補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞株間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究?

郭 帥，方 敬，郭立芳，王月華△，潘利敏△

(1.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050091；2.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050091；3.河北省中醫(yī)院，石家莊 050017)

隨著人們飲食習(xí)慣、生活方式的改變，以及人口老齡化的影響，預(yù)計(jì)到2035年全球糖尿病患者的數(shù)量將從2013年的3.82億人增加到5.92億人[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，已成為世界范圍內(nèi)引起終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因，也是糖尿病患者死亡的主要原因[2]。早期有效防治DN是當(dāng)今社會(huì)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，在減輕DN患者臨床癥狀、延緩疾病進(jìn)展等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。基于DN氣陰兩虛、腎絡(luò)瘀阻的基本病機(jī)，本課題組應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁治療DN取得了較好的臨床療效。新近研究表明，腎小管間質(zhì)纖維化是DN進(jìn)展至ESRD的重要病理基礎(chǔ)，而且比腎小球損傷更能預(yù)測(cè)腎臟疾病的進(jìn)展[3]。腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是介導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控EMT過程中發(fā)揮著重要作用[5-7]。課題組先前的研究已經(jīng)篩選出補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁干預(yù)DN的最佳中藥劑量，并證明其療效與陽(yáng)性對(duì)照藥物厄貝沙坦相當(dāng)[8-10]。本研究擬通過高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞，體外模擬DN腎小管上皮細(xì)胞的病理環(huán)境，觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁含藥血清對(duì)腎小管上皮細(xì)胞EMT及對(duì)Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路的影響，以進(jìn)一步闡釋補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁對(duì)DN的治療機(jī)制。本研究通過河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)2015-03)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，溫度20～25℃，濕度50%～70%，12 h/12 h光照/黑暗交替，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 細(xì)胞

條件性永生化人近端腎小管上皮細(xì)胞(human proximaltubular epithelial cell line,HK-2)購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.3 藥物

黃芪(批號(hào)0093253)、當(dāng)歸(批號(hào)0093103)、赤芍(批號(hào)0113103)、桃仁(批號(hào)0096363)、地龍(批號(hào)0106443)、僵蠶(批號(hào)0090403)、蟬蛻(批號(hào)9126463)、太子參(批號(hào)0111323)、白術(shù)(批號(hào)0113073)、澤蘭(批號(hào)0092583)、熟地黃(批號(hào)0101963)、山藥(批號(hào)0090453)、牡丹皮(批號(hào)0113783)、山茱萸(批號(hào)0102693)均為中藥顆粒劑，由廣東一方藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，購(gòu)自河北中醫(yī)學(xué)院國(guó)醫(yī)堂。

1.4 主要試劑及儀器

細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(美國(guó)MedChemExpress公司，cell counting kit-8,CKK8，貨號(hào)HY-K0301)；MEM 培養(yǎng)基(貨號(hào)11095-080)、胎牛血清(貨號(hào)10091-148)、青霉素/鏈霉素(貨號(hào)15070-063)、胰酶-EDTA溶液，美國(guó)GIBCO公司，0.25%，含酚紅，貨號(hào)25200-056；濃縮型正常山羊封閉血清(貨號(hào)AR1009)、熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)BA1032；Triton X-100(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)ST795)；鈣黏附蛋白-E(E-cadherin，貨號(hào)bs-1519R)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin alpha,α-SMA，貨號(hào)bs-10196R)、Wnt4(貨號(hào)BS6134R)、β-catenin(貨號(hào)BS1165R)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液(北京索來寶科技有限公司,貨號(hào)R0020)；ECL發(fā)光試劑盒(貨號(hào)sc-2048)、山羊抗兔二抗(貨號(hào)ZB2301)、β-actin(貨號(hào)TA-09)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司，貨號(hào)IPVH00010)。

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；MCO-15AC 型CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；Flexstation 3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；22331 hamburg型蛋白濃度定量?jī)x，德國(guó)Eppendorf公司；GENESYS50型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Spectronic公司；DYCZ-24DN型電泳儀，北京六一生物技術(shù)有限公司；WSE-4040型半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)，美國(guó)Atento公司。

1.5 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)

1.5.1 細(xì)胞復(fù)蘇 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)基：MEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素溶液。將HK-2細(xì)胞從液氮中取出快速放入37 ℃水浴鍋中，輕搖凍存管使凍存液溶解；溶解后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中，離心收集細(xì)胞；用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.5.2 細(xì)胞傳代 細(xì)胞的密度達(dá)到80%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)基，PBS洗1次，加1～2 mL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞顯微鏡下觀察，1～2 min后見細(xì)胞相互分離變圓即表示消化完成，快速棄去胰酶，加入完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1∶3的比例傳代，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.6 藥物血清制備

