遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)不同配比對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

邸學(xué)，王一博，劉雅晴，王海波，王雯睿

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

石菖蒲是常用的醒腦開竅藥，具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智的功效，《本經(jīng)》稱它“開心孔，補(bǔ)五臟，通九竅，明耳目”，《別錄》謂之“聰耳目，益心智”。遠(yuǎn)志亦有安神益智、祛痰開竅的功效，《本經(jīng)》謂其“利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強(qiáng)志倍力”［1］。因遠(yuǎn)志與石菖蒲都具有開竅寧神益智的作用，常配對(duì)應(yīng)用于老年癡呆疾病的治療，并被作為組方用藥的基本結(jié)構(gòu)。

老年癡呆（Alzheimer Disease，AD）在中醫(yī)學(xué)屬于“呆病”“郁證”“文癡”“善忘”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為其病位在腦，與心肝脾肺腎功能失調(diào)關(guān)系密切。臨床多從益智、化痰、祛瘀、調(diào)心、補(bǔ)腎以及開竅等多角度治療，尤其安神益智、化痰開竅法歷來頗受重視，而“遠(yuǎn)志-石菖蒲”就是體現(xiàn)這一治法的經(jīng)典藥對(duì)，在開心散、定志丸、定志小丸、遠(yuǎn)志散等治療“好忘”的經(jīng)典方劑中廣泛使用[2-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用遠(yuǎn)志-石菖蒲配伍的用量有10.0∶3.0、8.0∶3.0、7.0∶3.0、2.0∶1.0、7.0∶5.0、4.0∶3.0、1.0∶1.0、1.0∶2.5和1.0∶4.0等不同比例[5-6]。國家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》收錄《備急千金要方》之開心散，組成根據(jù)宋校本所載處方確定，但與《新雕孫真人千金方》中所記載的劑量差異較大[7]。張林等[8]通過兩個(gè)版本及相關(guān)醫(yī)籍的文獻(xiàn)研究，對(duì)該方的劑量進(jìn)行了分析考證，認(rèn)為開心散方劑中遠(yuǎn)志-石菖蒲藥量比例應(yīng)為1∶1。

文獻(xiàn)對(duì)遠(yuǎn)志、石菖蒲藥對(duì)或單味藥及其有效成分的藥理作用研究較多，但有關(guān)此藥對(duì)間最佳配伍比例及其活性物質(zhì)作用于AD細(xì)胞模型的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)通過遠(yuǎn)志-石菖蒲合用對(duì)谷氨酸致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)或營養(yǎng)功能研究，從細(xì)胞水平探討遠(yuǎn)志-石菖蒲配伍比例和藥效作用，為遠(yuǎn)志和石菖蒲藥對(duì)的開發(fā)利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠(yuǎn)志、石菖蒲藥材（批號(hào)C161170、C150785），大連權(quán)健醫(yī)藥公司；PC12細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8121277），Gibco公司；L-谷氨酸、Heochst 33342（批號(hào)20180519、20210408），Solarbio公司；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（批號(hào)C0222、C0207），Beyotime公司；胎牛血清（批號(hào)20110703），浙江天杭生物科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT）、氧化丙啶（PI）（批號(hào)L1905092、A1720090、H1902001），阿拉丁公司；無水乙醇，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP-40 CO2培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SJIA-5FE冷凍干燥機(jī)，寧波市雙嘉儀器有限公司；ST-360酶標(biāo)儀，KHB科華生物；80-2離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)公司；Mini Shaker搖床，Kylin-Bell Lab Instruments；Ti-S倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；A60倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液制備

（1）遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)不同配比樣品液（見表1）。分別取遠(yuǎn)志、石菖蒲藥材粉碎，過2號(hào)篩。遠(yuǎn)志、石菖蒲、遠(yuǎn)志-石菖蒲不同配比（1∶1、1∶4）按料液比1∶10（g∶mL）分別加入60%乙醇或蒸餾水，浸泡后加熱回流提取2 h，過濾，得到遠(yuǎn)志水提液與醇提液、石菖蒲水提液與醇提液、遠(yuǎn)志水提液-石菖蒲醇提液（1∶1）、遠(yuǎn)志-石菖蒲（1∶1）醇提液和遠(yuǎn)志-石菖蒲（1∶4）醇提液，分別濃縮至約5 g/mL，水提液、醇提液先后置于-20 ℃、-80 ℃冷凍4 h，制成凍干粉備用。

