穿心蓮內(nèi)酯恢復(fù)突變型p53野生型功能的作用及機(jī)制研究*

宋 斌 王嘉健 蘇永南 王玉玲 楊 帆 張繼虹*

（昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

p53蛋白是由393個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧、DNA損傷等壓力刺激時(shí)受到激活，并通過調(diào)節(jié)p21（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A）、BAX（B-cell lymphoma-2-associated X）、PUMA（BCL2 binding component 3）、PTEN（phosphatase and tensin homolog）、NOXA（PMA induced protein 1）等下游靶基因，引起細(xì)胞周期阻滯、使DNA損傷得以修復(fù)、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與衰老、抑制血管生成，從而抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展［1］。p53主要由N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域、C端寡聚結(jié)合區(qū)域、DNA核心結(jié)合區(qū)域［2］3個(gè)功能區(qū)域組成。但在腫瘤中，p53基因的突變率較高，約有50%以上的腫瘤發(fā)生了p53基因的突變，其中，晚期前列腺癌和高級別漿液性卵巢癌患者TP53基因的突變頻率分別高達(dá)75%和96%［3］。75%的TP53突變?yōu)殄e(cuò)義突變，且這一突變頻繁發(fā)生于DNA核心結(jié)合區(qū)域。p53蛋白核心區(qū)（core domain）由2個(gè)四股和五股反平行β片層形成一個(gè)三明治樣的片層骨架結(jié)構(gòu)、1個(gè)環(huán)-片-螺旋結(jié)構(gòu)域（loop-sheet-helix motif、LSH）和2個(gè)大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（L2/L3）組成。2個(gè)大的環(huán)結(jié)構(gòu)和β片層骨架結(jié)構(gòu)形成DNA結(jié)合面，而在腫瘤中大多數(shù)p53熱點(diǎn)突變的殘基全都集中在此結(jié)合面上，從而失去與DNA的結(jié)合能力［4］。p53熱點(diǎn)突變主要包括Arg175、Ser245、Arg248、Arg273、Arg249和Arg282。p53蛋白突變可分為兩種類型：一類為DNA結(jié)合性突變（如R248Q、R273H），此類突變主要是影響p53蛋白與DNA的接觸點(diǎn)，如第273位和第248位精氨酸發(fā)生突變后，鹽橋和疏水作用減弱，并且對DNA的親和力降低甚至喪失；另一類為構(gòu)象型突變，此類突變可導(dǎo)致突變位點(diǎn)原位（如R249S、G245S）或蛋白質(zhì)整體的構(gòu)象扭曲（如R175H、R282W）突變，如R175H位點(diǎn)突變后，疏水作用消失，使得環(huán)狀結(jié)構(gòu)L2和L3不再作用，導(dǎo)致p53蛋白核心結(jié)構(gòu)松散而失去功能［5］。p53蛋白主要以四聚體的形式存在，通常p53發(fā)生突變后會(huì)導(dǎo)致熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性下降，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，活性構(gòu)象改變，失去轉(zhuǎn)錄激活能力，但其不會(huì)失活，仍保持著構(gòu)象從非折疊向折疊轉(zhuǎn)換的能力［6］。

大量的研究已經(jīng)報(bào)道，許多小分子化合物可作為mutp53潛在的重激活劑，引入小分子或多肽與mutp53結(jié)合可以恢復(fù)其與DNA的結(jié)合功能而發(fā)揮抗腫瘤作用［7］。這種突變構(gòu)象改變的微弱性以及自身結(jié)構(gòu)的可恢復(fù)性，為設(shè)計(jì)小分子化合物恢復(fù)mutp53構(gòu)象提供了可能性。由于突變型p53（mutp53）在腫瘤細(xì)胞中通常有較高表達(dá)，從而成為區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)特異性抗腫瘤藥物靶點(diǎn)［8］。迄今為止，只有PRIMA-1的衍生物APR-246進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)［9］。因此，急需開發(fā)新的mutp53潛在重激活劑。在大自然中，存在很多天然產(chǎn)物，而且天然產(chǎn)物在創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)中是其他新技術(shù)和新手段無法替代的。因此從天然化合物中尋找和研究靶向mutp53的化合物具有重要的意義。

穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide）是從穿心蓮（A.paniculata）中提取的化合物，穿心蓮是一種傳統(tǒng)中草藥，在中國古代和東亞其他地區(qū)被用來治療一系列疾病，如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腹瀉、上呼吸道感染和喉炎［10］。此外，它還具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經(jīng)功能調(diào)節(jié)作用，如在阿爾茨海默病、創(chuàng)傷性腦損傷和缺血性中風(fēng)的動(dòng)物模型中具有很好的抗炎活性和治療效果［11］。通過腺苷A2a受體激活Nrf2/HO-1途徑，發(fā)揮抗氧化防御系統(tǒng)的功能［12］；在抗腫瘤方面發(fā)現(xiàn)可通過抑制自噬并增強(qiáng)順鉑介導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞的凋亡［13］；此外，通過以p53依賴的方式上調(diào)TRAIL死亡受體（DR4和DR5）抑制T24膀胱癌細(xì)胞的遷移和促進(jìn)caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［14］。還能通過抑制COX-2表達(dá)及失活p300信號通路和VEGF途徑抑制乳腺癌發(fā)生與發(fā)展；誘導(dǎo)人惡性黑色素瘤C8161和A375細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯而有效抑制其細(xì)胞增殖［15］。而在mutp53的腫瘤細(xì)胞中，可以誘導(dǎo)熱休克蛋白（Hsp70）的表達(dá)，增加Hsp70與mutp53蛋白的結(jié)合，從而促進(jìn)p53的蛋白酶體降解［16］。

本研究在進(jìn)行靶向mutp53重激活劑的篩選中發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可能作為mutp53潛在的重激活劑，初步探討了穿心蓮內(nèi)酯在恢復(fù)mutp53的功能及其抗腫瘤作用。還發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可能通過影響Hsp70的表達(dá)從而激活p53下游靶基因而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為靶向mutp53的藥物研發(fā)提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)也擴(kuò)大了穿心蓮內(nèi)酯在抗腫瘤研究方面的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)腸癌HT29、人乳腺癌SK-BR-3、人肺癌H1299細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫；H1299（p53R273H）-WTPUMApromoter BS2、H1299（p53R175H）-WTPUMApromoter BS2細(xì)胞，穿心蓮內(nèi)脂、PRIMA-1購置Selleck公司；胎牛血清、1640培養(yǎng)基購置Gibco公司；DMSO（溶解藥物）購自Amresco公司；Secrete-PairTMDual Luminescence Assay Kit購自GeneCopoeia公司；CHIP、p53、Noxa抗體購自Santa公司；PAb1620、PAb240抗體購自Millipore公司；PARP抗體購自CST公司；MDM2、PUMA抗體購自Abcam公司；p21抗體購自BD公司；Hsp70抗體購自CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌H1299（p53R273H）-WTPUMApromoter BS2、H1299（p53R175H）-WTPUMApromoter BS2細(xì)胞是通過DNA重組技術(shù)，將PUMA啟動(dòng)子序列插入到雙報(bào)告基因載體pEZX-GA01的GLuc報(bào)告基因上游，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定表達(dá)PUMA啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，通過檢測化合物對細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)量影響，可以表征p53與PUMA啟動(dòng)子的結(jié)合情況，作為mutp53重激活的篩選依據(jù)。以上細(xì)胞和人結(jié)腸癌HT29、SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照一定的細(xì)胞密度接種到96孔板中（不同的細(xì)胞設(shè)置不同的接種密度），37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；穿心蓮內(nèi) 酯 設(shè) 置5個(gè) 濃 度 梯 度（0.1、1、10、50、100 μmol/L）3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)；每孔加入5 g/L MTT溶液25 μl，放置于培養(yǎng)箱中4 h；去除細(xì)胞懸液加入150 μl DMSO，置于搖床上振蕩10 min；多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-TeK）儀器490 nm波長下測定A值。根據(jù)測定的A值計(jì)算出IC50值和細(xì)胞的相對存活率。

