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    仿生栽培鐵皮石斛內(nèi)生真菌QZQM08培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

    2022-09-20 09:18:02徐焰平
    生物化工 2022年4期
    關(guān)鍵詞:氮源內(nèi)生碳源

    徐焰平

    (泉州醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,福建泉州 362000)

    隨著抗生素的廣泛使用,細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題日益突出,尋找新的抗菌物質(zhì)是當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的主要任務(wù)之一,而從具有抑菌作用的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中篩選是其中一個(gè)重要途徑[1-2]。課題組前期從仿生栽培鐵皮石斛中分離到一株具有抑菌功能的內(nèi)生真菌QZQM08,其代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用[3]。為了更好研究代謝產(chǎn)物抑菌效果,通過(guò)開(kāi)展內(nèi)生真菌QZQM08培養(yǎng)條件優(yōu)化研究,找到適合該菌生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件,以期為篩選抑菌活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    內(nèi)生真菌QZQM08:分離自福建泉州仿生栽培鐵皮石斛,接種于PDA斜面培養(yǎng)基,低溫(4 ℃)保存于泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校健康學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)訓(xùn)室。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:稱取200 g馬鈴薯,洗凈去皮切片,加水1 L煮沸15 min,紗布過(guò)濾后再加20 g葡萄糖,加水補(bǔ)足至1 L[4]。

    馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基:將馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中的葡萄糖替換為20 g蔗糖,其他參數(shù)不變。

    馬丁氏培養(yǎng)基:葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、3‰孟加拉紅100 mL,定容至1 L。

    察氏培養(yǎng)基:硝酸鈉3 g,磷酸氫二鉀1 g,七水硫酸鎂0.5 g,氯化鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,蔗糖30 g,定容至1 L[5]。

    沙氏培養(yǎng)基:葡萄糖40 g,蛋白胨20 g,定容至1 L[6]。

    1.1.3 儀器設(shè)備

    BSC-1500ⅡA-X生物安全柜,濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司;Eclipse E200數(shù)碼顯微鏡,日本Nikon公司;DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HVE-50高壓滅菌鍋,日本Hirayama公司;KYC-100B恒溫培養(yǎng)搖床,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海合恒儀器設(shè)備有限公司;TDZ4-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

    1.1.4 試劑

    葡萄糖、蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、麥芽糖、乳糖、木糖、可溶性淀粉、脲、硝酸鉀和硝酸銨,分析純,廣州市西隴化工有限公司;牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉,生化試劑(BR),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    采用PDA培養(yǎng)基,將內(nèi)生真菌QZQM08放置于培養(yǎng)箱28 ℃活化培養(yǎng)5 d,用滅菌的雙蒸水沖洗真菌菌落表面孢子,配制成濃度為0.5×106~1.0×106個(gè)/mL的孢子溶液以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[7]。

    1.2.1 不同液體培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    在250 mL錐形瓶中分別裝入50 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基,分別接種1 mL孢子溶液。將錐形瓶放置于28 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)6 d[8]。培養(yǎng)結(jié)束后,將發(fā)酵培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管,8 000 r/min離心10 min,倒掉上層培養(yǎng)液后60 ℃烘干至恒重,稱量菌絲干重。每種培養(yǎng)基設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

    1.2.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將內(nèi)生真菌QZQM08分別置于20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃和45 ℃培養(yǎng),其他條件同1.2.1,每個(gè)溫度設(shè)置5 個(gè)重復(fù)[9]。

    1.2.3 不同pH對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將內(nèi)生真菌QZQM08分別接種于pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0的培養(yǎng)基,放置于恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng),其他條件同1.2.1,每個(gè)pH設(shè)置5個(gè)重復(fù)[10]。

    1.2.4 不同接種量對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別接種內(nèi)生真菌QZQM08孢子液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL,每個(gè)接種量設(shè)置5個(gè)重復(fù),其他培養(yǎng)條件同1.2.1[11]。

    1.2.5 不同碳源對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別以20 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖和可溶性淀粉作為碳源,每一種碳源設(shè)置5個(gè)重復(fù),其他培養(yǎng)條件同1.2.1[12-13]。

