線粒體膜完整性對細胞命運的調(diào)控*

祁 宏 李智超 史志強

（1）國科溫州研究院（溫州生物材料與工程研究所），溫州市生物物理重點實驗室，溫州 325000；2）山西大學(xué)，復(fù)雜系統(tǒng)研究所，太原 030006）

線粒體是真核細胞制造能量的場所，被稱為“動力工廠”；近些年的研究表明它也是細胞死亡的“調(diào)控中心”。這與線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，該結(jié)構(gòu)將線粒體分為外膜、膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)4部分［1］。雖然線粒體外膜起界膜作用，但由于其上有孔蛋白構(gòu)成的通道，通透性很高，所以膜間隙中的離子環(huán)境幾乎與細胞質(zhì)相同［1］。內(nèi)膜的不通透性限制了所有分子和離子的自由通過，導(dǎo)致膜間隙和基質(zhì)之間存在質(zhì)子電化學(xué)梯度，構(gòu)成呼吸鏈合成ATP的必備條件［2］。膜間隙的細胞色素c雖是呼吸鏈的組成成分，卻也是細胞死亡的重要因子。基質(zhì) 中 的 線 粒 體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）雖負責(zé)部分線粒體蛋白質(zhì)的合成，但也參與炎癥反應(yīng)和細胞死亡［3-4］。

細胞死亡是生物體的一項基本生命過程，其方式多種多樣，主要包括凋亡、焦亡、鐵死亡、壞死性凋亡等［5］。凋亡是一種“溫和”的死亡方式，不會引起炎癥或免疫反應(yīng)，在胚胎發(fā)育和成體組織自穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。焦亡是一種“劇烈”的死亡方式，其特征在于細胞膜的破裂和由此產(chǎn)生的炎癥誘導(dǎo)因子的釋放，在防御病毒和細菌感染過程中起重要作用［6］。過度的細胞死亡將導(dǎo)致阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生［7-8］，而不足的細胞死亡則促進腫瘤的形成［9］。因此在過去的30年中，對細胞死亡的研究（尤其是以信號通路為主的分子機制研究）一直是生命科學(xué)的熱門研究領(lǐng)域。

各種細胞死亡方式雖具有不同的形態(tài)和分子特征，但均受到各自信號通路的嚴(yán)密調(diào)控。近期的一系列研究表明：各細胞死亡方式的信號通路不是孤立存在的，它們之間存在交叉關(guān)聯(lián)［10］，線粒體正是它們交流的“主戰(zhàn)場”［11］。維持線粒體雙層膜的完整性是保持線粒體正常功能的關(guān)鍵，因此線粒體內(nèi)外膜的完整性及其遭到破壞后導(dǎo)致的不同細胞命運成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點。

1 線粒體外膜通透與細胞凋亡

1.1 Bcl-2蛋白家族

細胞凋亡是研究得最為深入的細胞死亡方式，關(guān)于其分子機制的研究已比較透徹，它可通過受體途徑（外源途徑）和線粒體途徑（內(nèi)源途徑）發(fā)生。線粒體凋亡途徑主要依賴于線粒體外膜通透（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），而MOMP的發(fā)生主要受Bcl-2蛋白家族成員之間相互作用的精密調(diào)控（圖1a）。

根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及在MOMP中所發(fā)揮的作用，可將Bcl-2蛋白家族成員劃分為3大類［12-13］：a.效應(yīng)者（effectors，如Bak和Bax），一般為包含3個BH結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，被激活后可通過寡聚化在線粒體外膜上形成孔道，促使MOMP發(fā)生；b.保護者（guardians，如Bcl-2和Bcl-XL），大多為包含4個BH結(jié)構(gòu)域的抗凋亡蛋白，可通過與效應(yīng)者結(jié)合從而抑制其活性；c.起始者（initiators），因其只含1個BH結(jié)構(gòu)域（即BH3結(jié)構(gòu)域），也被稱為BH3-only蛋白，屬于促凋亡蛋白，可通過調(diào)控效應(yīng)者或保護者促使MOMP發(fā)生。起始者又可進一步細分為：可直接激活效應(yīng)者的激活者（activators，如Bid和Bim），以及間接激活效應(yīng)者的致敏者（sensitizers，如Bad），它可以通過抑制保護者減弱后者對效應(yīng)者的抑制作用，從而達到間接激活效應(yīng)者的目的［14］。需要指出的是，很多激活者也可發(fā)揮致敏者的作用。

