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    PLA2R-IgG間接熒光定量免疫層析分析的構(gòu)建與應(yīng)用*

    2022-09-22 02:42:32張藝周穎周衍馬騏葉燕殷皓俞蕾周彬王春新
    關(guān)鍵詞:層析微球紙條

    張藝 周穎 周衍 馬騏 葉燕 殷皓 俞蕾 周彬 王春新*

    (1)江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所,國家衛(wèi)生健康委員會核醫(yī)學(xué)重點實驗室,江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室,無錫 214063;2)南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,無錫 214023;3)南京醫(yī)科大學(xué)原子醫(yī)學(xué)教學(xué)科研基地,南京 211166)

    特發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy,IMN)發(fā)病率在中國呈逐年上升趨勢,其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為腎臟活檢[1-2]。然而腎臟穿刺具有侵入性和復(fù)雜性,需要操作專業(yè)的醫(yī)護(hù)才能開展,而且需要患者入院進(jìn)行,這使得IMN的準(zhǔn)確診斷受到了局限。Beck等[3-4]發(fā)現(xiàn)70%以上的IMN患者體內(nèi)存在磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor,PLA2R)的抗體IgG,隨著研究深入,腎臟病權(quán)威組織“改善全球腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease Improving Global Outcomes,KDIGO)”制定了IMN的臨床實踐指南,提出血清PLA2R-IgG作為首要診斷依據(jù),根據(jù)測定結(jié)果再考慮是否活檢[5],因此該指標(biāo)的檢測必要且關(guān)鍵。同時,PLA2R-IgG水平與IMN疾病進(jìn)程和緩解相關(guān),能夠指導(dǎo)個性化用藥,低濃度水平意味著可持續(xù)使用保守療法[5-6]。因此,定量分析PLA2RIgG也是新方法必備的性能。目前臨床主要采用酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)作為檢測手段[7]。ELISA檢測線性范圍寬,適合批量測試,但不適合門診患者隨到隨檢。因此,研制單人份、快速且定量的PLA2RIgG檢測方法十分必要。

    本研究首次報道采用兩步法進(jìn)行PLA2R-IgG的間接免疫層析分析(immunochromatographic assay,ICA),令抗原抗體能在短小的試紙條上充分反應(yīng),在保證快速性的前提下,提高檢測的特異性;使用鑭系元素銪(Eu)作為發(fā)光物質(zhì),發(fā)揮該元素?zé)晒庑盘枏?qiáng)、背景低、抗干擾的特性,進(jìn)而實現(xiàn)PLA2R-IgG抗體的快速、靈敏、定量檢測。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    HG-98免疫層析定量分析儀為上?;焦井a(chǎn)品,酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司生產(chǎn),噴金劃膜儀和切條機(jī)由杭州賽凱生物公司制造。帶羧基的Eu熒光微球(Bangs Laboratories,美國),重組表達(dá)的PLA2R抗原(無錫傲銳東源),抗人IgG單抗(Hytest,芬蘭);羊抗鼠IgG抗體、樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、6 cm底板和卡殼購自杰一生物(中國)。N-羥基丁二酰亞胺(NHS),2-[N-嗎啉]乙磺酸(MES),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma-Aldrich(美國)。其他試劑均為國藥滬試生產(chǎn),純度為分析純。PLA2R-IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品和ELISA檢測試劑盒為德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司產(chǎn)品。

    1.2 抗體偶聯(lián)熒光微球的制備

    將1 mg羧基微球溶解在500 μl的制備液(0.1 mol/L的MES溶液)中,先用超聲儀分散,再離心15 000×g,時長20 min,將上清液小心地吸去,重復(fù)兩次;之后,向微球中加入100 μl含有1 mg NHS和1 mg EDC的水溶液,用制備液補(bǔ)齊體積至500 μl,避光振蕩反應(yīng)0.5 h后,用該溶液洗滌微球3次;再將一定量的抗人IgG單抗加入至已活化的微球中,避光振蕩2 h;然后,向反應(yīng)液中加入10 μl含10% BSA的Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L,pH7.2),避光振蕩0.5 h;用蒸餾水洗滌去除多余抗體,方法同前;最后,將偶聯(lián)了抗人IgG單抗的微球復(fù)溶于含1%BSA和0.1%Tween-20的Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L,pH7.2)中,使其濃度為2.5 g/L。

