福建省漳州市羅非魚無乳鏈球菌分離鑒定及毒力基因和耐藥性研究

袁 橙，陳懷君，袁 圣，溫華茂，陳智怡，董洪燕，封 琦，郭長明

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；3.福建恒興飼料有限公司，漳州 363108)

羅非魚養(yǎng)殖在國內(nèi)發(fā)展迅速，已成為繼中國四大家魚之后的第五大養(yǎng)殖魚種。據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒2019》統(tǒng)計，2018年中國羅非魚淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為162.5萬t，比2017年增長4萬t。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，羅非魚養(yǎng)殖環(huán)境管理和控制卻未能同步保障，導(dǎo)致每年7～10月份無乳鏈球菌病等頻繁暴發(fā)，制約了中國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。

無乳鏈球菌感染宿主范圍廣泛，不僅會引起魚類敗血癥、奶牛乳腺炎，而且能引發(fā)新生兒敗血癥、腦膿腫等嚴(yán)重疾病[4]。中國流行的無乳鏈球菌血清型主要為Ⅰa型[5]，其發(fā)病機(jī)制包括菌體黏附與侵襲細(xì)胞、菌體釋放毒素和宿主不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答等[6-7]。無乳鏈球菌的許多毒力因子與致病機(jī)制相關(guān)。當(dāng)感染宿主時，病原菌選擇性表達(dá)的多種毒力因子共同配合引發(fā)疾病。已有研究證實(shí)，約30種毒力因子與無乳鏈球菌的致病性有關(guān)[8]。其中，cylE基因編碼的β-溶血素是無乳鏈球菌表面相關(guān)的多功能毒素，可促進(jìn)細(xì)菌在宿主體內(nèi)擴(kuò)散，引起心臟、肝臟功能衰竭等；sodA基因編碼的超氧化物歧化酶有助于細(xì)菌適應(yīng)宿主體內(nèi)的氧化應(yīng)激環(huán)境；gapC基因參與編碼的三磷酸甘油醛脫氫酶與無乳鏈球菌黏附宿主細(xì)胞有關(guān)；scpB基因編碼的C5a肽酶可分解和滅活人類補(bǔ)體成分C5a，幫助細(xì)菌逃避免疫系統(tǒng)的清除。目前魚無乳鏈球菌病尚無有效疫苗可用，多數(shù)養(yǎng)殖場應(yīng)對該病的主要措施仍是投喂抗生素，導(dǎo)致魚源無乳鏈球菌耐藥性日趨嚴(yán)重。

為了解福建羅非魚主養(yǎng)區(qū)無乳鏈球菌病流行特征，江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從福建省漳州市部分地區(qū)羅非魚養(yǎng)殖場分離無乳鏈球菌，通過對分離菌株進(jìn)行血清型鑒定、主要毒力基因鑒定和藥敏試驗(yàn)，以期明確福建羅非魚主養(yǎng)區(qū)無乳鏈球菌的生物學(xué)特性，為防治魚類無乳鏈球菌病提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020年8月上旬，江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從福建省漳州市某羅非魚養(yǎng)殖場采集泳姿異常(如翻滾式或呈原地轉(zhuǎn)圈式游動)，或出現(xiàn)眼球突出混白等癥狀羅非魚的腦組織、眼球內(nèi)容物、肝臟等作為待檢病料。

1.2 主要試劑

無菌綿羊血購自南京鼎周生物科技有限公司；THB培養(yǎng)基購自BD公司；瓊脂粉購自O(shè)XOID公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA純化試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；DL2000 DNA Marker、PCR 2×TaqMix均購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片和生化反應(yīng)管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

取病魚腦組織、眼球內(nèi)容物及肝臟組織，劃線接種于TSB血平板進(jìn)行細(xì)菌分離，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日觀察菌落形態(tài)及溶血特性。挑取白色、表面光滑濕潤、邊緣整齊的優(yōu)勢菌單菌落接種TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取適量菌液進(jìn)行革蘭染色，用油鏡對分離株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 分離株的生化鑒定

