不同碳源對小球藻生長的影響

杜夢帆，王露

（長治學(xué)院 生命科學(xué)系，山西長治 046011）

小球藻是一種集眾多優(yōu)點和經(jīng)濟價值于一身，極具開發(fā)應(yīng)用潛力的生物質(zhì)能源，被廣泛應(yīng)用于環(huán)保、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、美容、食品和水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)[1]。為充分發(fā)揮小球藻的應(yīng)用價值，最重要的是要提高其生產(chǎn)能力。微藻生長情況受到多種環(huán)境因素的影響，如溫度、光強、鹽度、pH和培養(yǎng)基成分等[2]。

培養(yǎng)基中的碳源能為微生物體內(nèi)有機物質(zhì)的合成提供碳骨架，也為其生命活動提供必需的能量。不同的碳源參與微生物體內(nèi)碳代謝的途徑也不盡相同，對于促進微生物生長和油脂儲存的程度也有所差別[3]。謝林靜等[4]對比了葡萄糖和乙酸鈉作為碳源時C.protothecoides型小球藻的生物量，結(jié)果表明無論是單一培養(yǎng)或是混合培養(yǎng)，小球藻對葡萄糖的利用率都優(yōu)于乙酸鈉。梁長利等[5]對比了以葡萄糖、乙酸鈉和蔗糖作為唯一有機碳源時異養(yǎng)小球藻的生物累積量，結(jié)果排序為蔗糖＞葡萄糖＞乙酸鈉，并且高濃度葡萄糖和乙酸鈉會抑制其生長。

已有研究表明適中的溫度、光照強度以及堿性環(huán)境有助于小球藻迅速繁殖[6-8]，但最適碳源的種類與濃度，因藻種和品質(zhì)的不同而存在明顯差異。為探究某高品質(zhì)淡水小球藻的最適碳源種類，通過光密度OD680值、血球計數(shù)板和葉綠素含量綜合分析其在不同碳源條件下的生長規(guī)律，為后續(xù)研究和小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)提供一些有效的基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用小球藻（Chlorella）由上海光語生物科技有限公司提供。

硝酸鈉、EDTA-Na2、蔗糖，天津奧普升化工有限公司；磷酸氫二鉀、硫酸鎂、無水碳酸鈉、丙酮，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硼酸、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸、檸檬酸鐵胺，新鄉(xiāng)市化學(xué)試劑廠；鉬酸鈉、硫酸銅，天津市化學(xué)試劑四廠；無水氯化鈣，天津市天達凈化材料精細化工廠；硫酸鋅，天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；氯化錳，北京市朝陽區(qū)化工四廠；氯化鈷，沈陽市試劑二廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250A型生化培養(yǎng)箱，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司；FA224型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵，上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；BC/BD-1028T型海爾冰箱，青島海爾集團；Centrifuge 5424R型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；TU-181OS型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；B204LED型生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；SX-500型快速自動高壓滅菌鍋，日本TOMY公司。

1.3 小球藻擴培

本實驗采用BG-11培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)小球藻，培養(yǎng)基配方參考文獻[1]。取藻液和培養(yǎng)基按照體積比1∶4進行接種，在光照強度為3 000 lx，溫度為25 ℃和光暗比為12 h∶12 h的環(huán)境下培養(yǎng)5～7 d，待藻液顏色明顯加深后進行下一次擴培，直至藻液數(shù)量滿足后續(xù)實驗需求。

1.4 實驗設(shè)計

本實驗以不添加任何碳源的培養(yǎng)基作為空白樣。在保證培養(yǎng)基整體碳元素質(zhì)量不變的前提下，將BG-11培養(yǎng)基配方中的檸檬酸和碳酸鈉分別替換為葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和蔗糖。取對數(shù)生長期的小球藻藻液60 mL分別與60 mL滅菌的不同碳源培養(yǎng)液接種至250 mL的錐形瓶中，在1.3項條件下連續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.5 測定方法

本實驗以BG-11培養(yǎng)液做空白對照，用分光光度計測其在680 nm下的光密度值（OD680），連續(xù)監(jiān)測7 d后以天數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制小球藻的生長曲線。同時，培養(yǎng)7 d后用血球板計數(shù)法觀察小球藻的數(shù)量濃度，并以文獻[9]中的標(biāo)準(zhǔn)方法提取葉綠素，配合分光光度計測定藻液中葉綠素的濃度。每個處理組設(shè)置3個平行樣，最終結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 光密度值結(jié)果分析

不同碳源培養(yǎng)基的小球藻連續(xù)培養(yǎng)7 d后得到如圖1所示的生長曲線?？梢钥闯隹瞻捉M的小球藻在培養(yǎng)周期內(nèi)的光密度值趨于穩(wěn)定，與其他外加碳源的處理組相比長勢較弱，但也未出現(xiàn)衰亡的情況，表明小球藻可以利用大氣中的無機碳滿足其生長需要，但利用率低于各種外加有機碳源。此外，以葡萄糖為碳源的處理組中小球藻長勢最好，在培養(yǎng)周期內(nèi)小球藻生物量大致呈穩(wěn)步上升趨勢，蔗糖處理組次之。麥芽糖和淀粉處理組，從第3 d開始小球藻OD680基本相同，生物量緩慢增加隨后進入生長穩(wěn)定期。

圖1 不同碳源培養(yǎng)基的小球藻的生長曲線

2.2 血球板計數(shù)和葉綠素濃度結(jié)果分析

培養(yǎng)7 d后，對不同碳源培養(yǎng)基的小球藻進行血球板計數(shù)和葉綠素提取測定的結(jié)果見圖2?？瞻讟拥男∏蛟寮毎芏群腿~綠素累積量都是最小的，進一步證實小球藻在有機碳源培養(yǎng)下的生物量產(chǎn)率更高，而部分無機碳進入細胞后生成的CO32-可能會與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的Ca2+反應(yīng)生成沉淀，使碳源無法得到有效利用[8]。不同有機碳源處理組小球藻的增殖情況和葉綠素累積量差異較大。就血球計數(shù)板結(jié)果而言，不同碳源對小球藻生長的促進效果排序為單糖＞淀粉＞二糖，且二糖中麥芽糖高于蔗糖，這與張維國[10]的研究結(jié)果是一致的。葡萄糖是最簡單的糖類，可以直接被生物所吸收利用，是培養(yǎng)小球藻最理想的碳源。但對于葉綠素含量來說，葡萄糖作為碳源時，其葉綠素含量僅位于中等水平，這是因為小球藻利用葡萄糖的過程中會產(chǎn)生有機酸和CO2，使得培養(yǎng)體系的pH下降，而pH發(fā)生變化不利于葉綠素累積[5,11]。當(dāng)采用麥芽糖作為唯一有機碳源時，葉綠素累積量最高，可能是因為其pH變化幅度較小。

圖2 不同碳源處理組的血球板計數(shù)與葉綠素含量

3 結(jié)論

為探究某高品質(zhì)淡水小球藻的最適碳源，本文通過光密度OD680、血球計數(shù)板和葉綠素含量3個參數(shù)分析其在不同碳源條件下的生長規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組的小球藻生長最為緩慢卻未出現(xiàn)衰亡，表明小球藻可以利用大氣中的CO2作為碳源，但利用率較低；葡萄糖作為唯一碳源時，不利于葉綠素累積，但小球藻生物累積量和細胞密度均優(yōu)于其他各處理組，因此綜合判斷可認(rèn)為葡萄糖是培養(yǎng)該品質(zhì)小球藻最適宜的碳源。