表1 溶液制備方法

取各組凍干樣品，分別加入PBS緩沖液溶解，配制成1.0 mg/mL、3.0 mg/mL、5.0 mg/mL和7.5 mg/mL的遠(yuǎn)志水提（醇提）干粉溶液和石菖蒲水提（醇提）干 粉 溶 液，3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL和10.0 mg/mL的遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇（1∶1）干粉溶液，5.0 mg/mL的遠(yuǎn)志-石菖蒲（1∶1）醇提干粉溶液，3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL和 10.0 mg/mL的遠(yuǎn)志-石菖蒲（1∶4）醇提干粉溶液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

（2）含谷氨酸培養(yǎng)液配制：取谷氨酸適量，加PBS緩沖液溶解，配制成100 mmol/L的溶液，再加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至10 mmol/L，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、95%空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中，在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，加入0.25%胰酶液消化，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)入離心管中，3 000 r/min離心2 min。棄去上清液，加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打后，將細(xì)胞均勻接種于96孔板（2×104cell/孔），繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 分組給藥

細(xì)胞培養(yǎng)12 h后棄去原培養(yǎng)液，分別加入90 μL正常培養(yǎng)液或含谷氨酸培養(yǎng)液，再分別加入10 μL PBS緩沖液或不同配比樣品液，每組設(shè)3或6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4 細(xì)胞活性檢測

取培養(yǎng)的細(xì)胞板，避光加入MTT溶液（5 μg/mL）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液。每孔加入DMSO 100μL，振搖3 min，酶標(biāo)儀測定492 nm處吸光度值（A）。

細(xì)胞活力比=(A給藥組-A模型空白組)/(A正常對(duì)照組-A模型空白組)×100%

1.3.5 Hoechst 33342/PI染色

分組給藥后的各組細(xì)胞分別加入10μL含500 μg/mL PI的PBS溶液，使其終濃度為50 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，棄去上清液。PBS溶液沖洗兩次，再加入30 μL Hoechst 33342染色液覆蓋住細(xì)胞，室溫避光放置5 min后輕緩吸除染色液，PBS溶液沖洗兩次。熒光顯微鏡下觀察分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)志-石菖蒲不同配比樣品保護(hù)作用研究

取遠(yuǎn)志-石菖蒲不同配比樣品組及不同濃度組進(jìn)行細(xì)胞活性檢測，以正常細(xì)胞組（細(xì)胞活力值100%）和谷氨酸損傷模型組（細(xì)胞活力值0%）為參照，根據(jù)各組吸光度值（n=6）計(jì)算細(xì)胞活力比，結(jié)果見圖1。

圖1 各組樣品溶液保護(hù)作用結(jié)果圖

結(jié)果表明，石菖蒲水提干粉（AW-7.5）在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)無抗谷氨酸致細(xì)胞損傷作用，石菖蒲醇提取物在濃度7.5 mg/mL（AE-7.5）時(shí)抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果最好；遠(yuǎn)志水提取物濃度和醇提取物在濃度5 mg/mL（PW-5.0和PE-5.0）時(shí)，抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果最好；遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇（1∶1）提取濃度5 mg/mL（PWAE1∶1-5.0）和遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取物濃度7.5 mg/mL（PEAE1∶4-7.5）時(shí)，抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果最好。

對(duì)比分析5 mg/mL濃度的不同組別樣品抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志醇提取物（PE-5.0）、水提取物（PW-5.0）的作用效果略強(qiáng)于石菖蒲的醇提取物（AE-5.0），遠(yuǎn)強(qiáng)于石菖蒲的水提取物（AW）；遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇提取物的作用效果（PWAE1∶1-5.0）略強(qiáng)于遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取物（PEAE1∶1-5.0）；遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取物（PEAE1∶4-5.0）抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用最強(qiáng)。

