• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    嗜熱芽孢桿菌SL-2產(chǎn)生物乳化劑的研究

    2022-09-20 09:17:56王雅潔梁綺雯楊芳芳
    生物化工 2022年4期
    關(guān)鍵詞:乳化劑乳化蛋白質(zhì)

    王雅潔,梁綺雯,楊芳芳

    (廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510450)

    生物乳化劑是指一種由細(xì)菌新陳代謝所產(chǎn)生的表面活性化合物,一般是蛋白質(zhì)、多糖、脂蛋白、脂多糖中的一種或是幾種的復(fù)合體所組成的生物表面活性劑[1]。生物乳化劑具有穩(wěn)定界面膜的作用,能與石油烴等物質(zhì)形成穩(wěn)定的油水乳化液,沒有毒害作用,可以進(jìn)行生物降解,是一種環(huán)境友好型材料,目前在石油開采、污染治理、農(nóng)藥開發(fā)、化妝品以及食品等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景[2-3]。

    嗜熱芽孢桿菌SL-2是從中國勝利油田油井中分離的一株細(xì)菌,這種菌株可以進(jìn)行原油乳化,是目前生物乳化劑研究實驗中的熱門菌株之一。其在高溫(60 ℃)條件下能正常生長代謝,且乳化烴類物質(zhì)的效果優(yōu)越。因此,開展該菌株生長及烴類乳化特性的研究,可以為該菌進(jìn)一步應(yīng)用于微生物驅(qū)油奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、儀器與試劑

    1.1.1 菌株

    SL-2菌株來自中國勝利油田油井。

    1.1.2 實驗儀器

    HPX-Ⅱ-200隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;FTIR-650S傅里葉變換紅外光譜儀,天津港東科技發(fā)展股份有限公司;EM-30AX掃描電子顯微鏡,韓國COXEM公司;3K15低溫高速離心機(jī),德國Sigma公司;IMARK酶標(biāo)儀,美國BIORAD公司;UV-1800紫外可見分光光度計,上海美譜達(dá)儀器有限公司;X50梯度PCR儀,德國Master cycler;L-8800氨基酸自動分析儀,日本日立公司;電泳儀,Sub-Cell GT水平電泳槽,美國Bio-Rad公司;Tanon 3500膠成像儀,上海天能科技有限公司;VM100漩渦振蕩儀,北京托摩根生物科技有限公司;FD-1A-50冷凍干燥儀,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

    1.1.3 實驗試劑

    蔗糖,10021418,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖,10010518,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊脂糖,CAS 9012-36-6,阿拉丁試劑(上海)有限公司;酵母粉,LP0021,英國OXOID公司;蛋白胨,LP0042,英國OXOID公司;甲苯,C0430110209,南京化學(xué)試劑有限公司;二甲苯,C0430530209,南京化學(xué)試劑有限公司;Na2HPO4,10020318,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;KH2PO4,10017618,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NH4NO3,A117717-1 g,阿拉丁試劑(上海)有限公司;MgSO4·7H2O,M200,美國phytotech公司;柴油,南京德茗化工科技有限公司;煤油,南京德茗化工科技有限公司;液體石蠟,南京德茗化工科技有限公司;SDS,南京圣比澳生物科技公司。

    1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

    1.2.1 培養(yǎng)基

    種子培養(yǎng)基:酵母粉3.00 g/L,蛋白胨3.00 g/L,K2HPO4·4H2O 2.70 g/L,NaCl 5.00 g/L。

    MSS培養(yǎng)基:NaCl 10.00 g/L,蔗糖10.00 g/L,Na2HPO45.00 g/L,KH2PO42.00 g/L,NH4NO33.00 g/L,MgSO4·7H2O 0.20 g/L。

    1.2.2 培養(yǎng)條件

    在固體培養(yǎng)基MSS中選出一株單菌落,然后接種到培養(yǎng)基里,在250 mL的三角杯中加入約50 mL的菌液,在60 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)12 h。以5%(v∶v)轉(zhuǎn)接量將種子孵化液轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基里,在250 mL三角杯中添加約50 mL的細(xì)菌水,以60 ℃、130 r/min的條件振蕩培養(yǎng)。

