有氧運動通過上調Dhcr24 改善H2O2 誘導的心肌細胞凋亡機制研究

董艾艾 陳 嚴 周建妹

心肌梗死是心力衰竭的重要誘因之一，每年死亡率接近5%，發(fā)病率不斷上升[1]。心肌梗死后的運動訓練有利于患者康復、提高生活質量，有助于預防梗死后的并發(fā)癥，找到心肌梗死后運動康復的有效靶向分子非常重要[2]。24-脫氫膽固醇還原酶（Dhcr24）是黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依賴性氧化還原酶家族的成員。Dhcr24 作為一種多功能蛋白質，具有膽固醇合成和抗凋亡活性[3]。心肌細胞凋亡是心肌細胞損傷的重要病理生理機制[4]。研究證明，Dhcr24 可顯著抑制氧化應激和缺氧誘導的心肌細胞凋亡和心肌梗死[5]。在此背景下，本研究通過H2O2建立心肌細胞凋亡模型[6]，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）在運動后被激活[7-9]，通過AMPK 激動劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）來模擬心肌細胞的運動效果，研究Dhcr24 在有氧運動改善心肌梗死后心肌細胞功能中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑 大鼠心肌細胞系H9C2（批號RDCL-012）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；DMEM 培養(yǎng)基（批號11965118）、胎牛血清（批號10100147）購自美國Gibco 公司；H2O2（批號88597）購自美國Sigma 公司；AICAR（批號2627-69-2）購自美國Selleck Chemicals 公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（批號MA0220）購自大連美侖生物技術有限公司；One-Step TUNEL 凋亡試劑盒（批號C1088）、RIPA 蛋白裂解液（批號P0013C）、ECL 化學發(fā)光試劑盒（批號P0018AFT）購自上海碧云天生物技術公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號20190222）購自美國Thermo 公司；Dhcr24（批號ab137845）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）（批號ab182858）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）（批號ab32503）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（批號ab8245）抗體購自Abcam 公司；Trizol（批 號15596018）購自美國Invitrogen 公司；cDNA 合成試劑盒（批號01286165）購自美國Thermo 公司；SYBR Premix Ex Taq ⅡPCR 試劑盒（批號RR820A）購自日本TAKARA 公司。

1.2 主要儀器 高速冷凍離心機（Thermo Fisher，型號：Fresco 17）、1300 系列Ⅱ級A2 型生物安全柜（Thermo Fisher，型號：1379）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，型號：BB150）、熒光定量PCR 儀（羅氏，型號：LightCycler480Ⅱ）、熒光倒置顯微鏡（尼康，型號：TiS）。

1.3 細胞培養(yǎng)與處理 H9C2 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、10 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，細胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。為了構建細胞凋亡模型，取對數(shù)期細胞接種至96 孔板中，通過100 μmol 的H2O2處理細胞4 h[6]。通過AMPK 激動劑AICAR（1 mmol）模擬H9C2 細胞的運動效應[7]。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞處理后通過0.05%胰蛋白酶將細胞消化為單細胞懸液，1000 r/min離心5 min 后加入200 μL 結合緩沖液重懸細胞，滴加Annexin V（10 μg/mL）和PI（10 μg/mL），避光孵育15 min，然后通過流式細胞儀分檢測細胞凋亡情況。

1.5 TUNEL 檢測細胞凋亡 通過一步法TUNEL 凋亡試劑盒檢測細胞凋亡。細胞（1×105/孔）接種至玻璃蓋玻片上，通過4%甲醛固定30 min、0.3% Triton X-100 透化10 min。玻片通過dUTP 和TDT 酶在37 ℃加濕箱中標記1 h，通過抗熒光淬滅封膜劑進行封膜，通過熒光顯微鏡觀察陽性粒子。

1.6 蛋白免疫印跡檢測細胞Dhcr24、Bcl-2、Bax 表達水平 細胞處理后，通過1% PMSF 的RIPA 裂解液裂解細胞，提取總蛋白，并通過BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，等量上樣（30 μg）。經(jīng)SDSPAGE 電泳，轉至PVDF 膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗Dhcr24（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、GAPDH（1∶1000），4 ℃下孵育過夜，洗膜后加入HRP-羊抗兔二抗（1∶10000），室溫下孵育2 h。通過ECL 化學發(fā)光顯色對待測物進行分析。

1.7 RT-qPCR 檢測細胞Dhcr24 mRNA 表達水平[10]使用Trizol 從H9C2 細胞中提取總RNA，通過cDNA 合成試劑盒純化提取的RNA 并進行逆轉錄。通過SYBR Premix Ex Taq Ⅱ PCR 試劑盒進行qPCR 分析，采用2-ΔΔCt計算相對表達水平。Dhcr24 mRNA 引物序列：F：5'-CCGTCCATCAGTGGTCCTTC-3'；R：5'-GGTGATTCTGCCTTCCCACA-3'。引物委托生工生物工程有限公司合成。

