)境負擔以及導致病原菌抗藥性增強的風險。在研究過程中，雖然篩選了許多有效的化學藥劑和一些防效較好的生防菌株，但是環(huán)境友好型藥劑研制、病原菌抗藥性以及生防菌株對環(huán)境的適應性和效果穩(wěn)定性等仍是未來亟需攻克的難題。由于BFB 為種傳病害，隨著種苗商品化的發(fā)展，病原菌流動性風險增強。因此，加強種子和幼苗的檢疫檢驗、阻斷帶菌種子的流通能有效阻斷BFB 的跨地區(qū)傳播；加強農(nóng)田管理，采用科學的綜合防控措施，可有效降低BFB 在田間的傳播。

總之，為實現(xiàn)BFB 的高效防治，仍需進一步開展致病機制的研究以及商品化抗性品種選育等工作。