從分離株純培養(yǎng)物中挑取單個典型菌落，參照生化反應(yīng)管說明書進(jìn)行VP試驗(yàn)、CAMP試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、海藻糖和山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)、馬尿酸鹽和七葉苷水解試驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 菌株P(guān)CR鑒定 將生化鑒定為陽性的分離株在THB血平板上進(jìn)行三區(qū)劃線純化菌株，37 ℃培養(yǎng)18 h后，挑取單菌落于THB液體培養(yǎng)基中，置于搖床180 r/min、37 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期。利用菌液PCR快速檢測陽性菌株。根據(jù)文獻(xiàn)[9]合成無乳鏈球菌16S rDNA特異性片段引物(上游引物：5′-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;下游引物：5′-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3′)，引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系15 μL：菌液 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TaqMix 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.2 細(xì)菌DNA提取 將PCR檢測陽性菌株分別接種于8 mL THB培養(yǎng)基中，置于搖床180 r/min、37 ℃恒溫培養(yǎng)6 h。按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，并保存于-20 ℃，用于16S rDNA通用引物PCR進(jìn)一步鑒定。

1.5.3 分離菌株16S rDNA鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[10]合成細(xì)菌16S rDNA通用引物(上游引物：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3′；下游引物：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50 μL：DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×TaqMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件同1.5.1。序列預(yù)期擴(kuò)增長度為1 500 bp。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA純化試劑盒對符合預(yù)期條帶的部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行純化，寄送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.6 分離株血清型鑒定

參照Imperi等[11]基于莢膜多糖基因序列設(shè)計的無乳鏈球菌血清型鑒定引物，合成19條特異性引物(表1)，引物均由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。以無乳鏈球菌參考菌株人源株NEW316、牛源株ATCC 13813、魚源株GD201008-001作為陽性對照，多重PCR鑒定分離株的血清型。

從歷史來看，15世紀(jì)的西方人充滿了一種敢于冒險的精神，以超乎尋常的方式探索著未知的世界。葡萄牙人航海探險的規(guī)模雖然難以與東方世界鄭和下西洋的規(guī)模相比較，但它也是那個歷史性的時刻，一個海上技術(shù)與通道迅速發(fā)展、連接整個世界的時刻，一個西方亨利王子緊抓機(jī)遇、東方皇帝拒絕機(jī)遇的時刻，成了決定西方主宰世界的時刻。西方的冒險迸發(fā)了諸類治理文明，而這些文明又迅速擴(kuò)展，成為其主宰世界的有力工具。

PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板 1μL，2×TaqMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件同1.5.1。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 分離株毒力基因的檢測

為檢測分離菌株的主要毒力基因，根據(jù)文獻(xiàn)[12]合成4個無乳鏈球菌主要毒力基因SodA、cylE、gapC和scpB引物，引物信息見表2。以無乳鏈球菌參考菌株人源株A909、牛源株ATCC13813、魚源株GD201008-001作為陽性對照，同時以ddH2O為模板做陰性對照，分別PCR擴(kuò)增以上4種毒力基因。PCR反應(yīng)體系15 μL：細(xì)菌基因組DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TaqMix 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，退火(溫度見表2)15 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 毒力基因檢測引物

1.8 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)推薦的K-B法，測定各分離株對29種抗菌藥的敏感性。取150 μL新鮮的目的菌液涂于直徑90 mm的THB平板，貼藥敏片后37 ℃恒溫培養(yǎng)15 h左右，測量抑菌圈直徑。依據(jù)抑菌范圍說明書進(jìn)行藥敏結(jié)果判斷。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀

病魚表現(xiàn)為食欲減退，游動姿勢不平衡或呈圈樣打轉(zhuǎn)，眼球突出腫大，眼角膜渾濁，眼眶四周輕微出血。剖檢各臟器伴有不同程度的水腫，病魚肝臟腫大并呈纖維素樣變，膽囊腫大、顏色較深、膽汁充盈。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

將分離菌株劃線接種血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落特征為：白色圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤，呈β溶血(圖1)。革蘭染色后，油鏡下分離株為典型的革蘭陽性球菌特性，菌體呈藍(lán)紫色，菌體排列為長短不一的鏈狀，單個或成對存在(圖2)。共分離獲得14株分離菌。

圖1 分離株菌落特征

圖2 分離株革蘭染色鏡檢圖(1 000×)

2.3 生化鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14株分離株VP試驗(yàn)、CAMP均為陽性，觸酶試驗(yàn)陰性，能發(fā)酵海藻糖，不能分解山梨醇和馬尿酸鹽，七葉苷水解試驗(yàn)均為陰性，符合無乳鏈球菌的生化特性。

