脂聯(lián)素參與七氟醚預(yù)處理保護心肌缺血再灌注損傷后小鼠認(rèn)知功能的機制研究*

王春暉，岳毅，劉少凱，劉小霞，柳元楨，張彥清

（1.山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，山西太原 030001；2.武警山西總隊醫(yī)院神經(jīng)外科，山西太原 030006；3.山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，山西太原 030001）

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction, POCD）是指患者手術(shù)麻醉后出現(xiàn)思維、行為、學(xué)習(xí)、記憶和注意力等認(rèn)知和腦功能的改變[1-2]。在體外循環(huán)下的心臟手術(shù)中，心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reperfusion, MIR）是不可或缺的環(huán)節(jié)。POCD 已經(jīng)成為此類手術(shù)最常見的并發(fā)癥[3]。如何最大限度減輕MIR 相關(guān)的POCD 和腦功能損傷是目前心腦血管領(lǐng)域亟須解決的重大問題和臨床需求。

有研究表明[4-5]，以七氟醚為代表的揮發(fā)性麻醉藥物預(yù)處理可以減輕MIR 引起的POCD，然而其機制尚未完全明確。脂聯(lián)素是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其在一定程度上延緩了POCD 的發(fā)生發(fā)展[6-7]，但尚不清楚七氟醚預(yù)處理的保護機制是否與脂聯(lián)素的上調(diào)有關(guān)。

本研究使用野生健康成年SPF 級雄性C57BL/6小鼠和健康成年SPF 級雄性脂聯(lián)素基因敲除（adiponectin knock-out, APN KO）小鼠，復(fù)制MIR 模型，擬從多角度闡述脂聯(lián)素在七氟醚預(yù)處理保護MIR 模型小鼠認(rèn)知功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

野生健康成年SPF 級雄性C57BL/6 小鼠30 只，鼠齡8～10 周，體重20～25 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[動物實驗生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉）2015-0001]；健康成年SPF 雄性APN KO 小鼠40 只，鼠齡8～10 周，體重20～25 g，由上海南方模式生物科技有限公司提供[動物實驗生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉）2015-0001]。七氟醚（上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，國字準(zhǔn)藥H20070172，規(guī)格：100 mL），小鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫雙抗夾心法試劑盒（美國博士德生物工程有限公司，EK0596），脂聯(lián)素替代劑（AdipoRon）（美國Med Chem Express 公司），2%七氟烷（上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號：19101331）。小動物呼吸機（美國Harvard 公司）。

1.2 動物分組與模型復(fù)制

C57BL/6 小鼠隨機分為sham 組、MIR-Control 組及MIR-SevoPre 組，每組10 只。APN KO 小鼠隨機分為KO-sham 組、KO-MIR-Control 組、KO-MIR-Sevopre組及KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組，每組10 只。MIR-Control 組、MIR-SevoPre 組、KO-MIR-Control、KO-MIR-Sevopre 組、KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支30 min 恢復(fù)灌注的方法復(fù)制MIR 模型；sham 組和KO-sham 組只穿線不結(jié)扎； MIR-SevoPre 組、KO-MIR-Sevopre 組和KOMIR-Sevopre-AdipoRon 組小鼠置于麻醉罐中，通入2%七氟烷10 min 后通入95%O2-5%CO2，循環(huán)3 次，每次間隔15 min。KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組：模型復(fù)制前10 min，七氟醚預(yù)處理的APN KO 小鼠口服溶于玉米油的AdipoRon 20 mg/kg。

1.3 Morris水迷宮實驗

3 組C57BL/6 小鼠及4 組APN KO 小鼠均在模型復(fù)制或?qū)φ仗幚砗蟮? 天、第2 天、第4 天進行Morris 水迷宮實驗。參照BARNHART 等的方法[9]，每次將小鼠分別從1、2、4 象限中點放入水池，記錄小鼠的游泳速率和找到平臺時間，即潛伏期，假如小鼠在1 min內(nèi)還沒找到平臺，引導(dǎo)小鼠到平臺上停留20 s，潛伏期按1 min 計。