    1.3 試紙條的制備

    PLA2R-IgG-ICA試紙條由樣品墊、硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水紙和6 cm底板構(gòu)成,制備時,先把硝酸纖維素膜貼在背板中央,再把PLA2R抗原或羊抗鼠二抗分別噴涂在硝酸纖維素膜上,構(gòu)成間隔5 mm的檢測線(test line,T line)和質(zhì)控線(control line,C line)。30℃烘干膜條2 h,以固定上述蛋白質(zhì)。然后,將樣品墊和吸水紙分別粘貼于上述硝酸纖維素膜兩端,形成2 mm的重疊。最后,將切割成4 mm寬的免疫層析試紙條帶裝入單人份的塑料卡殼中,再放入鋁膜袋長期保存。

    1.4 檢測步驟

    將血清樣本用稀釋液(含有0.5%BSA的pH7.8 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液)按適當(dāng)比例稀釋,滴加入速測卡加樣孔內(nèi),37℃孵育。再加入由稀釋液配制的抗人IgG單抗標(biāo)記的Eu微球,37℃孵育適當(dāng)時間。隨后將速測卡插入HG-98免疫層析定量分析儀檢測,儀器自動顯示檢測結(jié)果。反應(yīng)過程示意見圖1。

    Fig.1 Reaction principle diagram of PLA2R-IgG-ICA

    1.5 性能考核

    參照現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)[8],對構(gòu)建的PLA2R-IgGICA進(jìn)行方法學(xué)考核。a.線性:檢測PLA2R-IgG標(biāo)準(zhǔn)品0、10、20、100、500、1 500 RU/ml,各3次,對結(jié)果進(jìn)行線性擬合并計算相關(guān)系數(shù)R;b.準(zhǔn)確性:通過向兩個低值樣本等體積添加PLA2RIgG標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),每個添加樣重復(fù)測定2次,實測值與理論值的比值為回收率;c.精密度:對濃度為19.8 RU/ml和102.7 RU/ml兩個血樣各重復(fù)測定10次,通過計算均值(Mean)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD),獲得變異系數(shù)(CV);d.靈敏度:平行測定20次標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,計算所測濃度的Mean+2×SD的值,此值即為靈敏度;e.特異性:檢測高純度的350 IU/ml抗過氧化物酶抗體和3 250 IU/ml抗甲狀腺球蛋白抗體,若交叉反應(yīng)率低于1%則認(rèn)為特異性較好;f.加速穩(wěn)定性:將37℃放置10 d與2~8℃保存的試劑同步檢測標(biāo)準(zhǔn)品,計算各濃度點漂移率,若平均偏差小于15%,認(rèn)為試劑穩(wěn)定。

    1.6 臨床應(yīng)用

    IMN患者的血清樣本采集由南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院提供,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)號:2020LLSL-ⅡYZ-08-01,收集時間是2020年10月~2021年4月。血樣使用分離膠血清管采集,離心分離后分裝保存于-40℃冰箱,檢測前恢復(fù)至室溫使用。方法比對的相關(guān)性用Passing-Bablok分析,相關(guān)系數(shù)R>0.9且P<0.05認(rèn)為相關(guān)性好;陰陽一致性和其他參數(shù)的比較通過Pearson卡方檢驗統(tǒng)計分析,P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

    2 結(jié) 果

    2.1 PLA2R-IgG免疫層析法的反應(yīng)模式

    本研究采用間接法檢測,首先對反應(yīng)步驟進(jìn)行考察。傳統(tǒng)的免疫層析法采用一步法檢測,將樣品與微球一起加在樣品墊上,經(jīng)毛細(xì)管層析作用與T線和C線的抗原、抗體反應(yīng)。從圖2a的1和2條帶熒光照片可知,一步法熒光微球與樣品在樣品墊和NC膜交疊處產(chǎn)生蓄積,形成非特異條帶。此外,從圖2b的劑量曲線可知,一步法測量低濃度和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品時曲線彎曲,影響線性范圍。為解決此現(xiàn)象,本研究采用兩步加樣:先加入PLA2R-IgG標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋樣品,令抗體與T線的PLA2R抗原反應(yīng),同時未反應(yīng)的干擾物可被吸水紙吸附;再加入微球標(biāo)記的抗人IgG抗體,經(jīng)層析作用,于T線形成PLA2R抗原-人PLA2R IgG-微球抗人IgG抗體的復(fù)合物,過量的微球可被C線的羊抗鼠IgG捕獲,未反應(yīng)的試劑被吸水紙吸收。從圖2可知,兩步法比一步法降低了微球的非特異結(jié)合,且檢測的線性范圍更寬。