    1.3 目的菌株的鑒別

    (1)通過肉眼觀察目的菌株的生長形態(tài)、顏色、外觀的粗細(xì)程度等,并用電子顯微鏡觀察目的菌株的外觀和構(gòu)造。(2)通過16S rDNA測序解析鑒定目的菌株的種類以及屬性。

    1.4 乳化劑的分離提取與純化

    (1)將培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心20 min,倒出上清液;

    (2)抽濾(上清液),濾膜孔徑標(biāo)準(zhǔn)尺寸為0.22 μm;

    (3)將濾液與事先在4 ℃冰箱中預(yù)冷的冰乙醇以1∶3(v∶v)的比例混合,置于4 ℃冰箱中過夜;

    (4)經(jīng)沉淀后的濾液于4 ℃、8 000 r/min的條件下離心20 min,在分離出的沉淀物中加入去離子水使其充分溶解,并將其放于透析袋于4 ℃冰箱透析48 h后,隨后進(jìn)行冷凍干燥操作,得到白色絮狀物質(zhì),儲存于-20 ℃的環(huán)境中。

    1.5 乳化活性的測定

    將生物柴油與發(fā)酵液及萃取物按1∶1(v∶v)混合,渦旋振蕩60 s,靜置48 h以乳化指數(shù)(EI)表征乳化劑的乳化活性。乳化指數(shù)的計算公式:乳化指數(shù)=乳化層高/油相總高。

    1.6 生物乳化劑定性實驗

    (1)糖類定性實驗:在硅膠板上輕輕點樣,晾干后,將硫酸-蒽酮溶液均勻噴灑在硅膠板上,然后放入120 ℃烘箱加熱2~5 min,使其顯示出顏色,若在硅膠板上出現(xiàn)藍(lán)綠色即可證明樣品中存在糖類。

    (2)蛋白質(zhì)定性實驗:在硅膠板點樣品后,晾干,用0.1%茚三酮溶液快速潤濕后放入110 ℃烘箱中加熱15 min顯色。用茚三酮顯色后都呈現(xiàn)出和陽性對照相似的黃色,說明該乳化劑中含有蛋白質(zhì)組分。

    (3)脂類定性實驗:在硅膠板上點樣,吹干,將其放入展層缸中,待展開劑前部距離硅膠板頂端大約1 cm時,取出硅膠板,在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干,均勻展鋪顯色劑后將其置于110 ℃烘箱中加熱5~10 min,觀察顏色是否發(fā)生改變,如果出現(xiàn)紫紅色即可證明樣品中存在脂肽類物質(zhì)。展開劑:氯仿/甲醇/水(65/15/2,v/v/v);將0.2 g的茚三酮溶放入100 mL乙醇溶液中,脂肽顯紫紅色。

    1.7 乳化劑組分分析

    1.7.1 乳化劑的紅外光譜分析

    將樣品與溴化鉀混合置于在研缽中磨碎,制作壓片,上機(jī)掃描。

    1.7.2 乳化劑的氨基酸分析

    乳化劑樣品經(jīng)過6 mol/L HCl水解12 h后進(jìn)行氨基酸組成分析。使用HITACHI L-8800型氨基酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸組成分析,操作過程參照儀器使用說明。

    1.7.3 蛋白質(zhì)電泳

    蛋白質(zhì)定量方法:通過SDS-PAGE電泳檢測,使蛋白分離原理是憑借其蛋白分子量亞基不同,在樣品介質(zhì)和Acrylamide gel中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后,亞基分子量大小決定蛋白質(zhì)亞基電泳遷移速率。使用考馬斯亮藍(lán)染色。

    1.8 乳化劑的性質(zhì)研究

    1.8.1 乳化劑對不同底物的乳化作用

    以甲苯、二甲苯、煤油、生物柴油和液蠟等為主要乳化對象,測試計算發(fā)酵液和離心去菌體的上清液的EI值。

    1.8.2 乳化劑的稀釋性能

    將乳化劑樣品溶解在重蒸水中,并逐級稀釋到原液濃度的1/1、1/2、1/4、1/6和1/10,以柴油為有機(jī)相,靜置72 h后測定其乳化活性,EI-72。

    1.8.3 乳化劑酸敏性

    取乳化的試樣混合為乳狀液,并分別測其在pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的環(huán)境下乳化活性,EI-24。