1.2.3 相對熒光素酶活實(shí)驗(yàn)

取生長狀態(tài)良好的H1299（p53R273H）-WTPUMApromoter BS2、H1299（p53R175H）-WTPUMApromoter BS2細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照一定的細(xì)胞密度接種到24孔板中（不同的細(xì)胞設(shè)置不同的接種密度），37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；加入10或20 μmol/L穿心蓮內(nèi)脂、50 μmol/L PRIMA-1作為正對照（已經(jīng)被證實(shí)作為mutp53的重激活劑）處理24 h，吸取細(xì)胞上清后，通過Secrete-PairTMDual Luminescence Assay Kit進(jìn)行相對熒光酶活檢測。

1.2.4 AnnexinV/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

取生長狀態(tài)良好的HT29、SK-BR-3細(xì)胞種于帶有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用穿心蓮內(nèi)酯（10或20 μmol/L）處理48 h后，1×PBS洗滌細(xì)胞，加入0.25%胰酶（不含EDTA）消化，然后用培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹散細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，4℃，1 000×g，離心5 min。去上清，用1×PBS重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，4℃，1 000×g，離心5 min。然后根據(jù)凋亡試劑盒（北京四正柏生物公司，貨號：FXP021）使用說明進(jìn)行染色，避光孵育20 min，每個(gè)離心管加入緩沖液終止染色，采用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測以及數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

取生長狀態(tài)良好的HT29、SK-BR-3細(xì)胞種于帶有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用穿心蓮內(nèi)酯（10或20 μmol/L）處理48 h后，1×PBS洗滌細(xì)胞，固定液（5%多聚甲醛∶1×PBS∶20%蔗糖=6∶3∶1）固定10 min，5%BSA室溫封閉2 h，加一抗PAb240抗體（識別突變型p53）、PAb1620抗體（識別野生型p53）孵育過夜，加Goat-anti-mouse 488（綠光）熒光二抗，避光室溫孵育2 h，1×PBS洗滌，染DAPI，室溫孵育15 min，然后封片，拍片，觀察穿心蓮內(nèi)酯處理HT29、SK-BR-3細(xì)胞后PAb240（識別突變型p53）與PAb1620（識別野生型p53）表達(dá)情況。

1.2.6 免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)

穿 心 蓮 內(nèi) 酯（10或20 μmol/L）處 理 后 的HT29、SK-BR-3細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下并收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，用1×PBS清洗1次，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠對細(xì)胞樣品進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃過夜，用1×TBST清洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測。

1.2.7 細(xì)胞總RNA提取實(shí)驗(yàn)

穿 心 蓮 內(nèi) 酯（10或20 μmol/L）處 理 后 的HT29、SK-BR-3細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基并用1 ml預(yù)冷的1×PBS充分清洗。然后，加入1 ml Trizol裂解液充分晃勻后靜置1 min。用1 ml微量移液器反復(fù)吹吸，使細(xì)胞離壁并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 ml EP管中，樣品經(jīng)渦旋劇烈振蕩30 s后，冰浴中靜置孵育10 min，然后加入200 μl氯仿。再次渦旋振蕩30 s后，冰浴中靜置孵育10 min，4℃，13 000 r/min離心15 min。將上層水相（RNA分布在上層）移至已預(yù)冷的新1.5 ml離心管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，充分混勻后，放入-20℃冰箱中孵育30 min后，4℃下13 000 r/min離心15 min，小心棄去上清，用1 ml 75%乙醇（用DEPC水配制）輕輕重懸清洗RNA沉淀，然后4℃，以8 000 r/min離心5 min，小心棄去上清。打開樣品管的蓋子并倒扣在干凈的濾紙上直至乙醇完全揮發(fā)，加入適量DEPC水溶解RNA沉淀，樣品在多功能酶標(biāo)儀（Bio-TeK）儀器測量濃度，樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

