Sartobind Q膜純化乙型腦炎滅活疫苗的研究

李慶岸，于海，楊兵，于宏躍

（遼寧成大生物股份有限公司，遼寧沈陽 110179）

乙型腦炎簡稱乙腦，是由日本腦炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）引起的一種人獸共患的蚊媒傳染病，日本腦炎病毒屬于黃病毒屬，通過蚊蟲叮咬而在豬和人之間傳播。乙腦發(fā)生并流行于東亞、東南亞及其相鄰地區(qū)，主要侵襲對象是兒童，旅行者和海外軍人也存在感染的風(fēng)險(xiǎn)[1]。

乙腦疫苗是將乙腦病毒接種于適合的動(dòng)物細(xì)胞上，經(jīng)繁殖后病毒釋放到培養(yǎng)液中，與此同時(shí)一些殘余的宿主細(xì)胞或其碎片也會進(jìn)入到培養(yǎng)液中，經(jīng)澄清、超濾濃縮、凝膠過濾層析后得到乙腦疫苗原液。由于使用傳代細(xì)胞（如Vero細(xì)胞）作為疫苗生產(chǎn)的培養(yǎng)基質(zhì)，在疫苗中的宿主細(xì)胞DNA殘留具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，一方面是其具有潛在的致癌性；另一方面是其存在感染性病毒基因組的可能性。因此，各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)均對生物制品中的Vero細(xì)胞殘留DNA作出了嚴(yán)格規(guī)定，以確保健康人群接種疫苗的安全性[2-3]，《中華人民共和國藥典》三部（2020版）中對凍干乙型腦炎滅活疫苗（Vero細(xì)胞）中Vero細(xì)胞DNA殘留量的要求為小于100 pg/劑[4]。

Sartobind Q膜可在高流速下用于工藝中的雜質(zhì)去除和產(chǎn)品精純。Sartobind Q的季銨鹽基團(tuán)共價(jià)結(jié)合于纖維素配基上，在高流速的條件下可以高效結(jié)合蛋白。Sartobind Q膜內(nèi)孔徑大于3 μm，因此大分子蛋白、生物分子、病毒等都可以進(jìn)入該多孔結(jié)構(gòu)，從而獲得比傳統(tǒng)膜填料更大的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量。Sartobind Q是對有價(jià)值的蛋白（如病毒蛋白）進(jìn)行流穿模式精細(xì)純化的完美工具，在去除細(xì)胞DNA殘留、細(xì)胞蛋白、內(nèi)毒素期間，膜體積可以保持足夠小。

Sartobind Q膜的優(yōu)勢：（1）獨(dú)特的開放式微孔結(jié)構(gòu)，孔徑大于3 μm，在高流速下仍然能保持高動(dòng)態(tài)載量；（2）以穩(wěn)定化再生纖維素為骨架，凝膠填料柱層析的基團(tuán)都能用共價(jià)方式結(jié)合到交聯(lián)膜骨架上，非特異性吸附低，產(chǎn)品回收率高；（3）簡化工藝步驟，降低工藝時(shí)間，優(yōu)越的可操作性和安全性，即開即用；（4）產(chǎn)品設(shè)備簡單，無須硬件投入和維護(hù)成本，操作簡單，沒有體積巨大的硬件。

本實(shí)驗(yàn)采用Sartobind Q陰離子交換層析法從乙腦病毒滅活液中除去殘留DNA，將分子篩純化得到病毒蛋白溶液進(jìn)一步膜分離，在一定的離子強(qiáng)度和pH下，DNA吸附在膜配基上，而乙腦病毒蛋白在純化過程中與膜上的離子結(jié)合位點(diǎn)被氯離子所取代，直接從膜中流出，進(jìn)一步去除殘留DNA的含量。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞

乙型腦炎毒種由中國藥品生物制品檢定所提供，毒株名稱為“乙腦京衛(wèi)研3株”，代號為“P3”；Vero細(xì)胞采購于美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（ATCC）。

1.2 試劑與儀器

Sartobind Q膜，德國Sartorius Stedim公司；AKTA pure 150層析系統(tǒng)，美國GE Healthcare公司；Vero殘留DNA-154檢測試劑盒，湖州申科生物技術(shù)有限公司；Celligen 7.5 L生物反應(yīng)器，德國Eppendorf公司；微載體，美國GE Healthcare公司；膜（300 kD），美國Millipore公司；β-丙內(nèi)酯，德國Serva公司。

1.3 病毒原液的制備

Vero細(xì)胞接種至7.5 L生物反應(yīng)器內(nèi)，使用微載體Cytodex1大規(guī)模培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)6 d至細(xì)胞長滿后，溫度降低至33 ℃；接種P3株乙腦病毒，按感染復(fù)數(shù)（Multiplicity Of Infection，MOI）=1∶500的比例感染，48 h后開始收獲病毒，直至微載體上細(xì)胞匯合率為10%時(shí)停止收獲。連續(xù)制備10批，批號為S1～S10。

