褐飛虱兩個糖轉運蛋白的功能分析及調控海藻糖代謝的影響

羅雨嘉，邱玲玉，劉永康，龐曉青，姚 瓊，王世貴，唐 斌，徐彩娣，3*

(1.杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，杭州 311121；2.廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點試驗室，廣州 510640；3.杭州師范大學經亨頤教育學院，杭州 311121)

水稻OryzasativaL.作為我國的主要糧食作物幾乎每年消費產量達2萬噸以上，根據(jù)報道估計，在各種水稻病蟲害中僅因褐飛虱產生的損失就占四成以上(徐春春等,2018;劉杰等,2021)，這嚴重危害我國糧食的生產與安全。褐飛虱Nilaparvatalugens單食水稻，其刺吸式口器直接插入水稻維管束的韌皮部中吸取汁液，汁液中含有大量糖分，這是褐飛虱能量物質的來源(Sōgawa,1982)。有研究表明，褐飛虱在吸食水稻的過程中不能直接利用水稻內的蔗糖，而是通過糖轉運蛋白介導蔗糖進入飛虱體內(Priceetal.,2007;Kikutaetal.,2015)，但具體機制尚未明確。

海藻糖是一種非還原性二糖，廣泛存在于許多原核生物和真核生物中，包括細菌、真菌、昆蟲、植物等(Elbeinetal.,2003;Lunnetal.,2014)，它可以作為能量和糖的來源(Benaroudjetal.,2001;Boninietal.,2004;Lunnetal.,2014)，在昆蟲中被稱為“昆蟲血糖”，是大多數(shù)昆蟲主要的血淋巴糖(Thompson,2003;Avonceetal.,2006)。與存在海藻糖的許多生物一樣，昆蟲的海藻糖也是通過TPP/TPS途徑合成，即在昆蟲脂肪體中海藻糖的合成依賴于海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase，簡稱TPS)和海藻糖磷酸化酶(Trehalose-6-phophate phosphatase，簡稱TPP)的催化，并且受唯一的水解酶——海藻糖酶(Trehalase，簡稱TRE)的作用水解為兩分子的葡萄糖(Beckeretal.,1996;Shuklaetal.,2015)，最后通過特定的跨膜轉運蛋白運輸至血淋巴中，由此維穩(wěn)著體內碳水化合物代謝的平衡(Leyriaetal.,2021)。正如Leyria所描述，海藻糖與葡萄糖一樣也不能直接穿透細胞膜(Leyriaetal.,2021)，生命體對于這些糖類物質的利用都必須經過一個膜轉運的過程，其中一種方式就是需要借助糖轉運蛋白(Sugar transporter，簡稱ST)的運輸進出細胞(Chenetal.,2015)。

糖轉運蛋白是血糖水平動態(tài)平衡的關鍵，例如哺乳動物受激素調節(jié)通過葡萄糖轉運蛋白(Glucose transporter，簡稱GLUT)GLUT4維持血糖水平，由胰島素信號通路發(fā)出信號控制GLUT4易位至細胞膜，在細胞膜上將血液中多余的葡萄糖運輸進細胞(Huang and Czech,2007)；而在植物中SWEET轉運蛋白已被確定為促進蔗糖在多種組織中擴散到質體中的蛋白，Durand等人研究發(fā)現(xiàn)SWEET基因表達量的上調可能會使蔗糖到胞外基質的外排增加，從而適應干旱環(huán)境(Leetal.,2015;Durandetal.,2016;Juliusetal.,2017)。此外，昆蟲的海藻糖轉運蛋白(Trehalose transporter，簡稱TRET)能夠協(xié)助新合成的海藻糖從脂肪體內轉移到循環(huán)的血淋巴中，被其他組織吸收，并且根據(jù)海藻糖的濃度梯度和生理需要以可逆的雙向方式起作用(Thompson,2003;Leyriaetal.,2021)，細胞內海藻糖的水平與昆蟲抵抗各種環(huán)境脅迫存在相關性(Benoitetal.,2009;Cornetteetal.,2010)。由此可見，糖轉運蛋白的協(xié)助對于糖代謝的正常運作來說必不可少，它嚴密調控著血糖濃度從而維持其生命活動，在昆蟲中海藻糖轉運蛋白則是由執(zhí)行該功能的糖轉運蛋白之一。

