木姜子揮發(fā)油成分分析及抑菌活性研究

陳彥宏, 張鑫瑤, 陳旺, 肖漢永, 周莉君

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625000

木姜子（Litsea pungensHemsl.）是樟科木姜子屬落葉小喬木，主要分布在我國南方和西南地區(qū)，兩湖、川、桂、貴、云、甘、豫、陜等地均有野生資源分布[1]。木姜子屬的植物種類眾多，但成分都比較類似，往往富含黃酮類和萜類化合物，尤其是單萜和倍半萜是該屬植物中豐富的生物活性成分[2]。作為我國傳統(tǒng)的本土藥材，木姜子被用于治療風(fēng)寒濕痛、跌打腫痛、產(chǎn)后水腫和寒邪等[3]。木姜子的果和葉能健脾，可治療消化不良、腹瀉、中暑，以及作為外用止痛藥；莖能治療胃脹；根可止痛以及治療胃痛和關(guān)節(jié)痛[4,5]。它的葉、花和果都富含揮發(fā)油，可作為食用香精和化妝香精，應(yīng)用廣泛。張振杰等從秦嶺太白山的木姜子葉中檢測到1,3,3 -三甲基-乙-氧雜雙環(huán)[2,2,2]辛烷和l,8-桉油醇等成分[6]。曾朝懿等分別采用水蒸氣蒸餾法、超聲輔助法、微波輔助法和超臨界CO2萃取法提取并測定木姜子花蕾的揮發(fā)油成分，發(fā)現(xiàn)4種方法所得成分有差異但主成分一致，含量最高均為檸檬醛和檸檬烯[7]。這些成分使他們具有了良好的殺蟲[8,9]、化感[10]等生物活性，但目前對(duì)于木姜子揮發(fā)油抑菌活性和機(jī)理的研究卻比較少。而對(duì)其同屬植物山蒼子的抑菌研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子對(duì)多種病原菌具有良好的抑制作用[11-13]。

果生刺盤孢菌（Colletotrichumz fructicola）是引起油茶炭疽病的優(yōu)勢致病菌，分布范圍極廣[14,15]。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）是一種危害嚴(yán)重的土傳病原真菌，可侵染上百種具有重要價(jià)值的作物，引起作物枯萎導(dǎo)致根腐病，是世界十大植物病原真菌之一[16]。目前對(duì)于這些常見病原菌的防治主要以化學(xué)防治為主，但長期使用化學(xué)防治會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染和對(duì)人畜健康安全的隱患。我國主要的農(nóng)藥市場仍然是化學(xué)農(nóng)藥市場，但生物農(nóng)藥的利潤增長率已有超過化學(xué)農(nóng)藥的趨勢[17]。利用植物次生代謝產(chǎn)物開發(fā)生物農(nóng)藥具有低毒、環(huán)保、高效的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)得到廣泛的重視。

為了充分開發(fā)利用木姜子資源，采用水蒸氣蒸餾法提取木姜子果實(shí)的揮發(fā)油（LPO），采用GCMS分析其化學(xué)成分，并測定其對(duì)果生刺盤孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌活性，以期為木姜子揮發(fā)油作為生物農(nóng)藥和食品保鮮劑的開發(fā)提供參考。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料：2019年9月在四川省洪雅縣采集成熟、完好的木姜子鮮果，清洗后陰干備用。

菌種：果生刺盤孢菌和尖孢鐮刀菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)提供。

無水硫酸鈉為市售分析純，吐溫-20為市售化學(xué)純（均購于成都科隆化工試劑廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）揮發(fā)油提取

將新鮮木姜子果實(shí)陰干后磨成細(xì)粉，用水蒸氣蒸餾法[18]提取6 h。靜置和分層后，添加無水硫酸鈉以去除水分，所獲得的精油在4°C下儲(chǔ)存于棕色瓶中。按以下公式計(jì)算精油的提取率：

（2）GC-MS分析

精油用正己烷稀釋至10 μL·mL-1，并用正己烷作為空白對(duì)照。

氣相色譜條件:分析柱：HP-5MS柱子；升溫程序：設(shè)定初始溫度為60°C， 保持6 min，以12°C·min-1升溫速度升至100°C，保持5 min；以10°C·min-1升至160°C，保持5 min；再以12°C·min-1升至280°C保持5 min。載氣為氦氣，進(jìn)樣量：1 μL，分流50∶1，進(jìn)樣口溫度為260°C，接口溫度220°C。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1.5 KV，質(zhì)量掃描范圍40~550 amu，全掃描，進(jìn)樣量1 μL。

數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索：通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀提供的 NIST MS 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析確定其組成成分, 并通過峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)含量。

（3）抑菌試驗(yàn)

