蘆蒿莖尖組織培養(yǎng)體系建立的研究

吳偉文，黃 晶，潘 軍，成 雨，高紅勝

（1 揚(yáng)州大學(xué)現(xiàn)代園藝科技創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225001；2 南京鸝島現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇南京 210043；3 揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225001）

蘆蒿大多為野生，主要分布在長(zhǎng)江中下游、東北、華北和中南等地區(qū)[11-13]。由于種子難以成熟，人工栽培蘆蒿多以地下莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，連年種植，病毒感染，產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響野生蘆蒿產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境[14]。試驗(yàn)利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)研究蘆蒿高效增殖和生根的理想植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比和基本培養(yǎng)基種類(lèi)，建立蘆蒿高效再生體系，以實(shí)現(xiàn)蘆蒿脫毒、種苗快速繁殖，為蘆蒿的人工種植提供優(yōu)質(zhì)種苗，提高產(chǎn)量與品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所需蘆蒿均采自南京八卦洲，主要品種有青蒿、白蒿、紅蒿以及江灘野生品種，移栽至揚(yáng)州大學(xué)現(xiàn)代園藝產(chǎn)業(yè)研究院試驗(yàn)基地內(nèi)，移栽成活后，選取生長(zhǎng)旺盛的蘆蒿嫩莖作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒。剪取3～5cm 長(zhǎng)的嫩莖頭，去除葉片，放進(jìn)加入洗潔精的自來(lái)水中清洗，取出后用自來(lái)水流水沖洗。再用4%的次氯酸鈉溶液消毒15min。隨后將消毒好的蘆蒿移至超凈工作臺(tái)上，用70%的酒精浸泡10s，之后立即用無(wú)菌水沖洗2～3次。再浸泡于滴加1～2 滴吐溫20 的0.1%升汞溶液中消毒8～10min，再用無(wú)菌水沖洗5～6 次。在顯微鏡下挑取0.2～0.4mm 的莖尖培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25℃，光照14h/d，光照強(qiáng)度1000～2000 Lx。

污染率（%）=污染莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100

褐化率（%）=褐化莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100

成活率（%）=誘導(dǎo)成活莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100

1.2.2 初代培養(yǎng)。將已消毒的蘆蒿莖尖接種到添加不同濃度6-BA（0、0.05、0.5、1mg/L）和NAA（0、0.01、0.05、0.1mg/L）的MS 初代培養(yǎng)基（瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH值5.8）中，共15 組處理，標(biāo)記為T(mén)1～T15，每組接種10瓶，重復(fù)3 次。接種30 d 后統(tǒng)計(jì)蘆蒿莖尖誘導(dǎo)分化率。

誘導(dǎo)分化率（%）=萌發(fā)芽的莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100

1.2.3 增殖培養(yǎng)。配制6-BA 濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L 的增殖培養(yǎng)基，剝?nèi)〕醮囵B(yǎng)后的蘆蒿莖尖分別接種至增殖培養(yǎng)基（瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH值5.8）中，共5 組處理，標(biāo)記為F1～F5，每組接種10 瓶，重復(fù)3 次。接種30d 后統(tǒng)計(jì)蘆蒿莖尖增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=增殖數(shù)/原個(gè)體數(shù)

1.2.4 生根培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)情況良好的蘆蒿無(wú)菌苗單株，將其分成莖頭和莖段2 部分，去除莖段基部組織及根系，剪成2～3cm 長(zhǎng)，將莖頭和莖段分別接種至MS 和1/2 MS 生根培養(yǎng)基（NAA）中。接種時(shí)，務(wù)必使蘆蒿形態(tài)學(xué)下端與培養(yǎng)基緊密接觸，每瓶接種5～6 棵蘆蒿外植體。每個(gè)處理接種10 瓶，重復(fù)3 次。接種30d 后觀察蘆蒿苗生根情況，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、生根率、生根時(shí)間、根長(zhǎng)、根粗等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA 和NAA 不同濃度組合對(duì)蘆蒿莖尖分化的影響

圖1 蘆蒿莖尖組織初代培養(yǎng)

由表1 可知，蘆蒿莖尖在只添加6-BA 的情況下，在濃度0.05～1.0mg/L 范圍內(nèi)均能分化，且莖尖分化率均高，但是新芽密集度高，并不伸長(zhǎng)；在只添加NAA 的情況下，低濃度的NAA 其效果較好，濃度越高，蘆蒿莖尖分化率越低，甚至不萌發(fā)或者死亡；在6-BA 和NAA不同濃度組合的處理中，處理T10（6-BA 0.5mg/L+NAA 0.01mg/L）效果最好，蘆蒿莖尖分化形成密集芽叢，并有芽伸長(zhǎng)，芽叢顏色轉(zhuǎn)深綠。

表1 6-BA 和NAA 不同濃度組合對(duì)蘆蒿莖尖增殖分化的影響

2.2 6-BA 不同濃度處理對(duì)蘆蒿莖尖增殖的影響

由表2 可知，各處理均能使蘆蒿莖尖增殖，整體上看，增殖系數(shù)隨著6-BA 濃度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其中F3處理的增殖系數(shù)明顯高于其他處理。在6-BA 濃度為0.5 mg/L 時(shí)，增殖系數(shù)最高，隨后濃度越高，增殖系數(shù)反而越低。