1.4 血漿脂聯(lián)素水平

采集3 組C57BL/6 小鼠在模型復(fù)制或?qū)φ仗幚砗?4 h 的頸總動脈血2.5 mL，4℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照小鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫雙抗夾心法試劑盒說明書測定脂聯(lián)素水平。使用三分位數(shù)作為節(jié)點，將脂聯(lián)素水平分為高分子量、中分子量、低分子量3 種，比較3 組C57BL/6 小鼠的總脂聯(lián)素、高分子量脂聯(lián)素、中分子量脂聯(lián)素、低分子量脂聯(lián)素水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2010 建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；采用Pearson 法檢驗相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組C57BL/6小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比較

3 組C57BL/6 小鼠模型復(fù)制后第1 天、第2 天和第4 天的游泳速率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的小鼠游泳速率無差異（F=0.543，P=0.584）；②3 組小鼠游泳速率無差異（F=52.907，P=0.375）；③3 組小鼠游泳速率的變化趨勢無差異（F=1.266，P=0.295）。見表1。

表1 3組C57BL/6小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比較 （n=10，cm/s，±s）

表1 3組C57BL/6小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比較 （n=10，cm/s，±s）

組別sham組MIR-Control組MIR-Sevopre組第1天17.72±0.61 17.62±0.43 17.11±0.68第2天17.43±0.48 17.45±0.50 17.32±0.79第4天17.47±0.39 17.76±0.55 17.33±0.53

2.2 3組C57BL/6小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較

3 組C57BL/6 小鼠模型復(fù)制后第1 天、第2 天和第4 天的潛伏期比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的小鼠潛伏期有差異（F=1662.005，P=0.000）；②3 組小鼠的潛伏期有差異（F=38.685，P=0.000），與sham 組比較，MIR-Control 組各時間點潛伏期延長（P＜0.05），與MIR-Control 組比較，MIR-Sevopre 組小鼠各時間點潛伏期縮短（P＜0.05）；③3 組小鼠的潛伏期變化趨勢有差異（F=5.870，P=0.002）。見表2。

表2 3組C57BL/6小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較 （n=10，s，±s）

表2 3組C57BL/6小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較 （n=10，s，±s）

注：①與sham 組比較，P ＜0.05；②與MIR-Control 組比較，P ＜0.05。

第4天10.29±0.97 15.57±1.27①10.22±1.28②組別sham組MIR-Control組MIR-Sevopre組第1天34.09±1.35 35.41±3.20①34.30±1.63②第2天26.73±0.98 30.06±1.23①27.26±1.09②

2.3 3組C57BL/6小鼠的脂聯(lián)素水平比較

3 組C57BL/6 小鼠的脂聯(lián)素水平比較，采用方差分析，總脂聯(lián)素、高分子量脂聯(lián)素、中分子量脂聯(lián)素差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低分子量脂聯(lián)素差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；進一步兩兩比較，與sham 組相比，MIR-Control 組血漿總脂聯(lián)素、高分子量脂聯(lián)素、中分子量脂聯(lián)素水平降低（P＜0.05），與MIR-Control 組相比，MIR-Sevopre 組血漿總脂聯(lián)素、高分子量脂聯(lián)素、中分子量脂聯(lián)素水平升高（P＜0.05）。見表3。

表3 3組C57BL/6小鼠的脂聯(lián)素水平比較（n=10，μg/mL，±s）

表3 3組C57BL/6小鼠的脂聯(lián)素水平比較（n=10，μg/mL，±s）

注：①與sham 組比較，P ＜0.05；②與MIR-Control 組比較，P ＜0.05。

分組總脂聯(lián)素sham組MIRControl組MIRSevopre組F 值P 值8.98±0.16 4.99±0.14①高分子脂聯(lián)素3.59±0.24 1.98±0.13①中分子脂聯(lián)素1.98±0.11 1.48±0.11①低分子脂聯(lián)素1.48±0.09 1.48±0.10 7.76±0.16②2.53±0.15②1.67±0.11②1.45±0.09 0.688 0.511 170.261 0.000 6.461 0.000 16.978 0.000

2.4 3 組C57BL/6 小鼠認(rèn)知功能與脂聯(lián)素水平的相關(guān)性

Sham 組小鼠的潛伏期與脂聯(lián)素水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.480，P=0.033），MIR-Control 組小鼠的潛伏期與脂聯(lián)素水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.300，P=0.040），MIR-Sevopre 組小鼠的潛伏期與脂聯(lián)素水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.730，P=0.019）。