    1.8.4 溫度對乳化劑的影響

    將與乳化劑和柴油充分接觸形成的乳狀液分別置于 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和 95 ℃下,放置 24 h后再測定其EI-24。

    1.9 數(shù)據(jù)分析

    將篩選得到的高溫菌株進(jìn)行DNA的提取后,利用細(xì)菌16SrDNA基因通用引物來擴(kuò)增16SrDNA基因序列,序列在GenBank中用BLAST比對。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的菌株的鑒別

    由圖1可知,菌株SL-2呈棒桿狀形態(tài),且其外層有一層透明物質(zhì),該物質(zhì)可能是由多糖莢膜組成的。根據(jù)16SrDNA的測序結(jié)果,登陸https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,將其結(jié)果在GenBank中用BLAST比對,得出菌株SL-2與Geobacillus pallidus.的同源性為100%。

    圖1 菌株SL-2的掃描電鏡圖

    2.2 生物乳化劑定性實驗

    2.2.1 菌株SL-2發(fā)酵液的乳化活性

    菌株SL-2在以葡萄糖為碳源時可以產(chǎn)生一種生物乳化劑,該乳化劑的乳化活性隨著菌株的生長有所變化。在生產(chǎn)乳化劑培養(yǎng)基發(fā)酵過程中,發(fā)現(xiàn)表面張力略有下降,發(fā)酵5 h乳化活性達(dá)到100%;72 h后,乳化液可以穩(wěn)定在2個月以上。發(fā)酵液對0#柴油的EI-24為100%。菌株SL-2在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,經(jīng)離心、抽濾、沉淀、凍干的步驟,可獲得乳化劑的產(chǎn)量為0.362 g/L。

    2.2.2 乳化劑樣品的薄層分析

    采用薄層定性分析法可以對試樣中的化學(xué)組成進(jìn)行研究,該試驗的基本原理是采用具有差異的特異性顯色劑方法。將酸水解后所得的試樣用毛細(xì)管在點樣或有機(jī)硅板上點樣,噴灑硫酸-蒽酮溶液后呈出現(xiàn)藍(lán)綠色,這一顯色顏色反應(yīng)現(xiàn)象可以證實乳化劑試樣中含有葡萄糖類成分;用茚三酮顯色的水解物試樣呈現(xiàn)淡淡橙色,而水解后的乳化物試樣呈現(xiàn)紫黃色,這一顏色變化現(xiàn)象表明乳化試樣中存在含有蛋白質(zhì)。乳化劑樣品經(jīng)過薄層色譜法茚三酮顯色后呈出現(xiàn)紫紅色,說明乳化劑樣品中含有脂類物質(zhì)。通過對特異性顯色法顏色反應(yīng)的薄層定性分析可以證明,菌株SL-2所產(chǎn)生的乳化劑化學(xué)組成主要包括糖、脂類和蛋白質(zhì)(肽)[4]。

    2.2.3 乳化劑的紅外光譜分析

    將菌株SL-2所產(chǎn)的乳化劑試樣用溴化鉀壓片后在400~4 000 cm-1波數(shù)下掃描[5],結(jié)果如圖2所示。該乳化物于1 065 cm-1、1 548 cm-1、1 651 cm-1、2 935 cm-1和3 314 cm-1處存在特征性吸收峰。其中,吸收峰(1 065 cm-1)是由C—O伸縮振動產(chǎn)生,吸收峰(1 548 cm-1)是由糖環(huán)上的C—O—C伸縮振動產(chǎn)生,吸收峰(1 651 cm-1)是酰胺鍵上羰基的特征吸收峰,(1 651 cm-1)是糖類C—H伸縮振動的特性吸收峰,而吸收寬峰(3314 cm-1)是由O—H的伸縮振動而形成。從菌株SL-2所產(chǎn)乳化劑的紅外光譜可發(fā)現(xiàn),該物質(zhì)中存在較多-OH和RCO-NHR基團(tuán),且上述基團(tuán)都是糖蛋白的特征官能團(tuán),因此能夠最終判斷糖類和蛋白質(zhì)都是該乳化劑的主要化學(xué)組成。

