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    遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)不同配比對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

    2022-09-20 09:18:00邸學(xué)王一博劉雅晴王海波王雯睿
    生物化工 2022年4期
    關(guān)鍵詞:遠(yuǎn)志石菖蒲谷氨酸

    邸學(xué),王一博,劉雅晴,王海波,王雯睿

    (遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧大連 116600)

    石菖蒲是常用的醒腦開竅藥,具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智的功效,《本經(jīng)》稱它“開心孔,補(bǔ)五臟,通九竅,明耳目”,《別錄》謂之“聰耳目,益心智”。遠(yuǎn)志亦有安神益智、祛痰開竅的功效,《本經(jīng)》謂其“利九竅,益智慧,耳目聰明,不忘,強(qiáng)志倍力”[1]。因遠(yuǎn)志與石菖蒲都具有開竅寧神益智的作用,常配對(duì)應(yīng)用于老年癡呆疾病的治療,并被作為組方用藥的基本結(jié)構(gòu)。

    老年癡呆(Alzheimer Disease,AD)在中醫(yī)學(xué)屬于“呆病”“郁證”“文癡”“善忘”等范疇,中醫(yī)認(rèn)為其病位在腦,與心肝脾肺腎功能失調(diào)關(guān)系密切。臨床多從益智、化痰、祛瘀、調(diào)心、補(bǔ)腎以及開竅等多角度治療,尤其安神益智、化痰開竅法歷來頗受重視,而“遠(yuǎn)志-石菖蒲”就是體現(xiàn)這一治法的經(jīng)典藥對(duì),在開心散、定志丸、定志小丸、遠(yuǎn)志散等治療“好忘”的經(jīng)典方劑中廣泛使用[2-4]。

    研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用遠(yuǎn)志-石菖蒲配伍的用量有10.0∶3.0、8.0∶3.0、7.0∶3.0、2.0∶1.0、7.0∶5.0、4.0∶3.0、1.0∶1.0、1.0∶2.5和1.0∶4.0等不同比例[5-6]。國家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》收錄《備急千金要方》之開心散,組成根據(jù)宋校本所載處方確定,但與《新雕孫真人千金方》中所記載的劑量差異較大[7]。張林等[8]通過兩個(gè)版本及相關(guān)醫(yī)籍的文獻(xiàn)研究,對(duì)該方的劑量進(jìn)行了分析考證,認(rèn)為開心散方劑中遠(yuǎn)志-石菖蒲藥量比例應(yīng)為1∶1。

    文獻(xiàn)對(duì)遠(yuǎn)志、石菖蒲藥對(duì)或單味藥及其有效成分的藥理作用研究較多,但有關(guān)此藥對(duì)間最佳配伍比例及其活性物質(zhì)作用于AD細(xì)胞模型的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)通過遠(yuǎn)志-石菖蒲合用對(duì)谷氨酸致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)或營養(yǎng)功能研究,從細(xì)胞水平探討遠(yuǎn)志-石菖蒲配伍比例和藥效作用,為遠(yuǎn)志和石菖蒲藥對(duì)的開發(fā)利用提供支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    遠(yuǎn)志、石菖蒲藥材(批號(hào)C161170、C150785),大連權(quán)健醫(yī)藥公司;PC12細(xì)胞,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)8121277),Gibco公司;L-谷氨酸、Heochst 33342(批號(hào)20180519、20210408),Solarbio公司;青鏈霉素、胰蛋白酶消化液(批號(hào)C0222、C0207),Beyotime公司;胎牛血清(批號(hào)20110703),浙江天杭生物科技股份有限公司;二甲基亞砜(DMSO)、溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)、氧化丙啶(PI)(批號(hào)L1905092、A1720090、H1902001),阿拉丁公司;無水乙醇,分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;純凈水,杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HP-40 CO2培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2FD超凈臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SJIA-5FE冷凍干燥機(jī),寧波市雙嘉儀器有限公司;ST-360酶標(biāo)儀,KHB科華生物;80-2離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)公司;Mini Shaker搖床,Kylin-Bell Lab Instruments;Ti-S倒置熒光顯微鏡,日本尼康公司;A60倒置熒光顯微鏡,德國Leica公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 溶液制備

    (1)遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)不同配比樣品液(見表1)。分別取遠(yuǎn)志、石菖蒲藥材粉碎,過2號(hào)篩。遠(yuǎn)志、石菖蒲、遠(yuǎn)志-石菖蒲不同配比(1∶1、1∶4)按料液比1∶10(g∶mL)分別加入60%乙醇或蒸餾水,浸泡后加熱回流提取2 h,過濾,得到遠(yuǎn)志水提液與醇提液、石菖蒲水提液與醇提液、遠(yuǎn)志水提液-石菖蒲醇提液(1∶1)、遠(yuǎn)志-石菖蒲(1∶1)醇提液和遠(yuǎn)志-石菖蒲(1∶4)醇提液,分別濃縮至約5 g/mL,水提液、醇提液先后置于-20 ℃、-80 ℃冷凍4 h,制成凍干粉備用。

