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    環(huán)巴胺對四氯化碳所致肝損傷小鼠模型的作用

    2022-09-20 09:17:58丁海虎李澳峰徐銀花
    生物化工 2022年4期
    關(guān)鍵詞:肝臟誘導(dǎo)小鼠

    丁海虎,李澳峰,徐銀花

    (1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗中心,安徽 蚌埠 233030;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院,安徽 蚌埠 233000)

    肝損傷是機體肝臟受各類復(fù)雜致病因素影響而誘發(fā)肝臟發(fā)生病變的過程。有研究表明,藥品和生物制品對肝損傷進程具有顯著干預(yù)作用,能夠有效保護肝功能[1]。環(huán)巴胺(Cyclopamine),又名環(huán)靶明,是一種從植物中提取分離而得到的生物堿,是Hedgehog(Hh)信號通路的特異性抑制劑,肝損傷后該信號通路可被激活,并參與包括促進肝臟祖細胞的增殖等過程[2-3];此外,環(huán)巴胺可通過抑制該信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達從而影響肝再生[4]。本實驗旨在通過研究環(huán)巴胺預(yù)防性給藥對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型的干預(yù)作用及其可能的治療機制,為環(huán)巴胺臨床治療肝損傷提供理論基礎(chǔ)[5]。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑

    環(huán)巴胺凍干粉(批號:DST190314-087),HPLC≥98%,成都德思特生物技術(shù)有限公司;四氯化碳溶液(CCl4)(批號:C805332),HPLC≥98%,上海麥克林生化科技有限公司;橄欖油(批號:C10438063),分析純,上海麥克林生化科技有限公司;總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、總膽紅素(TBil)以及谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(批號依次為:20200328、20200417、20200508、20200513),南京建成生物工程研究所有限公司。

    1.2 試驗動物

    清潔級ICR小鼠40只,周齡7~8周,雌雄不限,體重(25±5)g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。生產(chǎn)許可證號:SCXK(皖)2017-001號。飼養(yǎng)環(huán)境及方式:分籠飼養(yǎng),動物自由進食任意飲水,12 h交替光照,恒溫22 ℃,相對濕度為50%~75%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7日后進行實驗。

    1.3 儀器與設(shè)備

    EPOCH型酶標分析儀,美國伯騰儀器有限公司;Velocity 18R pro臺式高速冷凍離心機,英國Dynamica;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州金壇良友儀器有限公司;FA2004B型電子天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司;BX53(LED)半電動熒光型顯微鏡,日本奧林巴斯(北京)公司。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 試驗設(shè)計

    采用隨機數(shù)表法將適應(yīng)飼養(yǎng)后的動物隨機均分為4組,分別為正常對照組(n=10),模型組(n=10),環(huán)巴胺預(yù)防1、2組(每組n=10)。正常對照組給予腹腔注射等體積生理鹽水,其余3組通過腹腔注射2 mL/kg的40%CCl4-橄欖油混懸液(即CCl4濃度為0.8 mL/kg),每周2次,以建立肝損傷化小鼠模型。環(huán)巴胺預(yù)防1、2組在建模同時,分別給予濃度為1 mg/mL 的環(huán)巴胺 5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)腹腔注射。3周后最后一次給藥后禁食禁水12 h,按體重采用20%氨基甲酸乙酯溶液0.067 5 mL/10 g腹腔注射麻醉,眼球摘除法采集血樣。

    1.4.2 肝指數(shù)測量

    麻醉前稱重并記錄,待取血后,剖開腹部取出肝組織,置于盛有提前預(yù)冷4 ℃生理鹽水培養(yǎng)皿中清洗肝臟數(shù)次至血液澄清,定性濾紙吸去水分后稱重計算肝指數(shù)。計算肝指數(shù)方法為:肝指數(shù)=[肝臟濕重(g)/小鼠體重(g)]×100%[6]。

    1.4.3 生化指標檢測肝功能

    取血后靜置2 h,保持溫度為4 ℃,在臺式高速冷凍離心機中以3 500 r/min離心10 min,取上層血清,采用酶標分析儀檢測TBil含量和T-SOD活性。在冰盒上切取0.3 g肝組織,加入3 mL預(yù)冷生理鹽水后剪成細塊,移入組織勻漿器中研磨,制備得10%肝勻漿以檢測MDA含量與GSH活性,方法參照說明書操作。

