河北省奶牛源大腸桿菌的分離鑒定、致病性及中草藥體外抑菌效果研究

邵明珠，趙允清，李松勵，侯紹華，張艷英

(1.河北科技師范學院，河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，秦皇島066604；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

近年來，大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)感染引起人們的廣泛關注，其主要破壞腸道菌群平衡，改變正常腸道形態(tài)，引發(fā)炎癥反應，使幼齡動物的生長速度下降。而奶牛源大腸桿菌是引起犢牛腹瀉、奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌之一[1-3]。通常在犢牛出生后第1周極易感染腹瀉。據(jù)報道，在法國，3日齡至1月齡奶牛的死亡率分別為5.6%和5.7%，而在美國則超過6.9%[4]，在大環(huán)境飼養(yǎng)中犢牛腹瀉發(fā)病率為90%～100%，病死率高達30%[5]。2017年，黑龍江地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌檢出率為100%[6]；2018年，山東地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌檢出率為100%[7]。因此，大腸桿菌感染引起的犢牛腹瀉嚴重制約奶牛行業(yè)的發(fā)展。

目前，針對大腸桿菌引起的犢牛腹瀉、奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的治療主要以抗生素為主，但抗生素的高使用率和不規(guī)范使用使細菌產(chǎn)生嚴重的耐藥性[2]。研究證實，在大腸桿菌分離株中存在1類整合子、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)、C類β-內(nèi)酰胺酶(AmpC)和質粒介導的喹諾酮類(quinolones)耐藥基因，增加了治療的困難[8]。為解決當前耐藥性問題，中草藥因具有價格低、毒性小、不良反應少、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點成為替抗藥物的選擇之一，且中草藥中的某些成分具有抗菌、抗病毒的能力[9-10]。據(jù)報道，大黃提取物中的大黃素(emodin)對大腸桿菌具有較好的抑菌作用，可以改善腸道微生物菌群，提高動物免疫力[1]；中草藥苦參、決明子、白頭翁、蒲公英和黃柏醇提取液對大腸桿菌具有較好的抑菌作用[11]。在病毒研究中，菜籽提取物菜籽皂甙具有抗豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的作用，可抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)誘導的細胞凋亡(apoptosis)，并能通過降低宿主細胞基因的表達有效抑制PRRSV的復制[12]。河北省是養(yǎng)牛大省，是中國肉牛主產(chǎn)區(qū)之一，而奶牛源大腸桿菌是一種易發(fā)的環(huán)境性致病菌。本研究為分析河北省奶牛場大腸桿菌流行株特點，對分離菌株進行了致病性研究，并篩選出抑菌效果較好的單味及復方中草藥，為奶牛腹瀉臨床中草藥防治提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 于2020年10月從河北張家口、衡水武邑及桃城區(qū)采集30份奶牛糞便樣品，奶牛表觀消瘦、腹瀉。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基購自北京陸橋技術股份有限公司；伊紅美蘭培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母粉、胰蛋白胨均購自上海暢碩生物科技有限公司；瓊脂粉購自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉購自成都市科龍化工試劑廠；無水乙醇購自國藥集團化學試劑北京有限公司；2×EsTaqMasterMix購自生工生物工程(北京)股份有限公司；DNA提取試劑盒均購自康寧生命科學(吳江)有限公司；生化鑒定試劑盒購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；血清鑒定試劑盒購自廣州歐邊生物制品有限公司。

1.1.3 中草藥 五味子、五倍子、烏梅、夏枯草、百里香、石榴皮、丁香、肉桂、藏藥藍花荊芥均購自河北保定安國中草藥市場。

1.1.4 試驗動物 8周齡SPF級BALB/c雌性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限責任公司，體重20 g±2 g，飼養(yǎng)溫度控制在23 ℃±2 ℃，環(huán)境濕度控制在50%±10%，進行12 h光照及12 h黑暗循環(huán)，飼喂無菌的飲水與飼糧。所有程序均按照國際公認的原則及中國關于實驗動物使用和護理的法規(guī)進行。