Fig.1 The major processes of mitochondrial apoptosis pathway圖1 線粒體凋亡途徑的主要過程

1.2 線粒體外膜通透調(diào)控凋亡

當(dāng)細胞受到生存壓力時，會將壓力信號傳遞給Bcl-2蛋白家族中的激活者，激活者的BH3結(jié)構(gòu)域插入效應(yīng)者的疏水域使后者發(fā)生構(gòu)象改變從而處于激活狀態(tài)［15］。激活的效應(yīng)者單體首先在線粒體外膜上形成二聚物，然后進一步以二聚物為基礎(chǔ)形成不同的寡聚物［16］，最后這些寡聚物在線粒體外膜上形成直徑為幾十到幾百納米的“指環(huán)狀”結(jié)構(gòu)［17-18］，促使MOMP發(fā)生。

MOMP的發(fā)生常被看做是細胞凋亡的不可逆點。這是因為MOMP發(fā)生之后，原本位于線粒體膜間隙的一些物質(zhì)，如細胞色素c和Smac便會釋放到細胞質(zhì)中，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)（圖1b）。一方面，細胞色素c與單體形式的Apaf1結(jié)合，引起后者構(gòu)象改變，隨后在ATP或dATP參與下，7個Apaf-1細胞色素c復(fù)合物與4分子Procaspase 9組裝成“車輪狀”的凋亡體［19-20］，從而激活Caspase 3，降解細胞內(nèi)數(shù)百種蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞凋亡［21］。另一方面，細胞質(zhì)內(nèi)的XIAP可以抑制Caspase級聯(lián)反應(yīng)，但是它的活性可被Smac抑制［22］，從而達到間接促進凋亡之目的。

1.3 線粒體外膜通透的三種程度及相應(yīng)的細胞命運

傳統(tǒng)觀念常將MOMP是否發(fā)生看成是凋亡的開關(guān)，這是因為人們通常發(fā)現(xiàn)MOMP是一個“全或無”的事件［11］。然而最近的研究表明存在一些例外情況，比如當(dāng)細胞遭受某些亞死亡刺激時會發(fā)生少量MOMP（minority MOMP），即一個細胞內(nèi)僅有少數(shù)線粒體發(fā)生MOMP現(xiàn)象［23-24］。雖然發(fā)生少量MOMP并不會使細胞凋亡，但是它仍然會激活少量Caspase 3，使核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生微弱活性，從而使DNA有限損傷并引發(fā)基因組不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［24-25］。

因此，在一般情況下，健康存活的細胞中無MOMP發(fā)生，而凋亡細胞中所有線粒體均發(fā)生MOMP；在一些病理情況下，細胞中僅有少量線粒體發(fā)生MOMP，引起細胞癌變（圖2）?；诒菊n題組已發(fā)表的理論模型所得結(jié)果［26］，認為此現(xiàn)象可用非線性動力學(xué)中的“三穩(wěn)態(tài)”機制解釋（待發(fā)表）。

Fig.2 Three distinct settings of MOMP and the corresponding cell fates圖2 線粒體外膜通透的三種程度及相應(yīng)的細胞命運

2 線粒體內(nèi)膜通透與炎癥反應(yīng)

2.1 cGAS-STING信號通路

凋亡是一種非炎癥的死亡方式，這已是教科書式的觀點。然而近年來的研究顯示，由Bcl-2蛋白家族效應(yīng)者Bak/Bax介導(dǎo)的MOMP不僅可以決定細胞是否凋亡，還可促進細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，激活機體免疫應(yīng)答；這與新近鑒定出來的環(huán)狀鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）信號通路密切相關(guān)［27-28］。