遠(yuǎn)志醇提取物7.5 mg/mL給藥組（PE-7.5）細(xì)胞活力值遠(yuǎn)小于遠(yuǎn)志醇提取物5 mg/mL（PE-5.0）和遠(yuǎn)志水提取物7.5 mg/mL給藥組（PW-7.5）的細(xì)胞活力值，其原因可能是醇溶液中遠(yuǎn)志皂苷類成分提取率高、成分含量高，在超過一定濃度后該類成分的細(xì)胞毒性導(dǎo)致PC-12細(xì)胞損傷、活力下降甚至凋亡。石菖蒲的醇提取給藥組細(xì)胞活力遠(yuǎn)強(qiáng)于石菖蒲的水提取物組，提示醇提取方式可能更適合石菖蒲中相關(guān)的藥效活性成分的提取富集。

細(xì)胞外谷氨酸濃度增加可激活谷氨酸受體，造成神經(jīng)元持續(xù)興奮，介導(dǎo)細(xì)胞Ca2+內(nèi)流超載，產(chǎn)生大量自由基，形成氧化應(yīng)激，產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性損傷神經(jīng)細(xì)胞。資料表明，遠(yuǎn)志水提物可提高機(jī)體內(nèi)抗氧化能力，清除過多的自由基，抑制或減輕細(xì)胞過氧化損傷；石菖蒲也具有抗缺氧、清除自由基的作用[3]。遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)能顯著提高AD模型大鼠腦組織中SOD活力，降低MDA和NO含量，減少氧自由基的產(chǎn)生，加速清除過氧化脂質(zhì)，減輕氧自由基對(duì)腦組織的損傷[9]。結(jié)合本研究結(jié)果，遠(yuǎn)志、石菖蒲抗谷氨酸致細(xì)胞損傷作用可能與其所含成分的抗氧化作用有關(guān)。遠(yuǎn)志皂苷、糖脂等成分（水溶性較強(qiáng)），石菖蒲中細(xì)辛醚、丁香酚等活性成分（醇溶性較強(qiáng)）可能通過清除過量自由基、減輕谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性損傷作用維持細(xì)胞活力。

2.2 遠(yuǎn)志-石菖蒲抑制細(xì)胞凋亡作用研究

不同樣品組細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33342染色液/PI雙染后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，不同提取方法樣品典型結(jié)果如表2所示。

表2 各組細(xì)胞凋亡、壞死染色分析結(jié)果

結(jié)果表明，遠(yuǎn)志-石菖蒲合用抑制細(xì)胞凋亡作用效果優(yōu)于遠(yuǎn)志、石菖蒲單獨(dú)使用；遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇提取物5 mg/mL（PWAE1∶1-5.0）和遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取7.5 mg/mL（PEAE1∶4-7.5）抑制細(xì)胞凋亡的效果較好。

遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇（PWAE1∶1）與遠(yuǎn)志-石菖蒲醇（PEAE1∶1）提取物組均能夠明顯抑制細(xì)胞凋亡，但遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取物5 mg/mL濃度組（PEAE1∶1-5.0）早期凋亡細(xì)胞數(shù)多于同濃度的遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇實(shí)驗(yàn)組（PWAE1∶1-5.0），可能是因?yàn)榇既芤褐羞h(yuǎn)志皂苷類成分細(xì)胞毒性作用因含量增高而增強(qiáng)所致。這也提示在進(jìn)行開心散、定志丸等含遠(yuǎn)志藥材的經(jīng)典名方劑開發(fā)應(yīng)用時(shí)，需注意方劑的加工生產(chǎn)工藝參數(shù)優(yōu)化，既要保證其藥效作用，又要避免其副作用[10-12]。

3 結(jié)論

遠(yuǎn)志-石菖蒲合用抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果優(yōu)于遠(yuǎn)志或石菖蒲單獨(dú)使用，說明遠(yuǎn)志與石菖蒲配對(duì)應(yīng)用于老年癡呆疾病的治療、作為組方常用對(duì)藥是具有科學(xué)內(nèi)涵和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的。遠(yuǎn)志-石菖蒲配伍中石菖蒲所占比例高的實(shí)驗(yàn)組能明顯抑制細(xì)胞凋亡，提示遠(yuǎn)志與石菖蒲用藥比例應(yīng)在開心散方劑1∶1比例基礎(chǔ)上，根據(jù)藥物活性成分的提取效率、血藥濃度和組織分布情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以達(dá)到減低遠(yuǎn)志細(xì)胞毒副作用、增強(qiáng)藥物合用整體作用效果的目的。