    表1 溶液制備方法

    取各組凍干樣品,分別加入PBS緩沖液溶解,配制成1.0 mg/mL、3.0 mg/mL、5.0 mg/mL和7.5 mg/mL的遠(yuǎn)志水提(醇提)干粉溶液和石菖蒲水提(醇提)干 粉 溶 液,3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL和10.0 mg/mL的遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇(1∶1)干粉溶液,5.0 mg/mL的遠(yuǎn)志-石菖蒲(1∶1)醇提干粉溶液,3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL和 10.0 mg/mL的遠(yuǎn)志-石菖蒲(1∶4)醇提干粉溶液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,備用。

    (2)含谷氨酸培養(yǎng)液配制:取谷氨酸適量,加PBS緩沖液溶解,配制成100 mmol/L的溶液,再加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至10 mmol/L,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,備用。

    1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    PC12細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、95%空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中,在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞,加入0.25%胰酶液消化,加入DMEM培養(yǎng)液終止消化,轉(zhuǎn)入離心管中,3 000 r/min離心2 min。棄去上清液,加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打后,將細(xì)胞均勻接種于96孔板(2×104cell/孔),繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.3.3 分組給藥

    細(xì)胞培養(yǎng)12 h后棄去原培養(yǎng)液,分別加入90 μL正常培養(yǎng)液或含谷氨酸培養(yǎng)液,再分別加入10 μL PBS緩沖液或不同配比樣品液,每組設(shè)3或6個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    1.3.4 細(xì)胞活性檢測

    取培養(yǎng)的細(xì)胞板,避光加入MTT溶液(5 μg/mL)10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清液。每孔加入DMSO 100μL,振搖3 min,酶標(biāo)儀測定492 nm處吸光度值(A)。

    細(xì)胞活力比=(A給藥組-A模型空白組)/(A正常對(duì)照組-A模型空白組)×100%

    1.3.5 Hoechst 33342/PI染色

    分組給藥后的各組細(xì)胞分別加入10μL含500 μg/mL PI的PBS溶液,使其終濃度為50 μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)20 min,棄去上清液。PBS溶液沖洗兩次,再加入30 μL Hoechst 33342染色液覆蓋住細(xì)胞,室溫避光放置5 min后輕緩吸除染色液,PBS溶液沖洗兩次。熒光顯微鏡下觀察分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 遠(yuǎn)志-石菖蒲不同配比樣品保護(hù)作用研究

    取遠(yuǎn)志-石菖蒲不同配比樣品組及不同濃度組進(jìn)行細(xì)胞活性檢測,以正常細(xì)胞組(細(xì)胞活力值100%)和谷氨酸損傷模型組(細(xì)胞活力值0%)為參照,根據(jù)各組吸光度值(n=6)計(jì)算細(xì)胞活力比,結(jié)果見圖1。

    圖1 各組樣品溶液保護(hù)作用結(jié)果圖

    結(jié)果表明,石菖蒲水提干粉(AW-7.5)在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)無抗谷氨酸致細(xì)胞損傷作用,石菖蒲醇提取物在濃度7.5 mg/mL(AE-7.5)時(shí)抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果最好;遠(yuǎn)志水提取物濃度和醇提取物在濃度5 mg/mL(PW-5.0和PE-5.0)時(shí),抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果最好;遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇(1∶1)提取濃度5 mg/mL(PWAE1∶1-5.0)和遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取物濃度7.5 mg/mL(PEAE1∶4-7.5)時(shí),抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果最好。

    對(duì)比分析5 mg/mL濃度的不同組別樣品抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果,發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志醇提取物(PE-5.0)、水提取物(PW-5.0)的作用效果略強(qiáng)于石菖蒲的醇提取物(AE-5.0),遠(yuǎn)強(qiáng)于石菖蒲的水提取物(AW);遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇提取物的作用效果(PWAE1∶1-5.0)略強(qiáng)于遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取物(PEAE1∶1-5.0);遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取物(PEAE1∶4-5.0)抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用最強(qiáng)。