反應(yīng)體系：4 μl SYBR Green，2 μl上游引物（1 μmol/L），2 μl下游引物（1 μmol/L），2～5 μl DNA模板，加ddH2O至20 μl。反應(yīng)參數(shù)：Cycle 1（1×）、50℃、30 min；Cycle 2（1×）、90℃、10 min；Cycle 3（35×）、95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s；Cycle 4（1×）、65℃、60 s；95℃、15 s。根據(jù)3次實(shí)驗(yàn)所得到的各基因Ct平均值，通過2-ΔΔCt計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.2.9 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

對數(shù)生長期的HT29、SK-BR-3細(xì)胞消化及終止消化后制成單細(xì)胞懸液，按計(jì)數(shù)結(jié)果將8×105個(gè)細(xì)胞種于培養(yǎng)皿（60 mm規(guī)格），并以1640完全培養(yǎng)基將體積補(bǔ)足至5 ml后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)至次日。待細(xì)胞匯合度為60%～80%左右時(shí)，即可進(jìn)行siRNA/ShRNA轉(zhuǎn)染。首先，將TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染試劑從4℃取出并移取適量至1.5 ml離心管使其恢復(fù)至室溫，然后取已在冰水浴解凍的500 pmol siRNA/8.0 μg ShRNA至裝有500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基的1.5 ml EP管中，輕輕混勻。然后，加入18 μl已恢復(fù)至常溫的TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染試劑再次混勻后在常溫孵育20 min，制備siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，棄去舊培養(yǎng)基后加入5 ml新鮮Opti-MEM培養(yǎng)基，將siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物緩慢加至細(xì)胞中，輕微晃勻后放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。最后，將Opti-MEM更換為1640完全培養(yǎng)基，并將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測干擾情況。siRNA NC與siRNA Hsp70片段（5'-AGAAGAAGGTGCTGGACAA-3'）是由廣州銳博生物科技有限公司定制合成。

2 結(jié) 果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對mutp53具有重激活作用

為了能夠從天然產(chǎn)物中尋找mutp53潛在的重激活因子，將mutp53（R273H和R175H）轉(zhuǎn)入到H1299（p53null）細(xì)胞中，同時(shí)將PUMA啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建至細(xì)胞中構(gòu)建了H1299-p53 R273H-WTPUMApromoter和H1299-p53R175H-WTPUMApromoter BS2穩(wěn)定細(xì)胞株，并且篩選了一系列天然化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯（20 μmol/L）處 理H1299（p53R273H）-WTPUMApromoter BS2、H1299（p53 R175H）-WTPUMApromoter BS2細(xì)胞48 h后，可以增加PUMA熒光素報(bào)告基因相對熒光酶活2倍，而PRIMA-1（50 μmol/L）（已經(jīng)報(bào)道是mutp53的重激活劑）增加了3倍（圖1）。提示化合物穿心蓮內(nèi)酯可能對mutp53 R273H和R175H有重激活功能。

Fig.1 The relative luciferase activity of compounds in the H1299 p53R273H-PUMA promoter(a)and H1299 p53R175H-PUMA promoter(b)cells

2.2 穿心蓮內(nèi)酯可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡

采用MTT方法檢測了穿心蓮內(nèi)酯在不同突變p53背景下腫瘤細(xì)胞的增殖作用，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其中對SK-BR-3（R175H）細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，其IC50值4.81 μmol/L，其次為HT29（R273H）和H1299-R273H，IC50值分別為17.69 μmol/L和15.55 μmol/L（表1），提示穿心蓮內(nèi)酯對mutp53細(xì)胞具有抗腫瘤作用。為了進(jìn)一步探究穿心蓮內(nèi)酯是否能夠誘導(dǎo)突變p53細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，采用穿心蓮內(nèi)酯（10、20 μmol/L）處理HT29、SK-BR-3細(xì) 胞12、24、48 h后，隨著時(shí)間梯度的增加，通過Western blot的方法檢測，發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白PARP產(chǎn)生切割，mutp53表達(dá)降低（圖2）。此外通過C6流式細(xì)胞自動(dòng)分析儀（美國BD）分析檢測發(fā)現(xiàn)，在穿心蓮內(nèi)酯（10、20 μmol/L）處理HT29細(xì)胞48 h后，此細(xì)胞的凋亡比例明顯增加（圖3）。上述結(jié)果說明穿心蓮內(nèi)酯可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Table 1 The anti-tumor effect of andrographolide on cell proliferation