細胞質(zhì)中游離的DNA被宿主的固有免疫系統(tǒng)當(dāng)做一種危險信號，cGAS-STING信號通路是宿主從檢測這類信號到啟動防御機制的重要途徑［29］。當(dāng)病毒或細菌感染細胞后，釋放到細胞質(zhì)內(nèi)的DNA會被胞質(zhì)DNA受體cGAS識別，從而催化ATP和GTP合成第二信使環(huán)狀GMP-AMP（cyclic GMP-AMP，cGAMP）［30］，它 與 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 膜 上 的STING蛋白結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生變化并形成二聚體，繼而寡聚化［31］。STING寡聚體作為信號平臺招募并激活TANK-結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1），TBK1進一步磷酸化STING，從而招募并磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）［32］。磷酸化的IRF3形成二聚體，進入細胞核，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子功能產(chǎn)生干擾素β（interferon-β，IFN-β），觸發(fā)炎癥反應(yīng)［33］。cGAS-STING信號通路可激活免疫系統(tǒng)殺死癌細胞，已在癌癥免疫療法中顯現(xiàn)出巨大前景［34-35］。

線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondria antiviral signaling protein，MAVS）也在固有免疫信號通路中扮演重要角色［36］，它的激活依賴于其線粒體外膜定位功能［37］。MAVS通過信號級聯(lián)反應(yīng) 活 化NF-κB（nuclear factor kappa-B）、IRF3、IRF7等信號蛋白，進而啟動干擾素基因的表達，達到抑制病毒復(fù)制和傳播之目的［37-38］。鑒于主題和篇幅的限制，本文僅討論cGAS-STING信號通路調(diào)控炎癥反應(yīng)的機制。

2.2 線粒體內(nèi)膜通透引發(fā)炎癥反應(yīng)

cGAS既可識別來自病毒或細菌等病原微生物的DNA，也可識別病理條件下泄露到細胞質(zhì)的自身DNA，如核DNA和mtDNA［39］。當(dāng)正常細胞中缺乏Caspase蛋白或其活性受到抑制時，mtDNA可激活cGAS-STING通路，產(chǎn)生IFN-β并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)；但在凋亡細胞中Caspase級聯(lián)反應(yīng)可以抑制該過程［40-41］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase 3可通過切割cGAS、IRF3等cGAS-STING通路中的關(guān)鍵物質(zhì)抑制IFN-β的產(chǎn)生，從而避免發(fā)生炎癥反應(yīng)［42］。這些研究成功解決了細胞凋亡如何維持天然免疫沉默這一重要的科學(xué)問題，但mtDNA如何從線粒體進入細胞質(zhì)卻未被清楚解釋。近期，科學(xué)家利用超高分辨率顯微鏡技術(shù)揭示：當(dāng)細胞開始凋亡時，Bak/Bax通過寡聚化引發(fā)MOMP，釋放出細胞色素c以激活Caspase 3；與此同時Bak/Bax形成的寡聚物不斷聚合，形成巨大孔洞，使線粒體內(nèi)膜透過外膜突出，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜通透（mitochondrial inner membrane permeabilization，MIMP），釋 放mtDNA［43-44］。

據(jù)此提出如下設(shè)想（圖3）：低階Bak/Bax聚合物介導(dǎo)MOMP的發(fā)生和細胞色素c的釋放，導(dǎo)致細胞凋亡［21，45］；而高階Bak/Bax聚合物介導(dǎo)MIMP的發(fā)生和mtDNA的釋放，引起炎癥反應(yīng)。因為前者的發(fā)生不僅先于后者，而且快于后者，所以凋亡細胞可以憑借Caspase 3的激活阻止炎癥發(fā)生。本課題組已針對這一設(shè)想建立了數(shù)學(xué)模型并取得了合理的結(jié)果（待發(fā)表）。

Fig.3 The interplay between apoptosis and inflammation regulated by MOMP and MIMP圖3 線粒體內(nèi)外膜通透調(diào)控的細胞凋亡和炎癥之間的互作