    圖2 菌株SL-2產(chǎn)生的生物乳化劑的紅外光譜分析

    2.2.4 乳化劑的氨基酸分析

    乳化劑樣品經(jīng)酸水解12 h后進(jìn)行氨基酸組成分析。其中,極性氨基酸有7種,分別是Thr、Asp、Glu、His、Ser、Arg和 Lys,約為乳化劑總量的13.74%;非極性氨基酸有10種,分別為Ile、Val、Cys、Met、Ala、Tyr、Leu、Gly、Pro 和 Phe,約為乳化劑總質(zhì)量的14.01%。

    2.2.5 乳化劑的蛋白質(zhì)分析

    由圖3可知,條帶顏色較亮的是26.0 kDa和 66.4 kDa大小蛋白質(zhì),證明乳化劑中含上述兩種大小的蛋白質(zhì)比較多,其余蛋白質(zhì)條帶顏色很淺證明含量少甚至沒有,實驗證明生物乳化劑含有的蛋白質(zhì)種類較單一,因此還需要進(jìn)一步驗證才能確定生物乳化劑中活性蛋白的成分。

    圖3 蛋白質(zhì)電泳圖

    2.3 乳化劑理化性質(zhì)分析

    2.3.1 乳化劑對不同底物的乳化作用

    本實驗選取的乳化對象分別為甲苯、二甲苯、煤油、柴油和液蠟,分別測試發(fā)酵液和上清液的乳化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液對甲苯、二甲苯、柴油和煤油的EI-24均為100%,對液蠟的乳化效果僅為76%;上清液對二甲苯和柴油的EI-24為 100%,但對甲苯、煤油和液蠟的乳化能力有所降低,其中對液蠟的EI-24只有25%。證明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑對不同的石油烴具有不同的乳化效果,同時也說明菌株本身對石油烴也有一定的乳化效果。

    2.3.2 乳化劑的稀釋特性

    與原液濃度一致時,其EI-72為100%;當(dāng)乳化劑濃度為原液濃度的1/2時,其EI-72仍大于90%;當(dāng)溶液中乳化劑的濃度為原液濃度的1/10時,其EI-72依然大于30%,優(yōu)于已報道的一些生物乳化劑的乳化效果[4-5]。說明菌株SL-2所產(chǎn)生乳化劑在極微量條件下就可以乳化石油烴,是一種高效生物乳化劑。

    2.3.3 乳化劑的酸敏性

    當(dāng)乳化劑溶液的pH值為3~9時,其EI-24均為100%;當(dāng)pH值在10~12時,乳化活性略有下降。說明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑具有較好的耐酸能力。

    2.3.4 溫度對乳化劑活性的影響

    乳狀液的破乳程度隨著放置溫度的增加而增加,在60 ℃高溫生長環(huán)境下形成的生物乳化劑特性非常穩(wěn)定,溫度低于80 ℃時,EI-24仍為100%;當(dāng)放置溫度為 95 ℃時,其EI-24仍大于40%,說明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑具有一定的耐高溫性質(zhì)。

    圖4 溫度對菌株SL-2乳化活性的影響

    3 結(jié)論

    本實驗對蒼白地芽胞桿菌SL-2所產(chǎn)的生物乳化劑進(jìn)行了分離純化及化學(xué)組分分析,發(fā)現(xiàn)該生物乳化劑由糖類、脂類和蛋白質(zhì)組成;對其所產(chǎn)生物乳化劑的理化性能進(jìn)行分析,結(jié)果顯示菌株SL-2在60 ℃高溫生長環(huán)境下形成的生物乳化劑性質(zhì)穩(wěn)定,證實了菌株SL-2是一株能夠適用于中高溫油藏的原位生物驅(qū)油菌種,并有著很重要的科研價值。但目前對該菌株生產(chǎn)生物乳化劑的機(jī)制尚不清楚,因此研究該菌株合成乳化劑的代謝途徑和調(diào)控機(jī)制將是筆者未來的研究方向與重點。