綜上，糖轉運蛋白可為控制害蟲提供新的潛在目標。但是，目前關于昆蟲糖轉運蛋白特別是海藻糖轉運蛋白的功能研究和信息相對較少，僅少數(shù)學者明確研究過昆蟲海藻糖轉運蛋白的功能(Kikawadaetal.,2007;Kanamorietal.,2010;Liuetal.,2013;Kikutaetal.,2015)，且已有的研究大多數(shù)集中在海藻糖的合成和分解途徑(Shuklaetal.,2015;Tangetal.,2018)。隨著全基因組測序的完成，褐飛虱逐漸成為研究基因功能的靶標昆蟲。因此，闡明昆蟲血淋巴中糖的攝取機制，了解能量物質的獲取途徑，從而可確定控制害蟲的新目標。本研究通過對褐飛虱兩個糖轉運蛋白基因進行功能分析，進一步利用RNAi技術探究其調控海藻糖代謝的生理作用，鑒定該基因是否為海藻糖轉運蛋白候選基因，從而評估其作為控制害蟲潛在基因的可能性，為將來尋找防治害蟲新靶標提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 褐飛虱糖轉運蛋白基因的生物信息學分析

從美國國際生物技術信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得褐飛虱兩條糖轉運蛋白的基因序列，以FASTA格式保存。使用NCBI上自帶的Blast-N和Blast-X工具將這兩條基因的cDNA序列與GenBank中的其他糖轉運蛋白的核酸序列以及氨基酸序列進行比較。通過軟件Clustal X對這兩個蛋白的氨基酸序列與其他昆蟲糖轉運蛋白氨基酸基因序列進行多序列比對，并用Mega 5.1中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，設置Bootstrap法的重復值為1 000(Henaoetal.,2014)。

利用瑞士生物信息研究所(SIB)維護的蛋白組學分析平臺ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)預測本研究所使用的兩條基因序列翻譯為蛋白后所表現(xiàn)的物理化學性質，這些性質包括相對分子質量(Molecular weight)、理論等電點(Theoretical pI)、原子組成(Atomic composition)不穩(wěn)定指數(shù)(Instability index)等。然后利用在線預測工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白結構域的構成和功能，使用NCBI Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對蛋白質的保守結構域進行預測。對于蛋白質二級結構的預測使用在線預測工具PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，再將氨基酸序列提交到SWISS-MODEL網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/interactive)進行蛋白質三級結構建模。最后利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對該蛋白進行亞細胞定位。

1.2 供試昆蟲

供試昆蟲褐飛虱為杭州師范大學動物適應與進化重點實驗室飼養(yǎng)種群，供試水稻為感蟲水稻TN1(Taichung Native1)，褐飛虱置于人工氣候室飼養(yǎng)，環(huán)境條件設置為：溫度25±1℃，光周期L ∶D=16 h ∶8 h，相對濕度70%±5%。

1.3 總RNA的抽提與dsRNA的合成

采用Trizol法提取褐飛虱總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop2000分光光度計分別檢測所提取總RNA的質量以及濃度。根據(jù)Prime Script?RT reagent Kit With g DNA Eraser試劑盒的說明書，合成cDNA第一鏈，并放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用Primer5軟件設計合成特異性引物進行PCR擴增，產物經過切膠回收與純化后連接于p MD 18-T載體進行T克隆，挑取單一菌落進行菌落PCR，選取陽性菌液送往Invitrogen(上海)公司測序。以返回的質粒為模板使用含T7啟動子的引物進行交叉PCR，并按照T7 Ribo MAXTMExpress RNAi System試劑盒的使用方法進行雙鏈RNA(dsRNA)的合成。采用相同的方法合成綠色熒光蛋白基因(GFP)的dsRNA作為對照組，相關引物序列具體見表1。使用Nano Drop2000分光光度計檢測dsRNA的濃度，并加入DEPC處理水將其稀釋為終濃度50 μg/μL，最后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 dsRNA合成引物及熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers sequences used for dsRNA synthesis and fluorogenic quantitative PCR