    Fig.2 Comparison of PLA2R-IgG-ICA between one-step and two-step methods

    2.2 檢測方法的優(yōu)化

    為優(yōu)化微球標(biāo)記效率,本研究對微球制備液的pH和Eu微球-抗體反應(yīng)比率進(jìn)行選擇,按照二步法反應(yīng),用標(biāo)記的微球分別檢測空白和高值標(biāo)準(zhǔn)品(1 500 RU/ml的PLA2R-IgG),每個濃度水平測量2次。用pH4.5、5.0和5.5的制備液標(biāo)記的微球分別檢測標(biāo)準(zhǔn)品(圖3)。當(dāng)制備液pH為5.0時,空白標(biāo)準(zhǔn)品的T/C(T線與C線熒光信號的比值)低,高濃度標(biāo)準(zhǔn)品T/C最高,所以采用pH5.0為制備液的最佳反應(yīng)pH體系。

    Fig.3 The effect of pH of MES buffer

    為提高微球-抗體熒光信號,降低非特異吸附,對Eu微球和抗人IgG單抗的反應(yīng)質(zhì)量比按10∶1、25∶1、50∶1和100∶1進(jìn)行篩選(圖4)。當(dāng)按照25∶1反應(yīng)時,反應(yīng)的高值標(biāo)準(zhǔn)品T/C高、空白標(biāo)準(zhǔn)品T/C較低,效果最佳,因此選擇該條件制備微球。

    Fig.4 The effect of the reactive ratio of Eu-microspheres vs anti-human IgG

    為方便操作,令每步反應(yīng)時間一致,然后考察了5、10和15 min/步對結(jié)果的影響(圖5)。綜合空白和高值標(biāo)準(zhǔn)品熒光計數(shù)的差異與時效,選擇10 min/步為最適反應(yīng)時間,即總孵育時間為20 min。

    Fig.5 The effect of different reaction time

    2.3 檢測方法的性能指標(biāo)

    采用優(yōu)化方案構(gòu)建的PLA2R-IgG ICA靈敏度為0.7 RU/ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.771x-1.437,相關(guān)系數(shù)R=0.995,線性測量范圍為0.7~1 500 RU/ml(圖6)。向健康體檢者血清樣本中添加系列標(biāo)準(zhǔn)品,計算方法的添加回收率。由表1可知本方法回收率為86.27%~98.98%,在80%~120%范圍內(nèi),判為方法準(zhǔn)確。平行測定2例PLA2R-IgG濃度值分別為(18.91±1.94)RU/ml和(111.50±6.70)RU/ml的血樣,平均批內(nèi)CV為8.13%,小于15%,認(rèn)為方法重復(fù)性好。用本方法分別檢測350 IU/ml抗過氧化物酶抗體和3 250 IU/ml抗甲狀腺球蛋白抗體,結(jié)果分別為0.6 RU/ml和0.3 RU/ml,交叉反應(yīng)率均小于0.1%,認(rèn)為新方法具有特異性。為考核按此方法制備試劑的穩(wěn)定性,將已稀釋微球溶液和試紙條置于37℃烘箱10 d,再檢測標(biāo)準(zhǔn)品,與2~8℃保存的試劑相比,各濃度點偏移程度分別為:4.7%、14.7%、13.1%、0.4%和4.2%,平均值為7.4%,因此可知試劑存于37℃10 d穩(wěn)定。

    Fig.6 The standard curve of PLA2R-IgG ICA

    Table 1 The recoveries of PLA2R-IgG ICA

    2.4 臨床應(yīng)用

    采用本方法與市售的ELISA試劑盒同步檢測52例IMN患者的血清樣本(圖7),得到的相關(guān)性回歸方程y=0.805x+0.373,R=0.953。R>0.9且P<0.01認(rèn)為兩種檢測相關(guān)。本方法與ELISA試劑盒的正常參考值均為20 RU/ml,<20 RU/ml判為陰性,否則為陽性。表2顯示了兩個方法的一致性比較和臨床樣本的一般信息,結(jié)果表明:IMN患者的性別與PLA2R-IgG水平有顯著相關(guān)(P<0.05),而是否老年患者、腎小球濾過率(eGFR,按CKD-EPI公式計算)異常程度與PLA2R-IgG水平無顯著關(guān)系(P>0.05),與市售ELISA試劑盒陰陽性判斷一致(P<0.05)。本方法對IMN的檢出率為76.9%(40/52),與現(xiàn)有報導(dǎo)相符[3]。