1.2 方法

1.2.1 分離菌株形態(tài)學鑒定 將樣品處理后，用無菌接種環(huán)蘸取少量樣品，在伊紅美蘭培養(yǎng)基中進行4區(qū)劃線，將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，觀察菌落大小、顏色、形態(tài)特點；用接種環(huán)挑取目標單個菌落4區(qū)劃線接種麥康凱培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察菌落顏色、大小、形態(tài)特點。將分離純化的細菌保存于甘油中，―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株生化培養(yǎng)鑒定 對疑似奶牛源大腸桿菌的樣品進行編號，為A1～A12。取1條生化鑒定試劑管，用酒精擦拭表面進行消毒，從營養(yǎng)瓊脂平板挑取單菌落至無菌生理鹽水中仔細研磨制成均一細菌菌懸液，每孔加入100 μL菌懸液，接種完后做好標記，蓋上蓋子，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，不同檢測對象加入不同的反應試劑，放在記錄卡上觀察。

1.2.3 分離菌透射電鏡鑒定 取制備好的菌液1 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清；加入1 mL PBS將沉淀進行重懸，2 000 r/min離心5 min，棄上清；加入1 mL PBS，進行復染。

1.2.4 分離菌株血清型鑒定 取潔凈載玻片1張，取已知血清1滴滴于載玻片一端，另一端滴生理鹽水1滴做對照。取被檢細菌少許，置生理鹽水水滴與血清中進行混勻，參考標準觀察結果。

1.2.5 分離菌株PCR鑒定 根據(jù)GenBank中O157大腸桿菌ECI-1717基因序列(登錄號：EU871626.1)的保守片段，利用Primer Premier 5.0軟件分別設計2對引物，引物序列見表1。引物均由金唯智生物(北京)科技有限公司合成。參考DNA提取試劑盒說明提取部分純化菌株的DNA，以其為模板進行PCR擴增。PCR反應體系20 μL：2×EsTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 引物信息

1.2.6 分離菌株致病性研究 將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min恒溫搖床培養(yǎng)，每間隔30 min測定D600 nm值。將小鼠分為試驗組與對照組，試驗小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，對照組小鼠注入等量的生理鹽水，6 d內(nèi)觀察小鼠臨床癥狀、發(fā)病及死亡情況，剖檢小鼠觀察病理變化。

1.2.7 中草藥提取液的制備 傳統(tǒng)煎煮法：稱取中草藥20 g，加蒸餾水200 mL，浸泡2 h，武火加熱煮沸后改文火煎煮30 min，用12層紗布過濾，留存煎煮液；向藥渣中加入150 mL蒸餾水，同樣的方法煎煮，過濾棄藥渣；合并2次煎煮液，4 500 r/min離心20 min，將藥物進行加熱濃縮為20 mL，濃度為1 g/mL，121 ℃高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

醇提法：稱取中草藥20 g，加入200 mL 70%乙醇溶液，浸泡10 h，80 ℃水浴加熱2 h，12層紗布過濾；藥渣加入100 mL 70%乙醇溶液，80 ℃水浴加熱1 h，經(jīng)12層紗布過濾；合并2次濾液，4 500 r/min離心20 min，80 ℃下進行旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮為20 mL，濃度為1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 單味中草藥最小抑菌濃度及最低殺菌濃度測定 采用96孔板-二倍稀釋平板法測定最小抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)，96孔板每孔加入100 μL LB液，第1孔內(nèi)加入100 μL中草藥提取液，依次進行2倍稀釋，稀釋1～10孔，藥物濃度依次為500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.80、3.97、1.98、0.99 mg/mL，1～10孔內(nèi)加入1×108CFU/mL菌液10 μL，第11孔不加藥物為陽性對照，第12孔不加細菌為陰性對照，做2組重復。將96孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察結果。在陽性對照孔內(nèi)出現(xiàn)渾濁、陰性對照孔內(nèi)不出現(xiàn)渾濁的前提下，1～10號孔內(nèi)液體澄清透明的最小藥物濃度視為藥物對菌株的MIC。在測定MIC基礎上，吸取100 μL澄清液體分別涂在瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h觀察結果，培養(yǎng)基上無細菌生長的藥物最低濃度則為該藥物對菌株的MBC。