補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁成人臨床使用劑量為：黃芪30 g，當(dāng)歸10 g，赤芍10 g，桃仁10 g，地龍12 g，僵蠶10 g，蟬蛻6 g，太子參15 g，茯苓15 g，白術(shù)10 g，澤蘭10 g，熟地黃15 g，山藥15 g，牡丹皮10 g，山茱萸10 g。按照人和大鼠體表面積法計(jì)算大鼠的給藥劑量為黃芪2.7 g/(kg·d)，當(dāng)歸0.9 g/(kg·d)，赤芍0.9 g/(kg·d)，桃仁0.9 g/(kg·d)，地龍1.08 g/(kg·d)，僵蠶0.9 g/(kg·d)，蟬蛻0.54 g/(kg·d)，太子參1.35 g/(kg·d)，茯苓1.35 g/(kg·d)，白術(shù)0.9 g/(kg·d)，澤蘭0.9 g/(kg·d)，熟地黃1.35 g/(kg·d)，山藥1.35 g/(kg·d)，牡丹皮0.9 g/(kg·d)，山茱萸0.9 g/(kg·d)。

實(shí)驗(yàn)大鼠10只適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為空白血清組5只和中藥血清組5只。中藥血清組大鼠給予中藥補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁，空白血清組大鼠給予等體積飲用水，每日分2次灌胃，連續(xù)7 d。第7天2次灌胃間隔2 h，并于末次灌胃1 h后，稱體質(zhì)量、腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主動(dòng)脈取血，將血清放入56 ℃水浴中滅活30 min，無菌細(xì)胞過濾器去除細(xì)菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 CKK8法篩選最佳藥物血清濃度及干預(yù)時(shí)間

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HK-2細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接入96孔板，同時(shí)設(shè)不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白組，37 ℃培養(yǎng)過夜(在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL無菌PBS)；按照如下分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理：HK-2細(xì)胞對(duì)照組，HK-2細(xì)胞+5%空白血清組，HK-2細(xì)胞+10%空白血清組，HK-2細(xì)胞+15%空白血清組，HK-2細(xì)胞+20%空白血清組，HK-2細(xì)胞+25%空白血清組 ，HK-2細(xì)胞+5%中藥血清組，HK-2細(xì)胞+10%中藥血清組，HK-2細(xì)胞+15%中藥血清組，HK-2細(xì)胞+20%中藥血清組，HK-2細(xì)胞+25%中藥血清組，作用時(shí)間設(shè)置6 h、12 h、24 h及48 h。細(xì)胞培養(yǎng)至所需時(shí)間后每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm吸光值(optical density,OD)。計(jì)算各組HK-2細(xì)胞增殖率：增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 分組

根據(jù)CCK8篩選出最佳空白血清和中藥血清給藥濃度均為10%，最佳干預(yù)時(shí)間為48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組如下：正常組(葡萄糖5.5 mmol/L+10%空白血清)、對(duì)照組(葡萄糖5.5 mmol/L+10%中藥血清)、模型組(葡萄糖30 mmol/L+10%空白血清)、中藥組(葡萄糖30 mmol/L+10%中藥血清)，各組細(xì)胞干預(yù)48 h行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.9 免疫熒光法檢測(cè)HK-2細(xì)胞中E-cadherin及α-SMA的表達(dá)

在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗。4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100室溫通透滴加正常山羊血清封閉，滴加稀釋好的一抗(E-cadherin 1∶25，α-SMA 1∶100)4 ℃孵育過夜。PBST浸洗后滴加稀釋好的熒光二抗(1∶100)，37 ℃孵育1 h。滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下采集圖像。

1.10 Western blot法檢測(cè)HK-2細(xì)胞中Wnt4及β-catenin的表達(dá)

取1×106個(gè)細(xì)胞加入100uL RIPA裂解液，4 ℃冰箱過夜。離心取上清調(diào)整蛋白濃度，變性、電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉后，4 ℃加一抗(Wnt4 1∶600，β-catenin 1∶800)孵育過夜，37 ℃加二抗(1∶3000)孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯色。掃描膠片，Image J軟件測(cè)定條帶灰度值。以目的條帶與β-actin灰度值的比值來表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各干預(yù)時(shí)間(12 h、24 h、48 h)不同濃度大鼠血清對(duì)HK-2增殖率的影響

表1示，根據(jù)CCK8法篩選出最佳空白血清和中藥血清給藥濃度均為10%，最佳干預(yù)時(shí)間為48 h。

表1 各干預(yù)時(shí)間不同濃度大鼠血清對(duì)HK-2增殖率影響比較

2.2 各組HK-2細(xì)胞形態(tài)變化比較

倒置顯微鏡下觀察各組HK-2細(xì)胞形態(tài)，正常組HK-2細(xì)胞呈“鵝卵石”鋪路狀且排列緊密；對(duì)照組HK-2形態(tài)較正常組無明顯變化；模型組HK-2細(xì)胞變成長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間隙變大；中藥組HK-2細(xì)胞形態(tài)及密度有一定逆轉(zhuǎn)(見圖1)。

圖1 各組HK-2細(xì)胞形態(tài)的變化(倒置顯微鏡×100)

