腹瀉犢牛大腸埃希菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

馬海蓮

（青海省海東市樂(lè)都區(qū)共和鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，青海 海東 810700）

0 引言

犢牛大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌感染引發(fā)的一種常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病，臨床上以新生犢牛的易感性最強(qiáng)，主要發(fā)生在冬春季節(jié)，具有極高的發(fā)病率和死亡率[1]。新生犢牛大腸桿菌病發(fā)病速度較快，短時(shí)間內(nèi)能夠造成犢牛死亡，根據(jù)其臨床癥狀的不同，將其劃分成腸炎型，腸毒素型以及辦學(xué)癥型，如果沒(méi)有及時(shí)對(duì)病情做出有效的診斷并開(kāi)展針對(duì)性的治療，在短時(shí)間內(nèi)犢牛就會(huì)死亡。很多患病牛在出生10～14日齡之后就會(huì)受到大腸桿菌的侵染，發(fā)病后體溫升高到41 ℃，最高升高到42 ℃，并且在發(fā)病24 h內(nèi)會(huì)排出膠凍狀的黃色糞便，糞便中會(huì)夾雜很多血絲和黏液。如果犢牛沒(méi)有死亡，隨著病情的進(jìn)一步延長(zhǎng)，很可能會(huì)出現(xiàn)腕關(guān)節(jié)副關(guān)節(jié)腫大，炎癥病變，有時(shí)還會(huì)表現(xiàn)為肺炎，支氣管炎等呼吸道癥狀。針對(duì)犢牛大腸桿菌病應(yīng)該做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，否則后患無(wú)窮。

1 材料與方法

1.1 材料獲取

本次研究大腸桿菌病分離鑒定的病源來(lái)源于一個(gè)牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)的患病犢牛。犢牛在發(fā)病2～3 d后死亡，并且該類(lèi)疾病在養(yǎng)殖場(chǎng)中傳播速度較快，短時(shí)間內(nèi)引起了大批量的犢牛發(fā)病。解剖犢牛，采集病死牛的肝臟和脾臟組織。大腸桿菌致病性試驗(yàn)過(guò)程中，主要選擇使用10只小白鼠，按照原隨機(jī)原則，將其劃分成2個(gè)組別，1組為試驗(yàn)組，1組為對(duì)照組，每組5只小白鼠。病原分離鑒定過(guò)程中主要涉及到普通肉湯培養(yǎng)基、瓊脂平板、血液瓊脂平板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、三糖鐵斜面。同時(shí)按照大腸桿菌病生化鑒定的相關(guān)要求，配置了糖發(fā)酵管、MR試劑、VP試劑、明膠溶液、檸檬酸鹽試劑、吲哚試驗(yàn)試劑。藥敏試驗(yàn)期間共選擇左氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、頭孢拉定、呋喃托因、環(huán)丙沙星、頭孢先鋒、恩諾沙星等抗生素，按照紙片擴(kuò)散檢測(cè)法來(lái)判定抗生素的敏感，在試驗(yàn)過(guò)程中配置了高速的冷凍離心機(jī)、滅菌儀器，凝膠成像分析系統(tǒng)，電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

在檢測(cè)過(guò)程中，首先采集了患病牛的新鮮血液，分別進(jìn)行了牛病毒性腹瀉、牛腺病毒、冠狀病毒、輪狀病毒的抗體水平監(jiān)測(cè)，由于沒(méi)有免疫接種上述幾種疫苗，血清中的抗體水平相對(duì)較低，沒(méi)有達(dá)到相應(yīng)的要求，因此排除了上述幾種病毒感染的可能。隨后進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定，生化鑒定及藥敏試驗(yàn)。將采集到的病料充分研磨后，劃線(xiàn)接種到鮮血瓊脂平板上，尖形成菌落之后轉(zhuǎn)移到血液瓊脂平板提純，然后分別接種到普通肉湯、普通平板、鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，持續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察致病菌菌落的形態(tài)。將分離得到的致病菌再進(jìn)行生化鑒定。將分離到的致病菌制作成懸濁液后，注射到小白鼠體內(nèi)，與對(duì)照組一同養(yǎng)殖，觀察小白鼠注射后的臨床癥狀，然后對(duì)病死小白鼠進(jìn)行解剖，檢查肝臟、心臟、脾臟的病變，用紙片擴(kuò)散法開(kāi)展藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 病原分離鑒定結(jié)果