2.4 特異性片段PCR擴(kuò)增及16S rDNA鑒定結(jié)果

將生化試驗(yàn)鑒定陽性的14株分離菌株用特異性片段引物均擴(kuò)增出大小為220 bp的目的條帶，部分分離株特異性片段引物快速鑒定結(jié)果見圖3。

M,DL2000 DNA Marker;1,GD201008-001;2,陰性對照;3～9,部分分離菌株。圖4同

以各細(xì)菌基因組DNA為模板，16S rDNA通用引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，獲得大小為1 500 bp的目的片段(圖4)，與預(yù)期的條帶大小相符，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，與無乳鏈球菌相似度高于99%，進(jìn)一步證實(shí)14株分離菌株均為無乳鏈球菌。

圖4 部分分離株16S rDNA PCR鑒定

2.5 血清型鑒定

以已知血清型的參考菌株GD201008-001、ATCC 13813、NEW316為陽性對照，采用多重PCR鑒定目的菌株的血清型，結(jié)果見圖5。由圖5可知，所有分離菌株的血清型均為Ⅰa型，與陽性對照菌株GD201008-001一致，呈現(xiàn)2個目的條帶680和270 bp。

M，DL2000 DNA Marker;1，GD201008-001(血清Ⅰa型);2，ATCC 13813 (血清Ⅱ型);3，NEW316 (血清Ⅲ型);4，陰性對照;5～18，分離菌株

2.6 主要毒力基因的檢測

以已知毒力基因的參考菌株GD201008-001、ATCC 13813、A909為陽性對照，擴(kuò)增各分離菌株的主要毒力基因。cylE(697 bp)、sodA(528 bp)及gapC(222 bp)3種毒力基因的檢出率為100%。14株分離菌株均未檢測出毒力基因scpB(1 270 bp)，該毒力基因僅在參考菌株人源無乳鏈球菌A909中檢出。部分菌株毒力基因檢測結(jié)果見圖6。

①A～D，分別為毒力基因cylE、sodA、gapC和scpB。②M，DL2000 DNA Marker;1，GD201008-001;2，ATCC 13813；3，A909;4，陰性對照;5～11，部分分離株

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，14株分離菌株對甲氧胺嘧啶、磺胺異噁唑、氟羅沙星、多黏菌素B及氨基糖苷類藥物敏感率為0，且耐藥率均達(dá)50%以上。但對氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、利福霉素類、林可胺類藥物的敏感性為100%。

表3 分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 多重耐藥分析

由圖7可知，14株分離菌株均呈多重耐藥現(xiàn)象，耐藥數(shù)量為4到8重，其中6重及以上耐藥的菌株11株，占總分離菌株數(shù)的78.57%。

圖7 分離株多重耐藥分析結(jié)果

3 討 論

從福建省漳州市部分漁業(yè)養(yǎng)殖場采集眼球混白突出、眼眶輕微出血、游動姿勢呈圈樣打轉(zhuǎn)或偏向一側(cè)等病癥的羅非魚病料，從病魚的腦、肝臟和眼部分離病原菌。純化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌菌落在THB血平板上為圓形乳白色，表面光滑，呈β溶血。由16S rDNA特異性片段引物初步鑒定及16S rDNA通用引物擴(kuò)增后測序比對，共獲得14株無乳鏈球菌。

研究表明，魚源、人源和牛源無乳鏈球菌分子血清型主要包含Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型3種[13-14]。國內(nèi)分離菌株的血清型主要為Ⅰa型，Ⅰb和Ⅲ型較少。對14株分離菌株的血清型進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)血清型均為Ⅰa型，與對照菌株GD201008-001相同。此次在福建地區(qū)分離得到的菌株血清型，與江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室同期在海南、廣西地區(qū)分離得到的無乳鏈球菌血清型相同[15-16]，均為Ⅰa型。方偉等[17]研究顯示，廣東省部分羅非魚養(yǎng)殖區(qū)感染的無乳鏈球菌血清型均為Ⅰa型，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)國內(nèi)羅非魚無乳鏈球菌的優(yōu)勢血清型是Ⅰa型。