Fig.2 The anti-proliferation and apoptosis effects of andrographolide in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

Fig.3 The apoptosis effects of andrographolide in HT29 cells by cell flow cytometry analysis and statistical analysis of early apoptosis fraction

2.3 穿心蓮內(nèi)酯恢復(fù)mutp53的野生型構(gòu)象

為了進(jìn)一步探究穿心蓮內(nèi)酯是否能夠?qū)utp53轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧蜆?gòu)象，采用穿心蓮內(nèi)酯（10、20 μmol/L）處理HT29、SK-BR-3細(xì)胞48 h后，在分別用識別突變型p53抗體PAb240和識別野生型p53抗體PAb1620進(jìn)行免疫熒光。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著化合物濃度的增加，突變型p53（PAb240）的比例降低，而野生型p53（PAb1620的比例增加（圖4）。提示穿心蓮內(nèi)酯具有將mutp53轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧偷墓δ堋?/p>

2.4 穿心蓮內(nèi)酯上調(diào)p53下游靶基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步探討穿心蓮內(nèi)酯在能夠恢復(fù)mutp53野生型功能的基礎(chǔ)上，是否也能夠恢復(fù)p53的轉(zhuǎn)錄活性，采用穿心蓮內(nèi)酯（10、20 μmol/L）處理HT29、SK-BR-3 12、24、48 h后，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞中p53下游基因PUMA、p21和Noxa的蛋白質(zhì)和mRNA水平上升（圖5、6）。提示穿心蓮內(nèi)酯可能是通過恢復(fù)部分野生型p53的活性，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活p53下游凋亡相關(guān)蛋白PUMA、Noxa和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用以及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.5 穿心蓮內(nèi)酯上調(diào)p53下游靶基因依賴于mutp53

由于p53家族成員TAp63、TAp73可以調(diào)控PUMA、BAX、NOXA、p21等共同下游靶基因［17］，因此，進(jìn)一步驗(yàn)證穿心蓮內(nèi)酯處理后，PUMA、p21等p53靶基因的上調(diào)是否是依賴于mutp53。聯(lián)合p53轉(zhuǎn)錄抑制劑PFT-α抑制p53轉(zhuǎn)錄作用后，觀察到穿心蓮內(nèi)酯對HT29、SK-BR-3細(xì)胞中PUMA、p21等p53靶基因的蛋白質(zhì)水平（圖7）和mRNA水平（圖8）明顯受到抑制，提示穿心蓮內(nèi)酯可能通過依賴于重激活mutp53而上調(diào)p21、PUMA等p53下游靶基因的表達(dá)。

Fig.4 The effect of andrographolide on the expression of mutp53 and wild-type p53 in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

Fig.5 The effect of andrographolide on the expression of p53 signaling pathway proteins in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

Fig.6 The effect of andrographolide on the mRNA expression of p53 signaling pathway in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

2.6 穿心蓮內(nèi)酯通過調(diào)控分子伴侶Hsp70的表達(dá)來影響mutp53轉(zhuǎn)錄激活

Fig.7 The p53 related protein expressions in combination with p53 transcription inhibitor PFT-α in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

Fig.8 The mRNA expression of p53 target genes in combination with p53 transcription inhibitor PFT-α in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道［16］，穿心蓮內(nèi)酯可以通過增加Hsp70的表達(dá)，來促進(jìn)Hsp70與mutp53的結(jié)合，使mutp53通過蛋白酶體途徑降解。熱休克蛋白家族關(guān)鍵成員（如Hsp40、Hsp70、Hsp90）除了可與客體蛋白mutp53形成保護(hù)性復(fù)合體，使mutp53逃逸CHIP、MDM2介導(dǎo)的泛素化降解之外，還可以驅(qū)動(dòng)錯(cuò)疊蛋白發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，以及穩(wěn)定其活性［17］。因此，本文進(jìn)一步探究了是否穿心蓮內(nèi)酯對mutp53重激活是否也與分子伴侶Hsp70表達(dá)有關(guān)。在穿心蓮內(nèi)酯處理后發(fā)現(xiàn)Hsp70的表達(dá)增加，采用RNA干擾技術(shù)，在敲低Hsp70后，穿心蓮內(nèi)酯對p53下游靶蛋白的上調(diào)作用明顯受到抑制（圖9）。因此，提示穿心蓮內(nèi)酯對mutp53重激活作用可能依賴于Hsp70的調(diào)控。