    猜你喜歡
    乳化劑乳化蛋白質(zhì)
    蛋白質(zhì)自由
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:48
    復(fù)合乳化劑對草魚生長及脂代謝的影響
    人工智能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
    海外星云(2021年9期)2021-10-14 07:26:10
    乳化瀝青廠拌冷再生在陜西的應(yīng)用
    石油瀝青(2019年3期)2019-07-16 08:48:22
    SBS改性瀝青的乳化及應(yīng)用
    石油瀝青(2018年3期)2018-07-14 02:19:20
    簡析一種新型乳化瀝青的生產(chǎn)工藝
    中國公路(2017年17期)2017-11-09 02:25:42
    蛋白質(zhì)計算問題歸納
    一種新型酚化木質(zhì)素胺乳化劑的合成及其性能
    斯泰潘實現(xiàn)清潔技術(shù)重大突破——研發(fā)出新型水基乳化劑
    乳化劑對AM/AMPS反相乳液性能影響研究
    精品国产一区二区三区四区第35| 18禁国产床啪视频网站| 露出奶头的视频| 中国美女看黄片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品亚洲美女久久久| 91字幕亚洲| 国产91精品成人一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 婷婷丁香在线五月| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产极品粉嫩免费观看在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 亚洲 国产 在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日本欧美视频一区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 在线视频色国产色| 国产成人系列免费观看| 乱人伦中国视频| 亚洲伊人色综图| 亚洲自拍偷在线| 国产精品影院久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美午夜高清在线| 在线天堂中文资源库| 天天添夜夜摸| 男女下面插进去视频免费观看| 视频在线观看一区二区三区| 国产av又大| 国产单亲对白刺激| 91大片在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 不卡一级毛片| 久久香蕉国产精品| 最新在线观看一区二区三区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品香港三级国产av潘金莲| a在线观看视频网站| www.熟女人妻精品国产| 动漫黄色视频在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 很黄的视频免费| 真人做人爱边吃奶动态| 成人国产一区最新在线观看| 天天添夜夜摸| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲成人免费电影在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 香蕉国产在线看| 国产在线精品亚洲第一网站| 悠悠久久av| 免费高清视频大片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 超碰成人久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲精华国产精华精| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| av视频在线观看入口| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产成人影院久久av| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 变态另类丝袜制服| 两人在一起打扑克的视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 一个人免费在线观看的高清视频| aaaaa片日本免费| 国产熟女xx| 村上凉子中文字幕在线| 欧美日韩乱码在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 婷婷六月久久综合丁香| 久久亚洲真实| 国产高清videossex| 精品不卡国产一区二区三区| www.999成人在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品国产高清国产av| 乱人伦中国视频| or卡值多少钱| 首页视频小说图片口味搜索| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲五月天丁香| 天堂影院成人在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 国产一区二区在线av高清观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 两个人看的免费小视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲av片天天在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久国产成人免费| 丝袜美足系列| 国产精品影院久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 老司机福利观看| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美黄色片欧美黄色片| 可以在线观看的亚洲视频| 午夜日韩欧美国产| 久热这里只有精品99| 黄片大片在线免费观看| 国产精品野战在线观看| 99re在线观看精品视频| 免费看十八禁软件| 丁香六月欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 在线观看日韩欧美| 咕卡用的链子| 91麻豆精品激情在线观看国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人精品一区二区免费| 久久狼人影院| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 91在线观看av| 免费少妇av软件| 免费观看人在逋| 狂野欧美激情性xxxx| 一级a爱视频在线免费观看| 18禁国产床啪视频网站| 99久久精品国产亚洲精品| 久久精品国产综合久久久| 日本五十路高清| 久久精品国产亚洲av高清一级| 天堂影院成人在线观看| 午夜影院日韩av| 一级片免费观看大全| 黄色a级毛片大全视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日本欧美视频一区| 麻豆av在线久日| 国产精品亚洲av一区麻豆| 少妇熟女aⅴ在线视频| 91字幕亚洲| 国产精品日韩av在线免费观看 | 欧美在线黄色| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美午夜高清在线| bbb黄色大片| 伦理电影免费视频| 亚洲午夜理论影院| 久久婷婷成人综合色麻豆| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| www国产在线视频色| 91老司机精品| 欧美精品亚洲一区二区| 色在线成人网| 90打野战视频偷拍视频| 欧美乱妇无乱码| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品欧美国产一区二区三| 最近最新中文字幕大全电影3 | 丝袜美足系列| 97碰自拍视频| 色综合站精品国产| 亚洲avbb在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久性视频一级片| www日本在线高清视频| 午夜福利,免费看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 后天国语完整版免费观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费av毛片视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 手机成人av网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜视频精品福利| 