2.5 4組APN KO小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較

4 組APN KO 小鼠模型復(fù)制后第1 天、第2 天和第4 天的潛伏期比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點小鼠潛伏期有差異（F=1428.137，P=0.000）；②4 組小鼠的潛伏期有差異（F=34.611，P=0.000），與KO-sham 組比較，KOMIR-Control 組潛伏期延長（P＜0.05）；與KO-MIRControl 組相比，KO-MIR-Sevopre 組潛伏期無差異（P＞0.05）；與KO-MIR-Sevopre 組比較，KO-MIRSevopre-AdipoRon 組潛伏期縮短（P＜0.05）；③4 組小鼠潛伏期的變化趨勢無差異（F=2.054，P=0.069）。見表4。

表4 4組APN KO小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較 （n=10，s，±s）

表4 4組APN KO小鼠模型復(fù)制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較 （n=10，s，±s）

注：①與KO-sham 組比較，P ＜0.05；②與KO-MIR-Sevopre 組比較，P ＜0.05。

?組別KO-sham組KO-MIR-Control組KO-MIR-Sevopre組KO-MIR-Sevopre-AdipoRon組第1天35.90±3.73 41.90±2.13①37.50±1.58 36.90±2.02②第2天31.90±1.91 37.60±1.51①34.00±2.45 32.30±2.31②第4天11.30±1.49 16.30±2.21①15.00±1.70 14.20±1.75②

3 討論

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種多功能蛋白[10]，對認(rèn)知相關(guān)疾病具有保護作用[11]，本團隊前期實驗結(jié)果表明脂聯(lián)素參與了七氟醚預(yù)先給藥改善MIR 小鼠的認(rèn)知功能的過程[12]，但是這種作用是否與血漿脂聯(lián)素水平升高有關(guān)，兩者之間是否具有劑量依賴性仍未可知。

MIR 是臨床常見的病理生理現(xiàn)象，心臟血液的再灌注會引起機體體內(nèi)生理環(huán)境失衡，并對心[13]、腦[4]等多個臟器產(chǎn)生影響[14]，本研究結(jié)果同樣證明在MIR 后24 h MIR-Control 組和KO-MIR-Control 組的水迷宮潛伏期延長，認(rèn)知功能受損。同時本研究結(jié)果顯示模型復(fù)制后各組小鼠游泳速率無明顯差異，這提示MIR 影響C57BL/6 小鼠的認(rèn)知功能但并不影響小鼠的運動功能。有研究表明，七氟醚等[4，15]揮發(fā)性氣體對MIR 相關(guān)的認(rèn)知障礙具有延緩作用，本研究結(jié)果同樣顯示KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組潛伏期縮短，認(rèn)知功能改善。有研究顯示，MIR 血液中的脂聯(lián)素水平降低[16-17]，而脂聯(lián)素水平與認(rèn)知功能相關(guān)[7，11]，與本研究結(jié)果一致。本研究通過對3 組C57BL/6 小鼠的脂聯(lián)素水平和認(rèn)知功能進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間呈負(fù)相關(guān)。

2013年，東京大學(xué)OKADA-IWABU 教授等[18]篩選與脂聯(lián)素作用相似的小分子化合物并命名為脂聯(lián)素受體激動劑AdipoRon。AdipoRon 是否具有和脂聯(lián)素相似的認(rèn)知改善作用尚未被證實。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與KO-MIR-Sevopre 組比較，KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組潛伏期縮短，而KO-MIR-Control 組與KO-MIR-Sevopre 組之間無明顯差異，提示七氟醚發(fā)揮其保護作用與脂聯(lián)素有關(guān)。

本研究仍存在一些局限性：關(guān)于小鼠認(rèn)知能力的檢驗方法單一，應(yīng)采取行為學(xué)量表和認(rèn)知相關(guān)蛋白檢測相結(jié)合的方法，使實驗結(jié)果更全面客觀。此外，七氟醚預(yù)處理對MIR 損傷后小鼠認(rèn)知功能的保護作用是否是直接作用，還是通過降低損傷間接改善認(rèn)知功能仍是未知的，有待進一步研究。