    1.2.6 不同氮源對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別加10 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、脲、硝酸鉀和硝酸銨作為氮源,每一種氮源設(shè)置5個(gè)重復(fù),其他培養(yǎng)條件同1.2.1[14-15]。

    1.2.7 正交試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,在影響較大的接種量、pH、碳源(葡萄糖)和氮源(酵母浸粉)4個(gè)因素中篩選出比較適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲生長(zhǎng)的3個(gè)水平,進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1),其他培養(yǎng)條件同1.2.1[16]。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

    1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    使用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行Duncan's多重比較分析,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的格式表示,P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    內(nèi)生真菌QZQM08在所選的5種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng),但是生長(zhǎng)速度有明顯的不同。從表2中還可以發(fā)現(xiàn),不同液體培養(yǎng)基上內(nèi)生真菌QZQM08的菌絲產(chǎn)量不同,按照菌絲產(chǎn)量排序?yàn)轳R鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基>沙氏培養(yǎng)基>馬丁氏培養(yǎng)基>馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基>察氏培養(yǎng)基,說(shuō)明內(nèi)生真菌QZQM08最適合在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

    表2 液體培養(yǎng)基類型對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    2.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    如表3所示,內(nèi)生真菌QZQM08在20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃均能生長(zhǎng),在45 ℃菌絲幾乎不生長(zhǎng);在28 ℃條件下內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量最大,說(shuō)明內(nèi)生真菌QZQM08最適合在28 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。

    表3 培養(yǎng)溫度對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    2.3 不同pH對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    如表4所示,內(nèi)生真菌QZQM08在所選pH供試培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng),在pH為5.0、5.5和6.0的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好,培養(yǎng)基pH=5.5時(shí)菌絲產(chǎn)量最大,說(shuō)明pH=5.5最適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲的生長(zhǎng)。

    表4 pH對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    2.4 不同接種量對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    如表5所示,接種量對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響不顯著,當(dāng)接種量為0.5 mL時(shí)已基本滿足培養(yǎng)要求,當(dāng)接種量為1.0 mL時(shí)菌絲產(chǎn)量最大,說(shuō)明較適合菌絲的生長(zhǎng),因此本研究其他單因素實(shí)驗(yàn)的接種量均為1.0 mL。

    表5 不同接種量對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    2.5 不同碳源對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    如表6所示,內(nèi)生真菌QZQM08在添加所選碳源的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng),但是菌絲產(chǎn)量有明顯的差異,碳源為葡萄糖的培養(yǎng)基中菌絲產(chǎn)量最大,說(shuō)明葡萄糖最適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲生長(zhǎng)。

    表6 碳源類型對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    2.6 不同氮源對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    如表7所示,內(nèi)生真菌QZQM08在添加所選氮源的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng),但是菌絲產(chǎn)量有明顯的差異,氮源為酵母浸粉的培養(yǎng)基中菌絲產(chǎn)量最大,說(shuō)明酵母浸粉最適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲生長(zhǎng)。

    表7 氮源類型對(duì)內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量的影響

    2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃內(nèi)生真菌QZQM08菌絲產(chǎn)量最大,以接種量、pH、碳源和氮源4個(gè)因素中篩選出比較適合內(nèi)生真菌QZQM08菌絲生長(zhǎng)的3個(gè)水平,進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn),見(jiàn)表8。試驗(yàn)得出組合2培養(yǎng)出的菌絲產(chǎn)量最大,得出菌株最佳培養(yǎng)條件:培養(yǎng)基成分碳源為20 g/L葡萄糖、氮源為10 g/L酵母浸粉,接種量為1 mL,pH為6.0。

    表8 正交試驗(yàn)方案及其結(jié)果

    3 結(jié)論

    試驗(yàn)結(jié)果表明,仿生栽培鐵皮石斛內(nèi)生真菌QZQM08在液體馬鈴薯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。菌絲的產(chǎn)量與接種量、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件有關(guān),最佳液體培養(yǎng)基為在馬鈴薯基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母浸粉,接種量為1 mL,pH為6.0,培養(yǎng)溫度為28 ℃。

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