1.2.9 6種中草藥聯(lián)合用藥 首先，根據(jù)中獸醫(yī)理論辯證觀點，通過疾病臨床表現(xiàn)，綜合分析，按照中獸醫(yī)的診斷思路泄瀉病癥進行辯證；其次，根據(jù)中草藥具體藥理性質及各單味藥之間的相須、相使、相畏、相殺原理，以及中獸醫(yī)理論整體觀念和辯證論治觀點，將藥物進行組合，以提高中草藥之間的作用功效。

2 結 果

2.1 分離菌株形態(tài)特點

在麥康凱瓊脂平板上形成單個菌落呈粉紅色，菌落直徑1 mm左右，菌落圓形、隆起、濕潤、光滑、邊緣整齊(圖1A)；在伊紅美蘭平板上生長出單個菌落，中心呈黑色帶金屬光澤(圖1B)。

圖1 麥康凱培養(yǎng)基(A)、伊紅美蘭培養(yǎng)基(B)菌株生長結果

2.2 分離菌株生化鑒定結果

通過生化鑒定管說明標準進行判斷，其中葡糖糖、麥芽糖、甘露糖、吲哚試驗、M.R試驗均為陽性，V-P試驗為陰性(表2)，符合大腸桿菌生化特點，證明分離菌株為奶牛大腸桿菌。

表2 分離菌株生化鑒定結果

2.3 分離菌株電鏡結果觀察

電鏡結果可以看出，分離菌株兩端鈍圓、桿狀菌、無鞭毛、菌毛，大小為0.5～0.8 μm(圖2)，確定為大腸桿菌。

圖2 分離菌株電鏡結果(7 000×)

2.4 分離菌株血清型鑒定結果

奶牛源大腸桿菌菌株血清型鑒定結果顯示，樣品A1～A7血清型為O55∶K59(B5)，為優(yōu)勢血清型，檢出率為58.3%，A8～A12血清型分別為O128∶K67(B12)、O44∶K74(L)、O28∶K73、O11∶K58(B4)、O114∶K90(B)(表3)。

表3 分離菌株血清型鑒定結果

2.5 分離菌株PCR鑒定結果

對部分分離菌株進行PCR擴增，結果顯示，在約500、1 392 bp處可見與預期大小一致的單一條帶(圖3)。

M，DL2000 DNA Marker;1，陰性對照；2～6，菌株A1、A8、A9、A10、A11

2.6 分離菌株感染小鼠臨床癥狀及致病性結果

將制備好的菌液腹腔注射小鼠，主要臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸急促、蜷縮、行動遲緩，眼睛周圍有白色膿性分泌物，糞便不成形，有黏肛現(xiàn)象；病理變化表現(xiàn)為腸壁變薄、鼓氣、出血，腸道內(nèi)有大量黃色內(nèi)容物產(chǎn)生，腸道正常形態(tài)發(fā)生改變，肝臟出血，脾臟無腫大，但出血嚴重。

2.7 單味中草藥MIC測定結果

不同中草藥提取液對奶牛源大腸桿菌的MIC測定結果見表4。由表4可知，在水提取液中，五倍子、五味子抑菌效果最好，MIC值均為7.80 mg/mL；烏梅、夏枯草、石榴皮、百里香抑菌效果次之，MIC值在15.63～31.25 mg/mL之間；藏藥藍花荊芥抑菌效果最差，MIC為125 mg/mL；肉桂、丁香水提取液無抑菌效果。在醇提取液中，五倍子抑菌效果最好，MIC值為3.97 mg/mL；五味子、石榴皮、烏梅抑菌效果次之，MIC值在7.80～15.63 mg/mL之間；百里香、夏枯草、丁香抑菌效果較差，MIC值均為31.25 mg/mL；肉桂、藏藥藍花荊芥抑菌效果最差，MIC值均為125.00 mg/mL。表明五倍子醇提取液抑菌效果最好；石榴皮醇提取液比水提取液抑菌效果好，肉桂與丁香水提取液無抑菌效果，但醇提取液有抑菌效果。