從采集到的病變臟器組織中分離到一種菌株，將其染色后為格蘭氏陰性染色的中等大小的菌落，兩端鈍圓，兩端染色較為明顯，成對(duì)排列或者單個(gè)存在。提純后的致病菌能夠使肉湯均勻渾濁，并且在普通瓊脂培養(yǎng)基上良好的生長(zhǎng)，菌落形態(tài)呈現(xiàn)濕潤(rùn)、光滑、凸起、半透明、邊緣整齊，直徑大小在2～4 mm。在血液瓊脂平板上不存在溶血現(xiàn)象，能夠在麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上生長(zhǎng)出粉紅色和紫黑色的菌落并帶有金屬光澤。生化鑒定結(jié)果符合大腸桿菌的特征。

2.2 致病性檢測(cè)

注射了懸濁液的小白鼠在6 h后出現(xiàn)了典型的臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡不振，不能正常采食，全身肌肉震，蜷縮在角落中不愿走動(dòng)，被毛雜亂，24 h后就會(huì)死亡，對(duì)照組小白鼠正常，沒(méi)有出現(xiàn)死亡，對(duì)病死小白鼠解剖發(fā)現(xiàn)，肺臟出血，肝臟腫大。將病變臟器組織粉碎之后，制作成涂片，為革蘭氏陰性染色的中等大小的桿菌，與上述分離得到的桿菌形態(tài)一致。

2.3 藥敏試驗(yàn)

左氧氟沙星、慶大霉素、卡那霉素呈現(xiàn)高敏抑菌圈直徑，分別在25、24和34 mm，其他幾種抗生素呈現(xiàn)中敏或者低敏，如表1所示。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)束語(yǔ)

大腸桿菌侵入腸道后會(huì)使腸黏膜出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，并且某些特別血清型的大腸桿菌繁殖還會(huì)產(chǎn)生很多腸毒素，這些腸毒素對(duì)幼齡階段的犢牛具有較強(qiáng)的致病性。腸毒素中的某些蛋白質(zhì)可以黏附在小腸的上皮細(xì)胞[2]，并在小腸中定居，避免被排出體外。并且這些腸毒素還會(huì)進(jìn)一步抑制腸道對(duì)電解質(zhì)尤其是鈉的正常吸收，使大量的鈉離子和水滯留在腸道中，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體嚴(yán)重的脫水和腹瀉[3]。在疾病診治過(guò)程中，通過(guò)對(duì)患病牛的臨床癥狀進(jìn)行判定，推測(cè)是產(chǎn)毒素的大腸桿菌引發(fā)的大腸桿菌病。通過(guò)動(dòng)物致病性檢測(cè)能夠發(fā)現(xiàn)本次分離到達(dá)大腸桿菌菌株具有較強(qiáng)的致病性和毒力，是引起該養(yǎng)殖場(chǎng)犢牛發(fā)病的主要原因。

大腸桿菌耐藥性檢測(cè)能夠發(fā)現(xiàn)該類(lèi)致病原被很多抗生素已經(jīng)產(chǎn)生了比較嚴(yán)重的耐藥性，僅僅有3種抗生素為高敏抗生素。在篩選出敏感抗生素之后，從中篩選出1～2種的抗生素，對(duì)患病牛進(jìn)行肌肉注射治療，交替使用抗生素，連續(xù)用藥5 d后犢牛的臨床癥狀逐漸恢復(fù)，病情得到了有效控制，并沒(méi)有繼續(xù)出現(xiàn)發(fā)病情況。