久久久久国内视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 一级作爱视频免费观看| 午夜激情av网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 人妻久久中文字幕网| 悠悠久久av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 在线观看舔阴道视频| 欧美午夜高清在线| 成人三级做爰电影| 国产精品影院久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 在线国产一区二区在线| 岛国视频午夜一区免费看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品在线美女| 性色av乱码一区二区三区2| 精品第一国产精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲成a人片在线一区二区| 麻豆成人av在线观看| 国产av精品麻豆| 91大片在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 999精品在线视频| 国产成人精品无人区| 99精品在免费线老司机午夜| 在线免费观看的www视频| 狂野欧美激情性xxxx| 悠悠久久av| 久久久久久久久久久久大奶| 99国产精品99久久久久| 免费看a级黄色片| 88av欧美| 久久久久久人人人人人| 欧美黑人精品巨大| 国产亚洲精品久久久久5区| 性少妇av在线| 9191精品国产免费久久| 午夜影院日韩av| 日本a在线网址| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩国内少妇激情av| 久久狼人影院| 视频在线观看一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲成av片中文字幕在线观看| av福利片在线| 热re99久久国产66热| 色在线成人网| 一级,二级,三级黄色视频| 91大片在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费观看精品视频网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产av一区在线观看免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲专区中文字幕在线| 久久精品国产清高在天天线| 在线观看日韩欧美| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 十八禁人妻一区二区| 色综合婷婷激情| 亚洲精品在线观看二区| 国产成人影院久久av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品久久久久久,| а√天堂www在线а√下载| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产视频一区二区在线看| 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩有码中文字幕| 天天一区二区日本电影三级 | 亚洲av电影在线进入| 性欧美人与动物交配| 一级a爱视频在线免费观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 一本久久中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| 黄色 视频免费看| 一夜夜www| 亚洲在线自拍视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 12—13女人毛片做爰片一| 变态另类丝袜制服| 精品日产1卡2卡| 999精品在线视频| 黄色女人牲交| 好男人在线观看高清免费视频 | 香蕉久久夜色| 国产av一区二区精品久久| 又大又爽又粗| 欧美久久黑人一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成人亚洲精品一区在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产亚洲av高清不卡| 欧美日本中文国产一区发布| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 午夜福利,免费看| 中文字幕色久视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品二区激情视频| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 一a级毛片在线观看| 精品人妻1区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 正在播放国产对白刺激| 一级a爱视频在线免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 午夜福利影视在线免费观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 免费看十八禁软件| 亚洲中文日韩欧美视频| 日本五十路高清| 两个人视频免费观看高清| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲片人在线观看| 很黄的视频免费| www日本在线高清视频| 两个人免费观看高清视频| 精品无人区乱码1区二区| 久热爱精品视频在线9| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲欧美精品综合久久99| 9热在线视频观看99| 精品乱码久久久久久99久播| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线观看舔阴道视频| 日本 av在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久这里只有精品19| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品av久久久久免费| 久久热在线av| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久午夜亚洲精品久久| 精品国产国语对白av| 亚洲精品在线观看二区| 人成视频在线观看免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 久热这里只有精品99| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日本视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 性欧美人与动物交配| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99国产综合亚洲精品| 欧美大码av| 久久人人精品亚洲av| 又大又爽又粗| 又黄又粗又硬又大视频| 宅男免费午夜| 热99re8久久精品国产| 精品福利观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲欧美激情综合另类| 少妇粗大呻吟视频| av网站免费在线观看视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | av视频在线观看入口| 色尼玛亚洲综合影院| 97碰自拍视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲欧美激情在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 看免费av毛片| avwww免费| 亚洲免费av在线视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美激情高清一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲色图av天堂| 性色av乱码一区二区三区2| 久久精品国产综合久久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产在线精品亚洲第一网站| 国产xxxxx性猛交| 99在线视频只有这里精品首页| 一二三四在线观看免费中文在| 露出奶头的视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久久久久人人人人人| 亚洲国产欧美一区二区综合| 又黄又粗又硬又大视频| 