1.4 褐飛虱的顯微注射

選取發(fā)育至5齡第1天的褐飛虱若蟲用于RNAi顯微注射試驗。

首先將dsRNA溶液導入玻璃毛細管針中，設定顯微注射儀參數(shù)為：注射壓強1 000 pah，補償壓80 pah，并根據(jù)注射入標準毛細管的體積(5齡褐飛虱的注射體積為100 nL/頭)調整注射時間。然后用毛筆挑取CO2麻醉后的褐飛虱使其腹面朝上，放置在提前準備好的瓊脂糖膠臺的凹槽中，在萊卡EZ4解剖鏡的觀察下將針刺入褐飛虱胸部第二和第三對足之間并注入dsRNA。把處理后的飛虱放入含新鮮水稻苗的玻璃管中，48 h后挑取存活的褐飛虱用于熒光定量分析、糖含量檢測以及海藻糖酶活性測定。挑取3個平行的樣品，每個平行10頭褐飛虱用于檢測RNAi后基因表達水平；挑取3個平行的樣品，每個平行20頭褐飛虱用于測定海藻糖酶活和糖含量。

1.5 RNAi后褐飛虱體內海藻糖代謝通路相關基因表達量測定

取不同處理組顯微注射48 h后的褐飛虱抽提總RNA，參照試劑盒反轉錄得到cDNA，并根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒的方法進行qRT-PCR檢測，具體定量引物見表1。熒光定量PCR程序：95℃預變性10 s，95℃解鏈5 s，59℃退火并延伸30 s，40個循環(huán)。每個處理3個模板，每個模板重復3次。目的基因的相對拷貝數(shù)根據(jù)2-ΔΔCT方法進行分析(Livaketal.,2001)。

1.6 總糖原、海藻糖、葡萄糖含量以及海藻糖酶活性測定

取注射后48 h的材料分為對照組與實驗組，向其加入200 μL PBS，經過組織破碎儀(程序：55 Hz，120 s)充分研磨后放入超聲破碎儀進行超聲破碎0.5 h，往破碎后的樣品再加入800 μL PBS補足1 mL，4℃，1 000 g離心20 min。取2份350 μL上清，1份用于總蛋白、總糖原和海藻糖含量的測定；1份進行4℃，20 800 g超離心1 h，超離心后取300 μL上清液用于測定葡萄糖、蛋白質含量以及可溶型海藻糖酶活性，沉淀于300 μL的PBS懸浮后用于測定葡萄糖、蛋白質含量和膜結合型海藻糖酶活性，具體操作步驟參照Zhang等的方法(Zhangetal.,2017)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

應用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，并使用SPSS軟件和Sigma Plot10.0進行統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)作圖，數(shù)據(jù)用平均值+標準誤(SE)表示，采用非配對T檢驗(unpaired t-test)和單因素方差分析(One-Way ANOVA)中的LSD方法進行差異顯著性檢驗(P<0.05為差異顯著，用*表示；P<0.01為差異極顯著，用**表示)。

2 結果與分析

2.1 兩個褐飛虱NlTret1基因序列功能分析

登錄號為XP_022187716.2和XP_022188572.1的核苷酸序列分別有1 353 bp和1 488 bp的開放閱讀框，編碼具有450和495個氨基酸殘基的蛋白質，將這兩個蛋白序列分別命名為NlTret1和NlTret1 X1。進行理化分析，預測這兩個蛋白分子量大小為49.984 kDa和53.059 kDa，理論等電點pI為6.53和7.46，其中NlTret1帶負電荷氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為34，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為33，NlTret1 X1帶負電荷氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為30，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為31。因此推測NlTret1屬于酸性氨基酸，NlTret1 X1屬于堿性氨基酸。它們的不穩(wěn)定系數(shù)為34.63和34.38，脂肪族氨基酸指數(shù)為115.24和114.48，親水平均系數(shù)分別為0.565和0.713，綜合以上結果，表明NlTret1和NlTret1 X1都屬于疏水性氨基酸。另由SMART預測NlTret1和NlTret1 X1的跨膜結構域模型分別包含10個跨膜結構域和12個跨膜結構域且定位于細胞膜，屬于MFS超家族，并都具有特異性糖轉運蛋白的功能結構域，說明這兩個蛋白均為固定在細胞膜上的糖轉運蛋白。從二級結構和三級結構預測結果可看出，NlTret1和NlTret1 X1主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲組成(圖1)。

圖1 NlTret1和NlTret1 X1的生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of NLTRET1 and NLTRET1 X1注：A，NlTret1與NlTret1 X1跨膜結構域及保守結構域預測；B，NlTret1與NlTret1 X1的二級結構域預測；C，NlTret1與NlTret1 X1三級結構預測。Note:A,NlTret1 and NlTret1 X1 transmembrane domain prediction and conservative domain prediction;B,Prediction of the secondary domains of NlTret1 and NlTret1 X1;C,NlTret1 and NlTret1 X1 tertiary structure prediction.