3 線粒體通透性轉(zhuǎn)換與細胞焦亡

3.1 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore，PTP）位于線粒體內(nèi)膜，在正常生理情況下，其呈瞬時開放狀態(tài)，這對于維持一些重要的細胞活動是必需的；但在病理條件下，其呈持續(xù)性開放狀態(tài)，可導(dǎo)致細胞死亡，引發(fā)神經(jīng)退行性疾?。?6-47］。

鈣離子（Ca2+）經(jīng)線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白進入線粒體［48］，線粒體鈣穩(wěn)態(tài)在細胞生理學(xué)和病理學(xué)中均起關(guān)鍵作用［48-49］。三羧酸循環(huán)是糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的共同通路，包括8個反應(yīng)步驟，其中的兩步必須依賴于Ca2+。三羧酸循環(huán)的最終產(chǎn)物通過其下游的氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP，從而保證生物體各項生命活動的能量供應(yīng)。因為三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化反應(yīng)均發(fā)生在線粒體內(nèi)，所以需要有適量的Ca2+由細胞質(zhì)不斷地流入線粒體［50-51］。此外，氧化磷酸化反應(yīng)在產(chǎn)生ATP的同時，會生成少量的活性氧。適量的Ca2+和活性氧可刺激PTP瞬時開放，使部分Ca2+釋放出去，避免線粒體鈣超載［52］。

但細胞處于病理狀態(tài)時，會有過量的Ca2+涌入線粒體，同時生成大量的活性氧，二者的強烈作用誘導(dǎo)PTP持續(xù)性開放，水和小分子物質(zhì)自由通過PTP流入基質(zhì)，稱為線粒體通透性轉(zhuǎn)換（mitochondrial permeability transition，MPT）［53］。

MPT會使線粒體內(nèi)部的滲透壓發(fā)生改變，導(dǎo)致其內(nèi)膜膨脹，進而撐破外膜，引起細胞死亡［54］。

3.2 線粒體通透性轉(zhuǎn)換調(diào)控焦亡

早在2005年就有研究指出MPT會導(dǎo)致細胞以非凋亡的方式（尤其是不依賴于Bcl-2蛋白家族的方式）死亡［55-56］，但到底以何種形式死亡成了一個懸而未決的問題。細胞焦亡是近年來提出的一種新的細胞炎性死亡方式，Caspase家族部分成員常參與其上游信號通路，而下游信號通路很大程度上依賴于Gasdermin家族，其中Gasdermin E（GSDME）為焦亡的主要執(zhí)行蛋白之一［57-58］。GSDME被Caspase 3切割后釋放的片段在細胞膜上寡聚化穿孔，水分子等物質(zhì)進入細胞導(dǎo)致胞膜破裂和內(nèi)容物釋放，發(fā)生焦亡［59］。近日的一項研究解釋了MPT引發(fā)焦亡的作用機制［60］。

該研究揭示不同的刺激條件（鈣超載、膽汁酸、腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運子1激活劑誘導(dǎo)）可通過觸發(fā)MOMP或MPT，選擇性激活凋亡或焦亡信號通路（圖4）。具體來說，低刺激強度觸發(fā)MOMP，緩慢釋放出細胞色素c，與Apaf1和Procaspase 9形成凋亡體，逐漸激活Caspase 3，切割PARP（實驗上用于檢測凋亡是否發(fā)生的一種底物）引發(fā)凋亡；高刺激強度觸發(fā)MPT，迅速釋放出細胞色素c，與Apaf1和Procaspase 4/11形成焦亡體（化學(xué)計量比為7∶2），快速激活Caspase 3，切割GSDME引發(fā)焦亡［60］。

Fig.4 The regulation of apoptosis and pyroptosis by MOMP and MPT圖4 線粒體外膜通透和通透性轉(zhuǎn)換對細胞凋亡和焦亡的調(diào)控