    1.4.4 肝臟病理學(xué)檢查

    稱取肝濕重后均切取左外側(cè)葉置于4%的多聚甲醛中固定,再用刀片修整并取相同部位,按照程序進行組織石蠟包埋、切片及HE染色,在顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)并攝片保存分析。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 27.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析,計量資料數(shù)據(jù)結(jié)果以(±s)表示,各組間差異比較采用單因素方差分析,方差齊時組間事后多重檢驗采用LSD法,方差不齊則事后多重檢驗采用Tamhane’s T2法,P<0.05表示組間差異具有顯著性[6]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 環(huán)巴胺對小鼠體重、肝指數(shù)的影響

    由表1可知,實驗前小鼠體重組間均衡無差異;通過3周造模、給藥處理后,動物體重及肝指數(shù)結(jié)果均顯示:模型組較正常對照組顯著降低(分別為P<0.05、P<0.01);環(huán)巴胺預(yù)防1、2組較正常對照組均略有降低,較模型組有所改善(P<0.01),提示環(huán)巴胺對動物體重和肝指數(shù)有一定干預(yù)作用,且兩者均與劑量成正相關(guān)性。

    表1 環(huán)巴胺對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷化模型小鼠體重、肝指數(shù)的影響(±s)

    表1 環(huán)巴胺對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷化模型小鼠體重、肝指數(shù)的影響(±s)

    注:與正常對照組相比,Δ表示P<0.05,ΔΔ表示P<0.01;與模型組相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01。下同。

    組別 劑量/[mg/(kg·d)]體重/g 肝指數(shù)/%實驗前 實驗后正常對照組 — 28.12±0.57 36.22±3.11 6.40±0.27模型組 — 27.77±1.05 29.53±1.18△ 5.12±0.45△△環(huán)巴胺預(yù)防組1 5 27.89±1.24 33.87±1.42## 6.26±0.18##環(huán)巴胺預(yù)防組2 10 27.65±1.39 34.23±1.44## 6.34±0.17##

    2.2 環(huán)巴胺對小鼠血清T-SOD活性和TBil含量的影響

    檢測血清T-SOD的活性,可在一定程度上反映內(nèi)源性氧自由基清除的能力[7]。由表2可知,模型組血清T-SOD活性較正常對照組顯著下降(P<0.05),提示CCl4誘導(dǎo)3周可使小鼠機體清除超氧自由基的能力減弱;環(huán)巴胺預(yù)防1、2組血清T-SOD活性較模型組顯著升高(分別為P<0.05、P<0.01),且與劑量呈正相關(guān)性,較正常對照組無顯著差異,表明其可通過提高小鼠機體清除自由基的能力來保護肝組織。

    人體內(nèi)絕大部分TBil來源于被破壞的衰老紅細胞,當肝臟或膽道出現(xiàn)疾病時均可出現(xiàn)TBil的升高[8]。本實驗結(jié)果顯示(見表2),與正常對照組相比,模型組血清TBil含量顯著升高(P<0.01);環(huán)巴胺預(yù)防1、2組均能顯著下調(diào)TBil水平(P<0.01),表明CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟處理的能力下降,而環(huán)巴胺可通過干預(yù)該過程而提高機體肝臟處理TBil能力。

    表2 環(huán)巴胺對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠血清T-SOD、TBil的影響(±s)

    表2 環(huán)巴胺對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠血清T-SOD、TBil的影響(±s)

    組別 劑量/[mg/(kg·d)]T-SOD/(U/mL)TBil/(μmol/L)正常對照組 — 83.79±7.92 4.69±1.40模型組 — 76.82±4.02△ 9.83±1.35△△環(huán)巴胺預(yù)防組1 5 81.26±3.63# 5.98±2.53##環(huán)巴胺預(yù)防組2 10 82.72±2.84## 6.43±1.35##

    2.3 環(huán)巴胺對小鼠肝組織MDA、GSH的影響

    機體內(nèi)MDA水平在肝損傷模型中用于評價脂質(zhì)過氧化情況[7]。由表3可知,模型組肝組織MDA含量較正常對照組顯著升高(P<0.01);與模型組相比,環(huán)巴胺預(yù)防1、2組血清MDA含量均顯著下降(P<0.05),提示CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的機制可能是脂質(zhì)過氧化損傷,環(huán)巴胺可能通過干預(yù)氧化酶活性來發(fā)揮保護作用。

    GSH是肝細胞內(nèi)最重要的抗氧化物,對肝損傷有保護和修復(fù)作用[7]。本實驗結(jié)果顯示(見表3),模型組肝組織的GSH活性較正常對照組顯著下降(P<0.01),可能是因為CCl4誘導(dǎo)使動物機體氧化程度增強,自由基產(chǎn)生增多造成了明顯的氧化損傷;環(huán)巴胺預(yù)防1、2組較模型組雖有一定升高,且與劑量呈正比關(guān)系,但差異不顯著。