    遠(yuǎn)志醇提取物7.5 mg/mL給藥組(PE-7.5)細(xì)胞活力值遠(yuǎn)小于遠(yuǎn)志醇提取物5 mg/mL(PE-5.0)和遠(yuǎn)志水提取物7.5 mg/mL給藥組(PW-7.5)的細(xì)胞活力值,其原因可能是醇溶液中遠(yuǎn)志皂苷類成分提取率高、成分含量高,在超過一定濃度后該類成分的細(xì)胞毒性導(dǎo)致PC-12細(xì)胞損傷、活力下降甚至凋亡。石菖蒲的醇提取給藥組細(xì)胞活力遠(yuǎn)強(qiáng)于石菖蒲的水提取物組,提示醇提取方式可能更適合石菖蒲中相關(guān)的藥效活性成分的提取富集。

    細(xì)胞外谷氨酸濃度增加可激活谷氨酸受體,造成神經(jīng)元持續(xù)興奮,介導(dǎo)細(xì)胞Ca2+內(nèi)流超載,產(chǎn)生大量自由基,形成氧化應(yīng)激,產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性損傷神經(jīng)細(xì)胞。資料表明,遠(yuǎn)志水提物可提高機(jī)體內(nèi)抗氧化能力,清除過多的自由基,抑制或減輕細(xì)胞過氧化損傷;石菖蒲也具有抗缺氧、清除自由基的作用[3]。遠(yuǎn)志-石菖蒲藥對(duì)能顯著提高AD模型大鼠腦組織中SOD活力,降低MDA和NO含量,減少氧自由基的產(chǎn)生,加速清除過氧化脂質(zhì),減輕氧自由基對(duì)腦組織的損傷[9]。結(jié)合本研究結(jié)果,遠(yuǎn)志、石菖蒲抗谷氨酸致細(xì)胞損傷作用可能與其所含成分的抗氧化作用有關(guān)。遠(yuǎn)志皂苷、糖脂等成分(水溶性較強(qiáng)),石菖蒲中細(xì)辛醚、丁香酚等活性成分(醇溶性較強(qiáng))可能通過清除過量自由基、減輕谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性損傷作用維持細(xì)胞活力。

    2.2 遠(yuǎn)志-石菖蒲抑制細(xì)胞凋亡作用研究

    不同樣品組細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33342染色液/PI雙染后,在倒置熒光顯微鏡下觀察,不同提取方法樣品典型結(jié)果如表2所示。

    表2 各組細(xì)胞凋亡、壞死染色分析結(jié)果

    結(jié)果表明,遠(yuǎn)志-石菖蒲合用抑制細(xì)胞凋亡作用效果優(yōu)于遠(yuǎn)志、石菖蒲單獨(dú)使用;遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇提取物5 mg/mL(PWAE1∶1-5.0)和遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取7.5 mg/mL(PEAE1∶4-7.5)抑制細(xì)胞凋亡的效果較好。

    遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇(PWAE1∶1)與遠(yuǎn)志-石菖蒲醇(PEAE1∶1)提取物組均能夠明顯抑制細(xì)胞凋亡,但遠(yuǎn)志-石菖蒲醇提取物5 mg/mL濃度組(PEAE1∶1-5.0)早期凋亡細(xì)胞數(shù)多于同濃度的遠(yuǎn)志水-石菖蒲醇實(shí)驗(yàn)組(PWAE1∶1-5.0),可能是因?yàn)榇既芤褐羞h(yuǎn)志皂苷類成分細(xì)胞毒性作用因含量增高而增強(qiáng)所致。這也提示在進(jìn)行開心散、定志丸等含遠(yuǎn)志藥材的經(jīng)典名方劑開發(fā)應(yīng)用時(shí),需注意方劑的加工生產(chǎn)工藝參數(shù)優(yōu)化,既要保證其藥效作用,又要避免其副作用[10-12]。

    3 結(jié)論

    遠(yuǎn)志-石菖蒲合用抗谷氨酸致細(xì)胞損傷的作用效果優(yōu)于遠(yuǎn)志或石菖蒲單獨(dú)使用,說明遠(yuǎn)志與石菖蒲配對(duì)應(yīng)用于老年癡呆疾病的治療、作為組方常用對(duì)藥是具有科學(xué)內(nèi)涵和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的。遠(yuǎn)志-石菖蒲配伍中石菖蒲所占比例高的實(shí)驗(yàn)組能明顯抑制細(xì)胞凋亡,提示遠(yuǎn)志與石菖蒲用藥比例應(yīng)在開心散方劑1∶1比例基礎(chǔ)上,根據(jù)藥物活性成分的提取效率、血藥濃度和組織分布情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,以達(dá)到減低遠(yuǎn)志細(xì)胞毒副作用、增強(qiáng)藥物合用整體作用效果的目的。

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