表4 中草藥MIC測定結果

2.8 單味中草藥MBC測定結果

不同中草藥提取液對奶牛源大腸桿菌的MBC測定結果見表5。由表5可知，在水提取液中，五倍子和五味子抑菌效果最好，MBC值均為7.80 mg/mL；烏梅、夏枯草、石榴皮、百里香抑菌效果次之，MBC值在15.63～62.50 mg/mL之間；藏藥藍花荊芥抑菌效果最差，MBC值為250.00 mg/mL；肉桂、丁香水提取液無抑菌效果。

表5 中草藥MBC測定結果

在醇提取液中，五倍子抑菌效果最好，MBC值為3.97 mg/mL；五味子、石榴皮、烏梅抑菌效果次之，MBC值在7.80～15.63 mg/mL之間；夏枯草、丁香、百里香抑菌效果較差，MBC值在31.25～62.50 mg/mL之間；肉桂、藏藥藍花荊芥抑菌效果最差，MBC值分別為125.00和250.00 mg/mL。

2.9 6種中草藥聯(lián)合用藥對大腸桿菌的抑菌效果

6種中成藥聯(lián)合用藥結果見表6。由表6可知，五味子和烏梅聯(lián)合用藥抑菌效果最好，IZD為26.00 mm，MIC、MBC均為3.97 mg/mL；五倍子和烏梅抑菌效果較好，IZD為23.66 mm，MIC、MBC均為7.80 mg/mL；百里香+藍花荊芥和夏枯草+藍花荊芥抑菌效果最差，IZD分別為13.00和13.33 mm，MIC、MBC均為62.50 mg/mL。

表6 中草藥體外聯(lián)合用藥抑菌效果測定

3 討 論

大腸桿菌是引起犢牛腹瀉、奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌之一，影響奶牛存活數(shù)量，改變牛奶質量和產(chǎn)奶量，使奶牛生殖性能受損、撲殺率不斷增加，嚴重制約奶牛行業(yè)的發(fā)展[2]。本研究分離菌株通過透射電鏡觀察、生化鑒定、血清型分析及PCR鑒定為大腸桿菌。血清型測定結果為O55、O128、O44、O28、O11、O114型，其優(yōu)勢血清型為O55型，與王國華[13]報道的泰安地區(qū)奶牛糞便中大腸桿菌血清型檢測為O128、O44、O28型，方光遠等[14]報道的南京地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌血清型檢測為O15、O26、O36、O78、O35型存在一定的差異性，表明不同地區(qū)奶牛源大腸桿菌O抗原血清型可能存在地區(qū)性差異，因此應對不同地區(qū)奶牛源大腸桿菌病的發(fā)病情況采取不同的防控措施。