2.2 兩個褐飛虱NlTret1蛋白的進化樹分析

從不同昆蟲種類進行的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，兩個蛋白聚集在相關的系統(tǒng)發(fā)育分支中，NlTret1與玉米蚜Rhopalosiphummaidis、高粱蚜Melanaphissacchari、溫帶臭蟲Cimexlectularius和褐翅椿象Halyomorphahalys聚集在一支；NlTret1 X1與棉蚜Aphisgossypii、玉米蚜Rhopalosiphummaidis、高粱蚜Melanaphissacchari、煙蚜Myzuspersicae、蔗黃偽毛蚜Siphaflava和棕櫚薊馬Thripspalmi集中在一支。NlTret1與NlTret1 X1蛋白都與其他昆蟲的Tret1與Tret1 X1蛋白聚集在一支，并與上述多數(shù)互為半翅目的昆蟲同源相近(圖2)。

圖2 NlTret1(XP_022187716.2)與NlTret1 X1(XP_022188572.1)基于氨基酸序列與其他昆蟲Tret構建的進化發(fā)育樹Fig.2 Evolution and development tree constructed by NlTret1 (XP_022187716.2) and NlTret1 X1(XP_022188572.1) based on amino acid sequence and other insect Trets注：Tret蛋白物種來源及其登錄號：棉蚜Aphis gossypii，AgTret1X1(XP_027838003.1)；玉米蚜Rhopalosiphum maidis，RmTret1-likeX1(XP_026808273.1)、RmTret1-like(XP_026819645.1)；高粱蚜Melanaphis sacchari，MsTret1-likeX1(XP_025205476.1)、MsTret1-like(XP_025208158.1)；煙蚜Myzus persicae，MpTret1-2X1(XP_022182394.1)；蔗黃偽毛蚜Sipha flava，SfTret1-likeX1(XP_025417238.1)；棕櫚薊馬Thrips palmi，TpTret1-2X1(XP_034240573.1)；白蠟窄吉丁Agrilus planipennis，ApTret1-likeX1(XP_018333082.1)；黃翅菜葉蜂Athalia rosae，ArTret1-2X1(XP_012255542.1)；麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis，NvTret1-2X1(XP_008207267.1)；紅松蜂Osmia bicornis，ObTret1-2(XP_029042530.1)、ObTret1-like(XP_029049346.1)；韭菜遲眼蕈蚊Bradysia coprophila，BcTret1-2(XP_037026138.1)；油橄欖果實蠅Bactrocera oleae，BoTret1X1(XP_014096828.1)；昆士蘭實蠅Bactrocera tryoni，BtTret1X1(XP_039957802.1)；桔小實蠅Bactrocera dorsalis，BdTret1X1(XP_011202667.1)；家蠶Bombyx mori，BmTret1(XP_004932337.1)；甘藍尺蠖Trichoplusia ni，TnTret1-like(XP_026731345.1)；菜粉蝶Pieris rapae，PrTret1-like(XP_022117370.1)；君主斑蝶Danaus plexippus，DpTret1-like(XP_032527054.1)；阿芬眼蝶Maniola hyperantus，MhTret1-like(XP_034833046.1)；斑點木蝶Pararge aegeria，PaTret1-like(XP_039761312.1)；溫帶臭蟲Cimex lectularius，ClTret1-like(XP_014258243.1)；褐翅椿象Halyomorpha halys，HhTret1(XP_014277273.1)；多胚跳小蜂Copidosoma floridanum，CfTret1-like(XP_014215782.1)；果園壁蜂Osmia lignaria，OlTret1-like(XP_034178871.1)；西方蜜蜂Apis mellifera，AmTret1(XP_016771112.2)；大蜜蜂Apis dorsata，AdTret1-like(XP_031366370.1)；小蜜蜂Apis florea，AfTret1-like(XP_003695906.1).