1.8 統(tǒng)計學方法 通過統(tǒng)計軟件Graphpad 8.0 對數(shù)據(jù)進行分析，所有符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，兩兩比較通過t-test 檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 H2O2誘導心肌細胞凋亡 結果顯示，與對照組比較，H2O2處理的心肌細胞凋亡水平顯著升高[（20.75±1.28）%比（5.21±0.34）%，P＜0.05]（見圖1A、B）。Western blot 結果顯示，H2O2組抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平顯著降低，促凋亡蛋白Bax 表達水平顯著升高（見圖1C）。上述結果表明，心肌細胞凋亡的體外模型構建成功。

圖1 H2O2 誘導心肌細胞凋亡

2.2 H2O2誘導的心肌細胞Dhcr24 表達水平降低在H2O2誘導心肌細胞凋亡的體外模型中，通過Western blot 檢測Dhcr24 的蛋白質表達水平，發(fā)現(xiàn)Dhcr24 在H2O2組顯著降低（見圖2A）。同時，對Dhcr24 的mRNA 水平進行檢測，RT-qPCR 的結果[（0.56±0.07）比（1.00±0.15），P＜0.05]與Western blot結果趨勢一致，見圖2B。

圖2 H2O2 誘導心肌細胞Dhcr24 表達水平降低

2.3 AICAR 抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡 流式細胞術和TUNEL 結果顯示，與H2O2組比較，H2O2+AICAR 組細胞凋亡水平下降 [（10.67±2.11）%比（21.82±3.22）%，P＜0.05]（見圖3A、B）。Western blot結果顯示，與H2O2組比較，H2O2+AICAR 組Dhcr24表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖3C。

圖3 AICAR 抑制H2O2 誘導的心肌細胞凋亡

2.4 AICAR 通過Dhcr24 抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡 為了驗證AICAR 通過調控Dhcr24 抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡，首先在細胞中敲低Dhcr24 的表達水平（見圖4A）。在H2O2+AICAR 處理心肌細胞的基礎上，細胞中敲低Dhcr24，降低的細胞凋亡水平能夠被一定程度逆轉 [（15.71±1.57）%比（9.50±0.89）%，P＜0.05]，見圖4B、C。

圖4 AICAR 通過Dhcr24 抑制H2O2 誘導的心肌細胞凋亡

3 討論

心肌梗死期間，局部心肌氧化應激水平由于缺血和缺氧而異常升高，導致大量心肌細胞死亡，心肌纖維化，最終心力衰竭[4]。保護存活的心肌細胞以改善心肌梗死后的左心室功能一直是心血管領域研究的重點課題。有研究證明，H2O2可誘導H9C2 細胞的凋亡[11]。AMPK 是調節(jié)細胞代謝以維持能量平衡的關鍵能量傳感器[12]，AMPK 表達的抑制可導致心肌細胞凋亡、加重氧化應激[13]。AICAR、橄欖苦苷、噻蟲嗪和二甲雙胍已被證明可以作為AMPK 的激動劑，具有心臟保護作用[14]。AICAR 被證明在包括高血壓[15]、急性腎損傷[16]、心臟缺氧[18]等疾病模型中，作為AMPK 激動劑發(fā)揮心臟保護作用。另有研究顯示，AICAR 可以作為AMPK 激動劑來探索運動對缺血性心肌的保護作用[17]。本研究結果表明，AICAR 可以顯著抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡，上調細胞Dhcr24 表達水平。

Dhcr24 是一種多功能蛋白質，具有膽固醇合成和抗凋亡活性。Dhcr24 的表達已經(jīng)在多種不同的器官中被檢測到，包括大腦、腎上腺、卵巢等。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，Dhcr24 在H2O2誘導的心肌細胞中顯著降低[18]。據(jù)研究顯示，Dhcr24 表達減少，與腎上腺皮質細胞凋亡增加有關。此外，Dhcr24 被認為參與大腦中的抗凋亡功能，其在顳葉皮層中的表達減少，參與阿爾茨海默病的病理發(fā)展[19]。更重要的是，在一項關于擴張型心肌病的分子機制研究中，抑制Dhcr24 的表達，能夠顯著增強H2O2誘導的心肌細胞凋亡[18]。本研究結果顯示，在H2O2誘導的心肌細胞中敲低Dhcr24 水平，可顯著逆轉細胞凋亡。

本研究表明，AICAR 通過Dhcr24 抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡，Dhcr24 在心肌梗死后有氧運動誘導的心臟保護作用中發(fā)揮積極作用。然而，本研究是基于細胞水平，針對心肌細胞凋亡后運動康復的研究，存在局限性，缺少動物及臨床上的驗證。在未來的研究中，我們將完善動物及臨床水平的驗證，以增強結果的可信度。