    Fig.7 The correlation of PLA2R-IgG-ICA and ELISA for detection IMN samples

    Table 2 The results of PLA2R-IgG in serum samples of IMN patients with clinical parameters

    3 討 論

    本研究構(gòu)建了一種采用鑭系元素為熒光劑的PLA2R-IgG-ICA,反 應(yīng) 時 間20 min,靈 敏 度0.7 RU/ml,線性范圍跨3個數(shù)量級,測量上限至1 500 RU/ml,且方程回歸系數(shù)R>0.990,對IMN的臨床檢出率達(dá)到76.9%,與國內(nèi)外報道相符。而同類的ELISA試劑盒靈敏度0.6 RU/ml,線性范圍6~1 500 RU/ml,回歸系數(shù)R>0.975,且需要1.25 h反應(yīng)。綜上,PLA2R-IgG-ICA性能指標(biāo)與ELISA近似,能準(zhǔn)確定量,且反應(yīng)時間大幅減短。而ICA具有單人份特性,因此本檢測方法在小樣本量和隨到隨檢方面具有優(yōu)勢。

    由于人血清中抗體混雜,若同時加入熒光劑標(biāo)記的二抗,容易在層析試紙條上產(chǎn)生非特異結(jié)合,并造成勾狀效應(yīng),縮短測量范圍,造成結(jié)果判讀不準(zhǔn)[9],這些現(xiàn)象在本研究采用一步法檢測PLA2RIgG時也存在。為解決上述問題,本方法采用兩步法加液,將樣本與示蹤微球先后加入樣品墊,令待測物與NC膜中的靶抗原充分反應(yīng),使得再加入的微球二抗能更精準(zhǔn)的捕獲T線上的一抗,進(jìn)而形成目標(biāo)免疫復(fù)合物。本研究首次通過二步法反應(yīng),提高了試紙條免疫反應(yīng)的充分性,提升了標(biāo)記抗體的靶向性,增加了反應(yīng)靈敏度和測量范圍。本方法總孵育時間20 min,較常規(guī)ICA的15 min[10]適當(dāng)延長,但與ELISA相比仍具有時間優(yōu)勢。

    床旁檢測價格低廉、操作便捷、即時高效,不使用復(fù)雜的儀器,也不需要專業(yè)的檢驗人員,因此特別適合于迅速指導(dǎo)臨床治療,在單人次臨床檢測中發(fā)揮越來越大的作用[11-13]。ICA為床旁檢測的最常見形式,廣泛用于醫(yī)學(xué)檢測、治療監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域[13-16]。ICA常采用膠體金示蹤,根據(jù)顏色的深淺判斷結(jié)果,只能定性和半定量檢測。而通過前期研究可知:鑭系元素的激發(fā)光波長范圍較寬,發(fā)射峰范圍窄,本底熒光強(qiáng)度低,有助于提高檢測靈敏度[17-19],將鑭系元素與ICA融合將大幅度地提高檢測的靈敏度和特異性,實現(xiàn)ICA的全定量檢測[20-21]。本研究使用含Eu的微球作為示蹤物,用微球?qū)u包裹其中,使后者與水相隔離,避免了熒光猝滅,也無需使用增強(qiáng)液等信號放大試劑,從而進(jìn)一步提高了反應(yīng)效率和便捷度,并且在已構(gòu)建的夾心法的基礎(chǔ)上[20],拓展了鑭系元素ICA的反應(yīng)類型,再次證明間接法在該檢測體系上的可行性。

    然而ICA受層析介質(zhì)的影響,不同廠家的硝酸纖維素膜、吸水紙都可能產(chǎn)生不同的層析效果,而且試紙條長短也會影響免疫反應(yīng)[22]。本方法僅針對杰一公司提供的試紙條原材料,在6 cm試紙條上進(jìn)行了PLA2R-IgG檢測研究,其他長度和廠家的試紙條是否適用于本指標(biāo)檢測有待進(jìn)一步考量。

    4 結(jié) 論

    本文基于首創(chuàng)的兩步法反應(yīng)和Eu熒光微球示蹤的免疫層析技術(shù),實現(xiàn)了即時、定量、靈敏、準(zhǔn)確檢測人血清中PLA2R-IgG。與市售ELISA試劑相比,本方法具有單人份和隨到隨測的優(yōu)勢,具有普及推廣前景。

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