2.3 RNAi后褐飛虱兩個NlTret1基因沉默效率

為了鑒定RNAi的注射效果，利用qRT-PCR檢測NlTret1和NlTret1X1在mRNA表達水平上變化情況。干擾NlTret1和NlTret1X1的48 h后本基因表達量都極顯著下調(P<0.01)，其中NlTret1與對照組相比靶標基因的表達量下調了88.1%，NlTret1X1下調了95%，這說明合成的dsRNA可以成功抑制靶標基因的表達水平(圖3)。

圖3 dsRNA注射48 h后褐飛虱NlTret1和NlTret1 X1基因相對表達量水平Fig.3 Relative expression levels of NlTret1 and NlTret1 X1 genes 48 h after dsRNA injection注：采用非配對T檢驗進行數(shù)據(jù)分析，誤差用平均值的標準誤差表示?！?”表示在P<0.05上差異顯著，“**”表示在P<0.01差異極顯著。使用綠色熒光蛋白GFP作為對照。Note:Unpaired t-test was used for data analysis,the error was expressed as the standard error of the mean value.“*”indicated a significant difference when P<0.05,and “**”indicated a extremely significant difference when P<0.01.GFP,green fluorescent protein was used as control.

2.4 RNAi后褐飛虱海藻糖代謝關鍵基因相對表達量變化

熒光定量PCR檢測的結果顯示，相比于對照組褐飛虱海藻糖酶基因NlTRE在RNAi后mRNA水平都有不同程度變化，在注射dsNlTret1和dsNlTret1X1的48 h后NlTRE1-1基因表現(xiàn)為超低水平表達(P<0.01)，相反地NlTRE1-2基因則表現(xiàn)為高水平的表達(P<0.01)；NlTRE1-3基因在注射dsNlTret1后表達量呈極顯著上調，而注射dsNlTret1X1后則呈極顯著下調現(xiàn)象。同時，檢測到3個海藻糖-6-磷酸酯酶基因(NlTPS)表達量水平也不一致，注射兩種靶標基因的dsRNA后NlTPS2和NlTPS3基因分別表現(xiàn)為極顯著下調和極顯著上調，NlTPS1基因則是在干擾NlTret1后為上調而在干擾NlTret1X1后為下調(圖4)。

圖4 dsTret1和dsTret1 X1注射48 h后褐飛虱體內海藻糖代謝通路3個NlTRE(TRE1-1、TRE1-2、TRE2)與3個NlTPS(TPS1、TPS2、TPS3)基因相對表達量水平Fig.4 Relative expression levels of three NlTREs (TRE1-1,TRE1-2,and TRE2) and three NlTPSs (TPS1,TPS2,and TPS3) genes in trehalose metabolic pathway in BPH after 48 h of dsTret1 and dsTret1 X1 injection注：采用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析，誤差用平均值的標準誤差表示，星號代表與對照組比較的結果。“*”表示在P<0.05上差異顯著，“**”表示在P<0.01差異極顯著。使用綠色熒光蛋白GFP作為對照，下同。Note:One-way ANOVA was used for data analysis,the error was expressed as the standard error of the mean value,and asterisk represented the results compared to the control group.“*”indicated a significant difference when P<0.05,and “**”indicated a extremely significant difference when P<0.01.GFP,green fluorescent protein was used as control.The same as below.

2.5 RNAi后褐飛虱體內海藻糖酶活和糖含量變化

dsRNA能顯著抑制靶基因，進一步檢測到dsNlTret1和dsNlTret1X1對可溶性海藻糖酶活和膜結合海藻糖酶活也都有極顯著的抑制效果(P<0.01)。糖原與海藻糖含量在干擾NlTret1基因48 h后檢測到較對照組含量表現(xiàn)為極顯著下降，而dsNlTret1對葡萄糖含量則無顯著影響。干擾NlTret1X1基因的結果與之相反，糖原與海藻糖含量并無顯著的變化，葡萄糖含量與對照組相比卻極顯著上升(圖5～圖6)。

圖5 dsTret1和dsTret1 X1注射48 h后褐飛虱可溶性海藻糖酶與膜結合海藻糖酶酶活Fig.5 Soluble trehalase and membrane-bound trehalase activity of the brown planthopper after 48 h of dsTret1 and dsTret1 X1 injection

圖6 dsTret1和dsTret1 X1注射48 h后褐飛虱糖原、海藻糖與葡萄糖含量Fig.6 Glycogen,trehalose and glucose concentrations of brown planthopper after 48 h of dsTret1 and dsTret1X1 injection