    表3 環(huán)巴胺對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠肝勻漿MDA、GSH的影響(±s)

    表3 環(huán)巴胺對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠肝勻漿MDA、GSH的影響(±s)

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    2.4 小鼠肝組織病理學(xué)檢查

    小鼠肝組織切片病理學(xué)結(jié)果如圖1所示。正常對照組肝組織各視野范圍內(nèi)未見明顯病理學(xué)改變;模型組肝組織鏡下形態(tài)呈現(xiàn)肝細胞彌漫分布的點狀壞死,炎性細胞浸潤,結(jié)構(gòu)上肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、細胞索排列紊亂;環(huán)巴胺預(yù)防1、2組肝內(nèi)條索分割明顯,水腫現(xiàn)象明顯減少,有少量炎性細胞浸潤但不典型,表明環(huán)巴胺可減輕肝細胞的損傷。

    圖1 小鼠肝組織病理學(xué)光鏡圖(HE染色,×100)

    3 討論與結(jié)論

    3.1 討論

    延緩肝損傷進程或消除長期存在的肝損傷因素,避免肝組織由纖維化發(fā)展為肝硬化乃至肝癌的發(fā)病機制和藥物治療研究,一直是關(guān)系人類肝臟健康的熱點[7]?;瘜W(xué)性肝損傷是研究肝損傷常采用的動物模型之一,采用腹腔注射CCl4造模方法簡便,可準確反映肝損傷后的功能、形態(tài)和代謝的變化,且在可控劑量內(nèi)動物生存率較高[9-10]。本實驗采用2 mL/kg的40%CCl4-橄欖油混懸液,即CCl4終濃度0.8 mL/kg,經(jīng)腹腔注射吸收進入小鼠機體內(nèi)15 min左右即可引起肝細胞損傷,2 d抵達峰點后進入修復(fù)階段[4,11]。故本實驗在建立肝損傷模型的時間上采用間隔3~4 d(即固定在每周周一與周四),以保障動物的生存率,結(jié)果表明該模型建立方法符合實驗設(shè)計。有研究表明,急性肝損傷可表現(xiàn)為肝組織大量壞死,慢性肝損傷的發(fā)病機制復(fù)雜,主要表現(xiàn)出細胞外基質(zhì)大量過度沉積,肝損傷中氧自由基消除失衡,過度滯留肝內(nèi)而啟動炎性反應(yīng),導(dǎo)致細胞膜通透性改變而釋放大量酶終致失活,引發(fā)肝損傷[12]。本實驗也觀察到CCl4誘導(dǎo)的小鼠機體內(nèi)與清除自由基相關(guān)T-SOD、GSH酶活性發(fā)生了改變,過氧化物產(chǎn)物MDA、肝損傷產(chǎn)物TBil顯著升高,提示環(huán)巴胺的干預(yù)機制可能是通過調(diào)節(jié)肝臟組織中氧自由基的產(chǎn)生與消除平衡從而起到肝保護的作用。

    Hh是一種形態(tài)發(fā)生信號通路,在胚胎發(fā)生過程中控制祖細胞的途徑和組織構(gòu)建,發(fā)生在成人許多類型的肝損傷中[13]。肝疾病相關(guān)研究表明,該信號通路在肝損傷后可被激活,并參與如促肝祖細胞增殖、炎性細胞聚集等過程,這些進程都參與了后期肝硬化的發(fā)病機制[2,13]。預(yù)防性腹腔注射給予1 mg/mL濃度的環(huán)巴胺 5 mg/(kg·d)和 10 mg/(kg·d),在 3 周內(nèi)能對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷有干預(yù)作用,且毒副作用小[4]。本研究采用CCl4誘導(dǎo)肝損傷化的方法以研究肝損傷化發(fā)生機制,并對環(huán)巴胺進行抗肝損傷化療效的評價,初步探究環(huán)巴胺基于氧化應(yīng)激可能的肝保護機制,其對Hh信號通路的分子調(diào)控是本實驗尚需進一步驗證和研究的方向。已有研究顯示環(huán)巴胺在抗腫瘤等方面有良好的前景,但在致畸作用和對其他組織器官毒副作用方面尚缺乏完整評價,在進入臨床使用之前還需要進行多方面的深入研究[14-16]。

    3.2 結(jié)論

    綜上,環(huán)巴胺在肝損傷小鼠體內(nèi)具有明顯的抗肝損傷作用,但其在人體內(nèi)的抗肝損傷等作用機理有待研究和探索。

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