在线天堂中文资源库| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人国产一区最新在线观看| 两性夫妻黄色片| 九色亚洲精品在线播放| 91av网站免费观看| 一区二区三区国产精品乱码| 宅男免费午夜| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲全国av大片| 色精品久久人妻99蜜桃| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜久久久久精精品| av视频免费观看在线观看| 精品久久蜜臀av无| 亚洲全国av大片| 久9热在线精品视频| 女同久久另类99精品国产91| 叶爱在线成人免费视频播放| 我的亚洲天堂| 岛国视频午夜一区免费看| 色综合欧美亚洲国产小说| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一边摸一边抽搐一进一小说| 91精品国产国语对白视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 天堂动漫精品| 精品第一国产精品| 亚洲专区中文字幕在线| 十八禁人妻一区二区| 免费无遮挡裸体视频| 免费观看人在逋| 91九色精品人成在线观看| 91精品三级在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 性少妇av在线| 18禁观看日本| 电影成人av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 999久久久精品免费观看国产| 大码成人一级视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产99白浆流出| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 老熟妇仑乱视频hdxx| av网站免费在线观看视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲男人的天堂狠狠| 久久人人精品亚洲av| 精品国产一区二区久久| 亚洲成人久久性| 在线观看免费日韩欧美大片| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 91精品国产国语对白视频| 制服丝袜大香蕉在线| 又紧又爽又黄一区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 啦啦啦免费观看视频1| 久久人妻av系列| 午夜福利免费观看在线| 97人妻天天添夜夜摸| 成年人黄色毛片网站| 国产av在哪里看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美乱色亚洲激情| 午夜免费激情av| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品九九99| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产成人影院久久av| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 啦啦啦 在线观看视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 男女之事视频高清在线观看| 激情视频va一区二区三区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| avwww免费| 久久青草综合色| 亚洲九九香蕉| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产成人一区二区三区免费视频网站| av欧美777| 亚洲 欧美一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 国产99白浆流出| 亚洲一区高清亚洲精品| 在线免费观看的www视频| 精品国产国语对白av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| ponron亚洲| 午夜福利成人在线免费观看| 变态另类丝袜制服| 国产精品国产高清国产av| 一区在线观看完整版| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲在线自拍视频| 久久人妻熟女aⅴ| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线永久观看黄色视频| 亚洲午夜理论影院| 99riav亚洲国产免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产高清videossex| 色综合站精品国产| 一二三四在线观看免费中文在| 国产麻豆成人av免费视频| 久久亚洲精品不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 中国美女看黄片| 亚洲伊人色综图| 正在播放国产对白刺激| 99国产综合亚洲精品| 欧美成人午夜精品| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲,欧美精品.| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲五月婷婷丁香| 嫩草影视91久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久国产精品麻豆| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 他把我摸到了高潮在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 黄片大片在线免费观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 中文字幕久久专区| 亚洲黑人精品在线| 波多野结衣高清无吗| 国产精品永久免费网站| 国产精品精品国产色婷婷| 久久精品91蜜桃| 亚洲成国产人片在线观看| 十八禁网站免费在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产xxxxx性猛交| 日日爽夜夜爽网站| 麻豆av在线久日| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久久久久久免费视频了| 两个人视频免费观看高清| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日本三级黄在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日本黄色视频三级网站网址| 精品久久蜜臀av无| 久久香蕉国产精品| 又紧又爽又黄一区二区| 女人被狂操c到高潮| 精品国产美女av久久久久小说| 我的亚洲天堂| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人永久免费在线观看视频| 大陆偷拍与自拍| 欧美性长视频在线观看| 十八禁人妻一区二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲五月色婷婷综合| 一区在线观看完整版| 亚洲精品在线观看二区| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲国产看品久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产97色在线日韩免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 操出白浆在线播放| 18禁观看日本| av片东京热男人的天堂| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品 欧美亚洲| 深夜精品福利| netflix在线观看网站| 国产高清有码在线观看视频 | 啦啦啦 在线观看视频| 国产伦一二天堂av在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成人三级做爰电影| 亚洲av电影在线进入| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 亚洲五月色婷婷综合| 成年女人毛片免费观看观看9| 美女高潮到喷水免费观看| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 91成年电影在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99久久综合精品五月天人人| 国产成人精品在线电影| 不卡一级毛片| 高清在线国产一区|