3 結論與討論

主要的促進子超家族(MFS superfamily)是最大的轉運蛋白超家族之一，目前包含82個家族，每個家族特定于一組化合物(Reddyetal.,2012;Nio-Gonzálezetal.,2019)，在MFS超家族中，糖由糖轉運蛋白St運輸。雖然在幾乎所有的GLUT超家族成員中都可以看到序列相似性，包括TRET1，但它們的生化特性差異仍十分大(Uldry and Thorens,2004)。另外，TRET1直系同源物之間的動力學特征也不同(Kanamorietal.,2010)，這說明除了保守區(qū)域中的氨基酸殘基外，其他氨基酸殘基也可能負責每個轉運蛋白的特異性。本研究用生物信息學的方法對NlTret1和NlTret1 X1蛋白進行分析，通過三級結構預測、跨膜結構域分析以及亞細胞定位表明NlTret1和NlTret1 X1蛋白是與細胞膜結合的跨膜蛋白(圖1)，擁有特異性轉運糖類物質的結構域，因此NlTret1和NlTret1 X1為典型的糖轉運蛋白，但它們的二級結構和保守結構域外的氨基酸殘基存在差異，推測其糖運輸功能可能會因此有所不同。

糖轉運蛋白是負責把糖類物質運輸?shù)礁鞣N組織中的工具，在昆蟲細胞內海藻糖轉運蛋白則是轉運海藻糖的主要蛋白并且對適應環(huán)境脅迫、平衡營養(yǎng)狀態(tài)起著重要的作用(Thompsonetal.,2003)。本研究在證實了RNAi效果顯著的前提下檢測NlTRE與NlTPS的基因表達量，沉默NlTret1和NlTret1X1后褐飛虱3個海藻糖酶基因與3個海藻糖合成酶基因都顯示了不同程度的超表達水平，這與Zhao等人敲除NlTRE結果幾乎一致(Zhaoetal.,2016)，表明海藻糖轉運蛋白可影響TRE1和TRE2以及3個TPS之間的表達。不同的可溶性海藻糖酶(Soluble trehalase，簡稱TRE1)基因存在著不同分工(陳堅毅等,2017)，在注射dsRNA后NlTRE1-1極顯著降低(圖4-A)，這說明褐飛虱海藻糖轉運蛋白NlTret1和NlTret1 X1對TRE1-1有著相同的調控功能，NlTRE1-1表達量減少后NlTRE1-2表達量顯著增加(圖4-B)，一個基因的表達敲低時可激活其他基因的補充功能，這揭示了基因之間的相互作用。沉默NlTret1后NlTPS1與NlTPS3表達量顯著增加(圖4-D、圖4-F)消耗糖原(圖6-A)應積累海藻糖(於衛(wèi)東等,2020)，但似乎NlTret1可嚴重影響到NlTRE1-1基因的表達(圖4-A)，盡管最后降低了可溶性海藻糖酶活性與膜結合海藻糖酶活(圖5)，但是仍大量消耗海藻糖含量，最終結果表現(xiàn)為海藻糖含量的極顯著降低(圖6-B)。AgTret1缺陷型岡比亞按蚊Anophelesgambiae的血淋巴海藻糖濃度檢測結果也與本實驗結果一致，與對照組相比降低40%(Liuetal.,2013)，抑制NlTret1表達可減少海藻糖從脂肪體到血淋巴的轉運，這說明可通過NlTret1調整維持血淋巴的海藻糖濃度。相對來說，沉默NlTret1X1雖也使TRE與TPS基因產生不同程度的波動(圖4)，對海藻糖酶活的影響也是顯著降低的(圖5)，但并不影響到糖原含量與海藻糖含量的變化，僅使葡萄糖濃度升高(圖6-C)。Tret1可能屬于GLUT家族的新成員，有研究表明嗜眠搖蚊Polypedilumvanderplanki的Tret1不僅可以轉運海藻糖還可轉運葡萄糖類似物。此外，盡管果蠅Drosophilamelanogaster的Tret1-2含有保守的Tret1氨基酸序列，但其并不具備運輸海藻糖的能力(Kikawadaetal.,2007;Kanamorietal.,2010)。因此推測NlTret1與NlTret1 X1這兩個蛋白分別執(zhí)行不同的功能，在此之中NlTret1作為特異性轉運海藻糖的蛋白可能性更大，而NlTret1 X1也許以運輸葡萄糖為主，由實驗結果來看可能還存在著功能互補的作用，但相關機制還需進一步研究與驗證。