表2 6-BA 不同濃度處理對(duì)蘆蒿莖尖增殖的影響

2.3 不同培養(yǎng)基及激素處理對(duì)蘆蒿生根的影響

由表3 可知，不同培養(yǎng)基及激素處理均能使蘆蒿生根，整體上看，與1/2MS 培養(yǎng)基相比較，在MS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的蘆蒿其所需的平均生根時(shí)間較短，平均生根數(shù)量及平均根長(zhǎng)均高于1/2MS 培養(yǎng)基，但根系粗度略小于1/2MS 培養(yǎng)基。

表3 不同培養(yǎng)基及濃度激素處理對(duì)蘆蒿生根的影響

在NAA 0.05mg/L 的MS 培養(yǎng)基中，蘆蒿生根所需的時(shí)間最短，且平均生根數(shù)量最多；在NAA 濃度為0.01mg/L 的MS 培養(yǎng)基中，平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)；在NAA 濃度為0.05mg/L 的1/2MS 培養(yǎng)基中，平均根粗最粗。

圖2 不同培養(yǎng)基及濃度激素處理對(duì)蘆蒿生根數(shù)和根長(zhǎng)的影響

2.4 不同接種部位對(duì)蘆蒿生根的影響

在前期研究基礎(chǔ)上，在MS+NAA（0.05mg/L）的條件下，分別接種蘆蒿莖尖和莖段部位，研究其對(duì)蘆蒿生根的影響，結(jié)果如表4 所示，用蘆蒿莖尖接種生根，其根系平均長(zhǎng)度和粗度均大于用莖段生根；而用蘆蒿莖段接種生根，其生根所需的時(shí)間明顯短于莖尖，并且根系數(shù)量顯著多于莖尖。

表4 不同接種部位對(duì)蘆蒿生根的影響

3 討論

生產(chǎn)上蘆蒿多為無(wú)性繁殖，農(nóng)戶(hù)們直接利用莖段進(jìn)行扦插，多年來(lái)導(dǎo)致蘆蒿品種混雜，品性退化，病害加重[15]。目前，對(duì)蘆蒿的研究主要集中在蘆蒿中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的成分和種類(lèi)鑒定、純化提取、病害防治以及栽培技術(shù)等方面[16-17]。郝夢(mèng)潔等[6-7]對(duì)蘆蒿組培技術(shù)開(kāi)展了研究，主要建立了蘆蒿的再生體系，誘導(dǎo)莖段上生長(zhǎng)點(diǎn)快速再生，并非蘆蒿莖尖組織培養(yǎng)。本研究利用蘆蒿莖尖建立莖尖組織培養(yǎng)體系，為培育品種純、種性好的脫毒蘆蒿種苗奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在蘆蒿莖尖組織初代培養(yǎng)過(guò)程中，適宜濃度的6-BA 和NAA 都對(duì)蘆蒿莖尖分化起了關(guān)鍵作用。各個(gè)濃度的6-BA 均能促進(jìn)莖尖分化，隨著濃度增加，莖尖分化率先上升后下降，高濃度的6-BA 效果有所下降；低濃度的NAA 有利于誘導(dǎo)莖尖分化，隨著濃度增加，莖尖的分化率降低；在6-BA 和NAA 不同濃度組合處理中，T10（6-BA 0.5mg/L+NAA 0.01mg/L）效果最好，蘆蒿莖尖分化形成密集芽叢，并且有芽伸長(zhǎng)，芽叢顏色轉(zhuǎn)深綠。

在植物組織培養(yǎng)研究中，細(xì)胞分裂素能夠促進(jìn)細(xì)胞的分裂和芽的分化，6-BA 是常用最普遍的細(xì)胞分裂素之一。陳銀鳳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA 濃度在2mg/L以上時(shí)，蝴蝶蘭原球莖的增殖系數(shù)開(kāi)始下降；郝夢(mèng)潔[7]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA 濃度大于0.4mg/L 時(shí)，對(duì)蘆蒿生長(zhǎng)點(diǎn)的增殖分化具有抑制作用，增殖系數(shù)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，符合本研究的結(jié)論。

在蘆蒿生根試驗(yàn)中，各個(gè)處理均能使蘆蒿生根，且不同處理對(duì)蘆蒿根系的生長(zhǎng)都有不同的促進(jìn)作用，其中MS 培養(yǎng)基相比較于1/2MS 培養(yǎng)基，對(duì)蘆蒿的生根時(shí)間、生根數(shù)量和長(zhǎng)度具有更好的促進(jìn)效果，但對(duì)根系粗的促進(jìn)作用小于1/2MS 培養(yǎng)基；在各個(gè)NAA 濃度中，0.05mg/L 對(duì)縮短蘆蒿生根時(shí)間、增加蘆蒿生根數(shù)量、粗度及長(zhǎng)度的效果最為明顯。利用蘆蒿莖段生根會(huì)相對(duì)快速容易，且根系較發(fā)達(dá)；利用莖尖生根則根系更粗、更長(zhǎng)。本研究表明，MS+NAA 0.05mg/L 是最適宜蘆蒿生根的培養(yǎng)基。在郝夢(mèng)潔等[6-7]研究中，MS 培養(yǎng)基和1/4MS 培養(yǎng)基比1/2MS 培養(yǎng)基和1/8MS 培養(yǎng)基能更高效誘導(dǎo)蘆蒿生根，0.1mg/L NAA 是最適宜誘導(dǎo)蘆蒿生根的激素濃度，本研究與其結(jié)論基本一致，其N(xiāo)AA 濃度梯度較大，未有0.05mg/L NAA 的數(shù)據(jù)。對(duì)此，在后續(xù)試驗(yàn)中會(huì)擴(kuò)大NAA 濃度梯度和培養(yǎng)基種類(lèi)，補(bǔ)充優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。