Fig.9 The effect of andrographolide with Hsp70 knock-down on the p53 target protein expressions in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

3 討 論

突變p53不僅失去其原有野生型的抑癌功能，同時(shí)通過功能獲得性效應(yīng)（gain-of-function，GOF）并與其他一些因子相互作用，使其穩(wěn)定并積累促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［18］。由于在腫瘤細(xì)胞中p53突變頻率高，因此，靶向作用mutp53（降解mutp53或恢復(fù)為野生型p53）而發(fā)揮抗腫瘤作用具有較好的研究前景［5］。針對靶向mutp53的腫瘤治療策略之一是恢復(fù)mutp53野生型功能［19-20］。

穿心蓮內(nèi)酯作為一種神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)的藥物［21］，同時(shí)也具有抗腫瘤的作用，Yuwen等［12］發(fā)現(xiàn)在人肺癌A549細(xì)胞中，穿心蓮內(nèi)酯通過抑制自噬途徑來增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的凋亡。此外它還能通過抑制COX-2表達(dá)和失活p300信號通路和VEGF途徑抑制乳腺癌發(fā)生與發(fā)展［14］。前期Sato等［16］發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可以通過增加Hsp70的表達(dá)，來促進(jìn)Hsp70與mutp53的結(jié)合，使突變p53通過蛋白酶體途徑降解，同時(shí)增加細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在具有mutp53背景的細(xì)胞中，穿心蓮內(nèi)酯能夠明顯抑制腫瘤的增殖，發(fā)揮很好的抗腫瘤效果；同時(shí)，穿心蓮內(nèi)酯可以使mutp53背景的細(xì)胞中野生型p53比例增加，并且上調(diào)p53下游靶蛋白PUMA、p21、Noxa的表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期因子PARP切割增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。從蛋白質(zhì)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，穿心蓮內(nèi)酯處理HT29、SK-BR-3細(xì)胞后可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的發(fā)生，與Sato等［16］報(bào)道的結(jié)果一致。Deng等［13］發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯以p53依賴的方式上調(diào)TRAIL的死亡受體（DR4和DR5）來抑制T24膀胱癌細(xì)胞的遷移，并促進(jìn)caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。說明穿心蓮內(nèi)酯可以調(diào)控野生型p53的功能?；衔锶鏟RIMA-1、STIMA-1、MIRA-1等在恢復(fù)mutp53野生型功能后，對腫瘤細(xì)胞的生長具有很好的抑制效果［22-23］。此外，由于mutp53在腫瘤細(xì)胞中可以與其他腫瘤抑制因子（如TAp63和TAp73）形成復(fù)合物，使腫瘤抑癌基因失活；在恢復(fù)mutp53的野生型功能后，可以使這些腫瘤抑制因子激活，發(fā)揮抗腫瘤作用；Zhang等［24］發(fā)現(xiàn)，化合物NSC59984可以打破mutp53與TAp73的作用，從而激活TAp73調(diào)控p53的下游靶基因，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。本課題組也發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合p53轉(zhuǎn)錄抑制劑PFT-α處理時(shí)，穿心蓮內(nèi)酯對mutp53重激活作用明顯受到抑制，說明穿心蓮內(nèi)酯對mutp53的轉(zhuǎn)錄激活是依賴于mutp53；同時(shí)，能夠明顯上調(diào)CHIP的表達(dá)，CHIP作為E3泛素連接酶，在腫瘤細(xì)胞中對mutp53的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用，已經(jīng)有報(bào)道，一些化合物可以通過CHIP泛素化途徑降解mutp53［17，25］。HSP90作為分子伴侶與mutp53形成穩(wěn)定的復(fù)合體而抑制MDM2和CHIP介導(dǎo)的泛素化降解途徑，使突變更好地發(fā)揮其癌基因功能［26］。HSP90抑制劑geldanamycin、17-DMAG（geldanamycin derivative）、ganetespib等都可破壞mutp53-HSP90/Hsp70-復(fù)合體，使mutp53去穩(wěn)定性，誘 導(dǎo) 突 變p53發(fā) 生 降 解［27］。HDAC抑 制 劑SAHA（Vorinostat）、丁酸鈉（sodium butyrate）、Romidepsin等，通過破壞HDAC6-HSP90/Hsp70-mutp53復(fù)合體，誘導(dǎo)mutp53通過MDM2和CHIP介導(dǎo)的泛素化途徑降解［28］。本研究也發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可以增加Hsp70、CHIP蛋白的表達(dá)，提示穿心蓮內(nèi)酯可能從CHIP泛素化途徑降解mutp53的表達(dá)，與此前報(bào)道一致。