基于上述研究以及本課題組新近的理論工作［21］，提出如下假說：在低刺激強度下，細胞質(zhì)Ca2+的提升激活Bcl-2蛋白家族中的激活者Bid，觸發(fā)MOMP導(dǎo)致細胞凋亡；在高刺激強度下，線粒體Ca2+過載，觸發(fā)MPT導(dǎo)致細胞焦亡。

4 線粒體膜完整性與細胞命運

線粒體雙層膜的完整性是線粒體發(fā)揮正常功能乃至細胞存活的關(guān)鍵因素，其遭到破壞后一方面會使線粒體功能受損，無法產(chǎn)生能量，另一方面會釋放出一些物質(zhì)，引發(fā)不同的信號級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡、焦亡或炎癥（圖5）。在凋亡誘導(dǎo)因子的刺激下，Bcl-2蛋白家族成員Bak/Bax在線粒體外膜上聚合形成小孔，促發(fā)MOMP，細胞色素c通過該孔釋放到細胞質(zhì)中，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡。在此過程中，Bak/Bax形成的小孔通過聚合不斷擴大成宏孔，促發(fā)MIMP，mtDNA通過宏孔釋放到細胞質(zhì)中，引發(fā)cGAS-STING級聯(lián)反應(yīng)，使細胞產(chǎn)生炎癥。發(fā)生凋亡的細胞中，由于細胞色素c和mtDNA的釋放存在動力學(xué)方面的差異，以及Caspase 3對cGASSTING信號通路的抑制，所以觀察不到炎癥現(xiàn)象；但若Caspase級聯(lián)反應(yīng)受到抑制，則發(fā)生炎癥反應(yīng)。低強度的應(yīng)激水平一般通過MOMP導(dǎo)致細胞凋亡，高強度的應(yīng)激水平可使PTP持續(xù)性開放，水和小分子物質(zhì)通過它流入基質(zhì)，促發(fā)MPT，使線粒體內(nèi)膜膨脹撐破外膜，引發(fā)Caspase 4/11-Caspase 3-GSDME級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞發(fā)生焦亡。

Fig.5 The regulation of cell fate by mitochondrial membrane integrity圖5 線粒體膜完整性對細胞命運的調(diào)控

5 總結(jié)與展望

線粒體是真核生物細胞內(nèi)最重要的細胞器之一，因此存在多種途徑調(diào)控線粒體質(zhì)量［61］，主要包括線粒體生物發(fā)生、線粒體融合與分裂、線粒體自噬［62］。線粒體自噬是細胞通過自噬的方式清除受損傷線粒體的過程，Pink1（PTEN induced putative kinase 1）/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是目前研究最為深入的機制［63-64］。Pink1招募并激活Parkin的過程即包含前饋機制［65］，又包含反饋機制［66］，從理論上來講很可能蘊含復(fù)雜的非線性動力學(xué)現(xiàn)象。這些重要且有趣的問題也值得研究者們高度關(guān)注。

線粒體膜完整性的破壞會導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡、焦亡或炎癥反應(yīng)，在很多重要疾病中發(fā)揮重要作用［67］。雖然科學(xué)界近期在此方面取得了重大突破，但仍有許多重要問題有待進一步研究，如：影響MOMP發(fā)生的其他因素，MIMP發(fā)生的詳細機制，PTP的分子鑒定，MOMP與MPT的偶聯(lián)機制，細胞如何處理MOMP、MIMP和MPT構(gòu)成的復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)等。解決這些問題，一方面需要針對單細胞和單分子的實時超分辨等生物技術(shù)的不斷發(fā)展［68］，另一方面需要借助生化反應(yīng)動力學(xué)原理、非線性動力學(xué)理論、統(tǒng)計物理規(guī)律等構(gòu)建合適的理論模型［20-21，47，69-71］。通過生物實驗與理論模型的結(jié)合，將有助于深入了解線粒體膜完整性調(diào)控細胞命運的復(fù)雜調(diào)節(jié)機制，促進學(xué)科的交叉與融合，并為癌癥和神經(jīng)退行性疾病的診斷和治療提供理論依據(jù)和制定最優(yōu)策略。