2.3 各組HK-2細(xì)胞中E-cadherin及α-SMA表達(dá)比較

免疫熒光結(jié)果顯示，正常組E-cadherin主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，而α-SMA在細(xì)胞漿中有少量表達(dá)。與正常組比較，對(duì)照組中E-cadherin和α-SMA的表達(dá)無明顯變化。與正常組比較，模型組中E-cadherin表達(dá)減少，而α-SMA表達(dá)增多。中藥血清處理后，E-cadherin表達(dá)增多，而α-SMA表達(dá)減少，提示中藥血清可以抑制高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的EMT(見圖2)。

2.4 各組HK-2細(xì)胞中Wnt4及β-catenin表達(dá)的比較

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，對(duì)照組Wnt4及β-catenin的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組Wnt4及β-catenin的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，中藥組Wnt4及β-catenin的表達(dá)量均顯著減少(P<0.01)，提示中藥血清可以抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活(見圖3)。

注：鈣黏附蛋白-E(E-cadherin)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin alpha,α-SMA)圖2 各組HK-2細(xì)胞中E-cadherin及α-SMA表達(dá)比較(免疫熒光×200)

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01圖3 各組HK-2細(xì)胞中Wnt4及β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)

3 討論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁治療DN是基于中醫(yī)理論對(duì)DN的認(rèn)識(shí)及全國(guó)名老中醫(yī)趙玉庸教授“腎絡(luò)瘀阻”學(xué)說[11]，并結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)提出的。本課題組認(rèn)為DN的基本病機(jī)為氣陰兩虛、氣虛無力運(yùn)血?jiǎng)t血行遲緩，日久可致血瘀；陰虛火旺，煎熬津液，則津虧血少，血液黏稠不暢，日久而致痰凝、血瘀，病久不愈深伏于腎絡(luò)漸成微小癥積，致使腎體受損，腎用失司、腎失封藏、精微滲漏導(dǎo)致DN的發(fā)生。補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清代醫(yī)家王清任所著《醫(yī)林改錯(cuò)》，由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花和桃仁組成，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之功效，是益氣活血法的代表方劑，也是臨床治療慢性腎臟疾病的常用方。參芪地黃湯源于清代醫(yī)家沈金鰲編撰的《沈氏尊生書》，由人參、黃芪、熟地黃、牡丹皮、茯苓、澤瀉、山藥、山茱萸組成，具有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)腎健脾的功效，為益氣養(yǎng)陰之要藥。補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁是在補(bǔ)陽(yáng)還五湯和參芪地黃湯基礎(chǔ)上去川芎、紅花，加僵蠶、蟬蛻以增強(qiáng)入腎絡(luò)搜剔之效，加白術(shù)以助黃芪健脾益氣之功而成。以補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁治療DN可謹(jǐn)守病機(jī)，抓住主癥，行益氣、養(yǎng)陰、活血、消癥、通絡(luò)之功。

腎小管間質(zhì)纖維化是DN進(jìn)展至ESRD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為，EMT是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[4]。近年來人們普遍認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的主要細(xì)胞[12]，而肌成纖維細(xì)胞的來源主要是腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。研究證實(shí)，在腎纖維化過程中，高達(dá)36%的肌成纖維細(xì)胞來源于局部腎小管上皮細(xì)胞EMT[13]。EMT包括腎小管上皮細(xì)胞失去其上皮表型(如E-cadherin)，腎小管基底膜破壞，部分腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)入腎間質(zhì)，獲得間充質(zhì)表型(如α-SMA)而轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞。同時(shí)，這一過程中包含著腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)的改變及極性的消失[14，15]。高血糖是DN基本的代謝特征，是誘導(dǎo)EMT的主要因素之一。本研究通過高血糖誘導(dǎo)HK-2建立DN模型，與正常組比較，對(duì)照組HK-2細(xì)胞形態(tài)、E-cadherin和α-SMA的表達(dá)無明顯變化，說明補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁本身對(duì)細(xì)胞無毒副作用；模型組HK-2細(xì)胞形態(tài)改變，E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA表達(dá)增多，提示HK-2細(xì)胞發(fā)生了EMT。補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁血清可以在一定程度上改善腎小管上皮細(xì)胞EMT。

腎小管上皮細(xì)胞EMT是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，涉及多種細(xì)胞因子及多條信號(hào)通路[16-18]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT的主要途徑。在生理情況下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡和遷移中起關(guān)鍵作用[19]。在DN中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，β-catenin磷酸化被阻斷，泛素降解減少，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)Snail和Twist等靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制E-cadherin的表達(dá)并增加纖連蛋白、α-SMA和波形蛋白的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生[20，21]。另外研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以與Notch1/Jagged-1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/smad、Janus蛋白酪氨酸激酶2(janus kinase 2,JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases,p38 MAPK)等信號(hào)通路相互作用，共同促進(jìn)EMT的發(fā)生和進(jìn)展[22-24]。Wnt-4是Wnt家族的重要成員，對(duì)于EMT的發(fā)生起著重要作用。在本研究中，與正常組比較，模型組Wnt/β-catenin信號(hào)通路顯著激活。補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁血清可以顯著降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。

綜上所述，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了補(bǔ)陽(yáng)還五湯合參芪地黃湯化裁能改善腎小管上皮細(xì)胞EMT，其機(jī)制可能與其抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活有關(guān)。