此外，熱休克蛋白家族作為重要的分子伴侶，可結(jié)合錯(cuò)疊蛋白并促進(jìn)其重折疊或泛素化降解。mutp53的穩(wěn)定性及構(gòu)象轉(zhuǎn)變均受熱休克蛋白的影響，并且mutp53與熱休克蛋白家族之間存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。已發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白家族關(guān)鍵成員Hsp40、Hsp70、Hsp90可與客體蛋白mutp53形成保護(hù)性復(fù)合體，使mutp53逃逸CHIP、MDM2介導(dǎo)的泛素化降解［17，29］。此外，mutp53可將pHSF1（Ser326）募集到靶基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄激活Hsp70、Hsp90從而進(jìn)一步穩(wěn)定mutp53［30］。熱休克蛋白家族除了可以調(diào)控mutp53的穩(wěn)定性外，對其構(gòu)象及功能也具有潛在影響。由于mutp53與Hsp70、Hsp90形成復(fù)合體后會(huì)發(fā)生構(gòu)象解旋，mutp53從復(fù)合體解離后會(huì)自行重新折疊，因此mutp53有恢復(fù)野生型構(gòu)象的可能性［17］，由于熱休克蛋白家族可以促進(jìn)錯(cuò)疊蛋白發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，這提示著熱休克蛋白家族除了與mutp53的降解有關(guān)外，也與mutp53的重激活有潛在聯(lián)系。已經(jīng)研究證實(shí)，毛殼菌素通過Hsp40家族成員DNAJB1恢復(fù)mutp53（R175H）的野生型構(gòu)象及功能［31］，而SLMP53-2則是通過另一分子伴侶Hsp70來重激活mutp53［7，31-32］。上述研究進(jìn)一步證實(shí)分子伴侶與mutp53這種潛在聯(lián)系。在生理和熱休克溫度下，Hsp70和Hsp90分子伴侶網(wǎng)絡(luò)不僅對維持野生型p53轉(zhuǎn)錄活的發(fā)揮重要作用，而且對mutp53蛋白的錯(cuò)誤折疊構(gòu)象穩(wěn)定性起著決定作用［33］。而本文研究發(fā)現(xiàn)，穿心內(nèi)酯可能直接或間接通過與Hsp70作用，從而影響mutp53重激活，發(fā)揮抗腫瘤效果。但其具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

本研究初步揭示了穿心蓮內(nèi)酯可以作用不同突變p53的腫瘤細(xì)胞HT29、SK-BR-3，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡和降低mutp53的表達(dá)，同時(shí)增加野生型p53的比例，并且增加了p53下游相關(guān)蛋白PUMA、p21、Noxa的表達(dá)，且下游因子表達(dá)的增加是依賴于p53，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯恢復(fù)mutp53野生型功能主要是通過Hsp70調(diào)控。為靶向mutp53抗腫瘤藥物治療提供了理論依據(jù)，同時(shí)也闡述了穿心蓮內(nèi)酯的抗腫瘤機(jī)制，為其抗腫瘤藥物開發(fā)治療提供了實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。