無乳鏈球菌中多種毒力因子作用于機(jī)體，導(dǎo)致宿主產(chǎn)生一系列病癥。本研究檢測的毒力基因包括cylE、sodA、gapC和scpB，檢測結(jié)果與江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室同期在福建、海南、廣西3個地區(qū)分離獲得的76株無乳鏈球菌主要毒力基因檢測結(jié)果完全吻合，這些分離株均含毒力基因cylE、sodA和gapC，而缺少毒力基因scpB[15-16]。馬芳等[18]檢測結(jié)果顯示,分離株血清型也均為Ⅰa型，同時gapC和cylE基因陽性；Kayansamruaj等[19]研究顯示，cylE基因陽性率為100%，但scpB基因序列在Ⅰa 型無乳鏈球菌的基因組中不存在。以上國內(nèi)相關(guān)研究成果均與此次研究符合，提示scpB基因可能不是Ⅰa 型羅非魚無乳鏈球菌的主要毒力基因，所以檢出率低。

研究發(fā)現(xiàn)，福建地區(qū)無乳鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類、氨芐青霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素等藥物敏感，此結(jié)果與王巧煌[20]研究結(jié)果一致。謝?；╗21]研究顯示，福州地區(qū)無乳鏈球菌對青霉素G、氨芐青霉素、萬古霉素有較高的敏感率，與本研究結(jié)果相符。將此次福建地區(qū)藥敏結(jié)果與江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到的海南、廣西地區(qū)無乳鏈球菌的藥物分析結(jié)果進(jìn)行比較[15-16]，3個地區(qū)的分離菌株均對磺胺異噁唑、慶大霉素、鏈霉素、新霉素4種藥物表現(xiàn)高耐藥率，對紅霉素、利福平、克林霉素、β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感率高。福建、海南和廣西3個地區(qū)分離株的不同之處包括：①福建、廣西地區(qū)菌株還對卡那霉素有較強(qiáng)的耐藥性，但海南地區(qū)菌株對卡那霉素敏感性高達(dá)93%；②海南地區(qū)菌株對復(fù)方新諾明呈現(xiàn)高耐藥率，但福建、廣西地區(qū)菌株對該藥敏感性較強(qiáng)。以上對比結(jié)果顯示，3個地區(qū)的漁業(yè)養(yǎng)殖戶對抗生素的選用大致相似，進(jìn)一步分析造成3個地區(qū)分離株耐藥性差別的原因可能有：①3個地區(qū)的分離株有不同的遺傳背景，對某些藥物的敏感度不同[22-24]；②部分養(yǎng)殖戶長期使用某種藥物，病原菌毒力基因、耐藥基因的表達(dá)可能發(fā)生變化，誘導(dǎo)病原菌耐藥性的產(chǎn)生，造成抗生素“失效”；③養(yǎng)殖環(huán)境的差異，如水體硬度、pH及金屬離子的含量等[25]，這些因素均對藥效有一定影響。明確各地的無乳鏈球菌的耐藥規(guī)律，對指導(dǎo)用藥、制定合理防控措施具有重要的指導(dǎo)意義。

調(diào)研和采樣中發(fā)現(xiàn)，許多羅非魚養(yǎng)殖戶一味追求提高養(yǎng)殖密度，忽視養(yǎng)殖環(huán)境控制，使魚體長期處于應(yīng)激狀態(tài)、免疫力下降，感染細(xì)菌性疾病的風(fēng)險增加。規(guī)范養(yǎng)飼養(yǎng)管理，保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全迫在眉睫[26]。當(dāng)前，使用抗生素仍是控制羅非魚無乳鏈球菌病的主要手段，養(yǎng)殖戶應(yīng)提高科學(xué)用藥意識，通過藥敏試驗(yàn)篩選國家允許使用的有效藥物，精準(zhǔn)治療羅非魚鏈球菌病。隨著漁用抗生素禁用種類的不斷增加，尋找替代抗生素療法對防治羅非魚無乳鏈球菌病也有重要意義，如研制疫苗、使用抗菌肽及中草藥防治方法等[27-29]。

4 結(jié) 論

本研究從福建省漳州市發(fā)病羅非魚中分離獲得14株無乳鏈球菌，血清型均為Ⅰa型。毒力基因cylE、sodA、gapC檢出率均為100%，未檢出毒力基因scpB。14株分離菌株均呈多重耐藥，磺胺異噁唑、慶大霉素、卡那霉素等耐藥率>70%，氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等敏感率為100%。