選擇菌絲生長速率法[19]，將已經(jīng)配置好的PDA培養(yǎng)基融化，等待其溫度降低至40-50°C時(shí)，將揮發(fā)油用適量的吐溫-80配置成50 mg·mL-1，再與PDA培養(yǎng)基混勻稀釋成系列濃度，使其最終濃度為2.5、3.75、5、7.5、10、15和20 mg·mL-1，混合后倒板，等待其凝固后，將已活化的兩種病原菌的菌餅（直徑為6 cm）接入培養(yǎng)基，各濃度進(jìn)行重復(fù)3次接種，以普通PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組（CK），以加入吐溫-80的板為陰性對(duì)照組，放置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。以48 h為起始點(diǎn)，每隔24 h觀察記錄1次，用十字交叉法測量菌落直徑（mm），計(jì)算出3次的平均值，將所得的數(shù)據(jù)通過以下公式計(jì)算菌絲生長抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 木姜子揮發(fā)油的成分分析

SD法提取的木姜子揮發(fā)油（LPO）得率為1.6%（v/w），密度為0.89g·mL-1。對(duì)木姜子揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，總離子流色譜圖見圖1。對(duì)各峰質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，參考標(biāo)準(zhǔn)圖譜和相關(guān)文獻(xiàn)確定化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。由表1可知，木姜子揮發(fā)油中共鑒定出19個(gè)成分，主要是單萜類、倍半萜類及其含氧衍生物。其中含量最高的是檸檬烯（29.20%）、檸檬醛（30.10%）、芳樟醇（6.45）和桉葉素（5.65%）等單萜烯類和單萜類物質(zhì)。

2.2 木姜子揮發(fā)油的抑菌活性

木姜子揮發(fā)油對(duì)果生刺盤孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌效果見圖2。結(jié)果表明，在20 mg·mL-1時(shí)，96 h以內(nèi)木姜子揮發(fā)油對(duì)兩種真菌具有100%的抑菌效果，隨著濃度降低和時(shí)間增加，抑菌效果逐漸下降。48 h內(nèi)對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果強(qiáng)于對(duì)果生刺盤孢菌。72 h后，在高濃度時(shí)（10~20 mg·mL-1）時(shí)對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果更好，在低濃度（2.5~7.5 mg·mL-1）時(shí)對(duì)果生刺盤孢菌的抑菌效果更好?？梢娔窘訐]發(fā)油對(duì)2種病原菌均有良好的抑菌效果。

3 結(jié)論與討論

采用水蒸氣蒸餾法提取洪雅產(chǎn)木姜子鮮果的揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)其富含單萜類化合物（46.98%）和單萜烯類化合物（42.32%），主要以檸檬烯、檸檬醛和芳樟醇為代表。根據(jù)Jiang[8]的研究表明，木姜子的揮發(fā)油以單萜類和倍半萜類成分含量最高。這和我們的研究結(jié)果有所差異，可能是由于品種、生長環(huán)境或者生長年份和收獲季節(jié)的不同造成的。

圖1 GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram （TIC） of GC-MS

表1 木姜子揮發(fā)油化學(xué)成分分析Tab.1 Chemical composition of LPO

通過菌絲生長速率法測試LPO對(duì)果生刺盤孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)LPO對(duì)2種病原真菌均有良好的抑菌活性，并表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，隨著時(shí)間延長和濃度減少，抑菌效果逐漸降低。揮發(fā)油的抑菌效果一般認(rèn)為是多種成分的協(xié)同作用。，隨著時(shí)間延長和濃度減少，抑菌效果逐漸降低。揮發(fā)油的抑菌效果一般認(rèn)為是多種成分的協(xié)同作用。LPO的主成分檸檬醛（30.10%）、檸檬烯（29.20%）、芳樟醇（6.45）、桉葉素（5.65%）、α-蒎烯（4.06%）和β-蒎烯（3.08%）都被報(bào)道過抑菌活性。Chang等人發(fā)現(xiàn)檸檬烯、α和β-蒎烯對(duì)腐皮鐮孢菌和尖孢鐮刀菌具有殺菌活性[20]。檸檬醛被報(bào)道具有抑制黃曲霉的效果[21]。王雪等發(fā)現(xiàn)檸檬醛和芳樟醇與抑菌性有顯著正相關(guān)關(guān)系[13]。芳樟醇?xì)庀嗵幚砜筛淖兇竽c桿菌生物膜蛋白結(jié)構(gòu)和脂肪酸組成[22]。但在預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用檸檬醛單體測試抑菌活性時(shí)卻發(fā)現(xiàn)對(duì)這2種病原菌并無顯著抑菌效果。因此，推測LPO的抗真菌活性和檸檬烯、芳樟醇、蒎烯等主成分的協(xié)同作用有關(guān)。但對(duì)于具體的抑菌成分和抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步研究。木姜子揮發(fā)油具有藥用和食用功效，其顯著的抑菌活性有助于被作為生物農(nóng)藥和食品保鮮劑進(jìn)行深入研究和開發(fā)。