1.4 病毒滅活

將病毒收獲液澄清后，使用300 kD的膜濃縮約20倍，獲得病毒濃縮液；再用2～8 ℃經(jīng)滅菌的注射用水稀釋β-丙內(nèi)酯40～100倍；向病毒濃縮液中加入β-丙內(nèi)酯，使病毒濃縮液與β-丙內(nèi)酯的濃度比為1∶4 000；將混合液置于4 ℃的冰箱中2～8 ℃，攪拌滅活24 h；滅活結(jié)束后，將病毒滅活液放置于37 ℃下水解2 h，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.8，獲得病毒滅活液。

1.5 傳統(tǒng)Sepharose凝膠方法純化疫苗

將乙腦疫苗滅活液經(jīng)過裝載Sepharose 6 FF凝膠的XK50層析柱，柱體積為1 000 mL，紫外280 nm監(jiān)測，流速為6.5～9.8 mL/min，流動(dòng)相為PBS緩沖液，第一個(gè)吸收峰即為乙腦病毒蛋白純化液，產(chǎn)品批號分別為 J1～ J10。

1.6 Sartobind Q方法純化疫苗

初步純化液的制備方法與1.5項(xiàng)下內(nèi)容一致。將收集的初步純化液進(jìn)行Sartobind Q膜穿透模式過濾，具體流程如下：排氣；使用前用1 mol/L的NaOH溶液清洗30 min，溫度20 ℃，清洗體積為10倍Sartobind Q膜床體積（以下簡稱MV）；使用0.4～0.5 mol/L的PBS緩沖溶液平衡，平衡體積為10 MV；將收集的純化液流穿到Sartobind Q膜上，根據(jù)紫外吸收情況，流速10～30 MV/min，進(jìn)行病毒蛋白的收集；樣品全部加載后，使用0.4～0.5 mol/L的PBS緩沖溶液進(jìn)行洗脫，繼續(xù)收集；使用1 mol/L的NaCl溶液，收集洗脫出來的蛋白峰；使用1 mol/L的NaOH溶液，清洗30min[5]。得到的產(chǎn)品批號分別記為j1～j10。

1.7 中間產(chǎn)品成分檢測

1.7.1 乙腦殘留DNA含量檢測

PCR-熒光探針法檢測Vero細(xì)胞宿主DNA。

1.7.2 乙腦滅活液、純化液抗原含量檢測

使用乙型腦炎病毒ELISA實(shí)驗(yàn)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗的純化

2.1.1 Sepharose 6 FF凝膠純化效果

如圖1所示，10批病毒滅活液經(jīng)凝膠Sepharose 6 FF純化后，清晰可見紫外吸收第一峰及第二峰，洗脫體積330 mL和750 mL處分別為目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰，表明該介質(zhì)可有效分離疫苗原液中的雜質(zhì)。

圖1 10批乙腦病毒液的Sepharose凝膠純化圖譜

2.1.2 Sartobind Q膜純化效果

將初步純化液按40倍膜床工作體積加載到Sartobind Q膜中，當(dāng)樣品全部加載后，繼續(xù)用0.4～0.5 mol/L的PBS緩沖液洗滌膜，收集的穿透峰為最終純化液，見圖2。

圖2 10批乙腦病毒液的Sartobind Q膜純化圖譜

2.2 疫苗純化液指標(biāo)檢測

2.2.1 Vero細(xì)胞殘留DNA去除率

如表1所示，經(jīng)過Sartobind Q膜純化后，10批疫苗的細(xì)胞殘留DNA去除率為95.4%～97.8%，平均值為96.7%，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）為2.1%。

表1 Sartobind Q膜對初步純化液中DNA的去除效果

2.2.2 乙腦病毒抗原回收率

純化后10批疫苗純化液的抗原含量的降幅見表2，經(jīng)計(jì)算，Sepharose 6 FF層析純化和Sepharose 6 FF層析+Sartobind Q膜純化方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.069和0.067，兩種方法得到的抗原含量無顯著差異（P=0.67＞0.05），說明在初步純化液的基礎(chǔ)上增加Sartobind Q膜純化不會導(dǎo)致產(chǎn)品有效成分損失。

表2 疫苗純化液的抗原含量變化情況

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將凝膠過濾層析所獲得的病毒蛋白溶液（初步純化液）進(jìn)一步經(jīng)過Sartobind Q 膜過濾，在一定的pH、離子強(qiáng)度下，乙腦病毒蛋白直接穿透，有效去除細(xì)胞殘留DNA的含量。該方法對產(chǎn)品中的抗原含量沒有影響，Sartobind Q膜層析對初步純化液殘留DNA的去除率為95.4%～97.8%，純化效果顯著提升。