近年來，大腸桿菌耐藥基因已普遍存在并呈現(xiàn)增加趨勢，已證實大腸桿菌耐藥基因可在菌株之間發(fā)生垂直傳播，并通過質粒、轉座子、整合子進行傳播[15]。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對多種抗生素具有耐藥性，尤其對β-內(nèi)酰胺酶類、氟喹諾酮類藥物的耐藥性極其嚴重，是大腸桿菌感染治愈率低的主要原因之一[16]，在替代抗生素治療及減少耐藥性的產(chǎn)生中，中草藥一直是人們研究的重點對象，其含有多種有效成分，如堿類(alkaloid)、萜類(terpene)、單寧(tannin)、皂苷(saponin)、黃酮類(flavonoids)，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[17]。本研究通過2種中草藥提取方法對單味中草藥抑菌效果進行測定，結果發(fā)現(xiàn)存在以下幾種情況：①中草藥醇提法抑菌效果優(yōu)于傳統(tǒng)煎煮法，如五倍子、石榴皮、丁香、肉桂，其中五倍子醇提法抑菌效果最優(yōu)，與Wang等[18]研究的五倍子醇提取液抑菌效果達到100%結果相一致，究其原因可能是，一方面，不同提取方法、提取物的物質組成不同，其性質也存在一定的差異性，另一方面，五倍子水提取液中含有一些水溶性成分和少量的脂溶性成分、糊化淀粉、蛋白質等，降低了五倍子的效果[2，19]；石榴皮醇提取液抑菌效果優(yōu)于水提取液抑菌效果，且兩種提取方法抑菌效果差異較大，與洪軍等[20]證實的石榴皮醇提取物抑菌效果優(yōu)于水提取物結果相一致，據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，石榴皮中主要含有鞣質類、黃酮類和有機酸類物質，其中鞣花酸醇提法獲得率最高可達0.049 mg/g[21]，因此可使藥物發(fā)揮較好的效果；丁香與肉桂醇提法具有抑菌效果，水提法丁香、肉桂無抑菌效果，原因主要與丁香、肉桂所含成分有關，其主要含有丁香酚、肉桂醛等揮發(fā)性成分，在傳統(tǒng)煎煮法中易使有效成分揮發(fā)掉，不利于有效成分的保留，據(jù)Prabuseenivasan等[22]研究丁香精油與肉桂精油對大腸桿菌的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，丁香精油MIC為1.6～6.4 mg/mL，肉桂精油MIC為0.8～3.2 mg/mL，抑菌效果較顯著。②醇提法與傳統(tǒng)煎煮法提取同一種藥物的抑菌效果相同，如五味子2種提取方法均具有較好的抑菌效果，據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，五味子屬于廣譜抑菌藥物，可以改變大腸桿菌細胞膜的通透性，從而影響菌株線粒體內(nèi)膜及細菌的能量代謝和蛋白質的合成，因此五味子具有較好的抑菌效果[23]。③水提取法抑菌效果優(yōu)于醇提取法，如夏枯草主要含有一些萜類及黃酮類化合物，屬于水溶性成分，傳統(tǒng)煎煮法更有利于藥物成分的保留，王放銀等[24]研究夏枯草傳統(tǒng)煎煮法對大腸桿菌的抑菌效果表明，IZD為10.22 mm，MIC為1.2 mg/mL，因此，夏枯草傳統(tǒng)煎煮法具有較好的抑菌效果。在藥物聯(lián)合用藥中，五味子與烏梅抑菌效果最優(yōu)，抑菌直徑為26.00 mm，MIC、MBC均為3.97 mg/mL，烏梅與五味子聯(lián)合用藥表現(xiàn)出協(xié)同作用，原因如下：①烏梅性平，歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)，具有斂肺、澀腸、生津作用，臨床中常用于治療久瀉久痢，其含有多種有機酸成分，可抑制細菌的生長；②五味子性溫，歸肺經(jīng)、心經(jīng)、腎經(jīng)，具有收斂固澀、益氣生津的作用，屬于斂肺澀腸藥，臨床中常用于治療久瀉不止，其主要含有木質素，具有抗菌作用，因此，烏梅與五味子聯(lián)合用藥可使藥效不斷增加，發(fā)揮出較好的抑菌效果。本研究對單味及復方中草藥進行體外抑菌效果篩選，為這幾種藥物的配伍使用及奶牛源大腸桿菌病的中草藥防治提供參考，但中草藥藥物成分復雜多樣，不同的藥物對菌株的抑制機理還需要進一步探究，其中中草藥提取方法及提取條件仍需進一步優(yōu)化。

4 結 論

本研究成功分離出致病性奶牛源大腸桿菌菌株，水提取法中單味中草藥五倍子、五味子抑菌效果最明顯；醇提取法中五倍子抑菌效果最明顯；烏梅和五味子聯(lián)合用藥抑菌效果最明顯。