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    嗜熱芽孢桿菌SL-2產(chǎn)生物乳化劑的研究

    2022-09-20 09:17:56王雅潔梁綺雯楊芳芳
    生物化工 2022年4期
    關(guān)鍵詞:乳化劑乳化蛋白質(zhì)

    王雅潔,梁綺雯,楊芳芳

    (廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510450)

    生物乳化劑是指一種由細(xì)菌新陳代謝所產(chǎn)生的表面活性化合物,一般是蛋白質(zhì)、多糖、脂蛋白、脂多糖中的一種或是幾種的復(fù)合體所組成的生物表面活性劑[1]。生物乳化劑具有穩(wěn)定界面膜的作用,能與石油烴等物質(zhì)形成穩(wěn)定的油水乳化液,沒有毒害作用,可以進(jìn)行生物降解,是一種環(huán)境友好型材料,目前在石油開采、污染治理、農(nóng)藥開發(fā)、化妝品以及食品等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景[2-3]。

    嗜熱芽孢桿菌SL-2是從中國勝利油田油井中分離的一株細(xì)菌,這種菌株可以進(jìn)行原油乳化,是目前生物乳化劑研究實驗中的熱門菌株之一。其在高溫(60 ℃)條件下能正常生長代謝,且乳化烴類物質(zhì)的效果優(yōu)越。因此,開展該菌株生長及烴類乳化特性的研究,可以為該菌進(jìn)一步應(yīng)用于微生物驅(qū)油奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、儀器與試劑

    1.1.1 菌株

    SL-2菌株來自中國勝利油田油井。

    1.1.2 實驗儀器

    HPX-Ⅱ-200隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;FTIR-650S傅里葉變換紅外光譜儀,天津港東科技發(fā)展股份有限公司;EM-30AX掃描電子顯微鏡,韓國COXEM公司;3K15低溫高速離心機(jī),德國Sigma公司;IMARK酶標(biāo)儀,美國BIORAD公司;UV-1800紫外可見分光光度計,上海美譜達(dá)儀器有限公司;X50梯度PCR儀,德國Master cycler;L-8800氨基酸自動分析儀,日本日立公司;電泳儀,Sub-Cell GT水平電泳槽,美國Bio-Rad公司;Tanon 3500膠成像儀,上海天能科技有限公司;VM100漩渦振蕩儀,北京托摩根生物科技有限公司;FD-1A-50冷凍干燥儀,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

    1.1.3 實驗試劑

    蔗糖,10021418,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖,10010518,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊脂糖,CAS 9012-36-6,阿拉丁試劑(上海)有限公司;酵母粉,LP0021,英國OXOID公司;蛋白胨,LP0042,英國OXOID公司;甲苯,C0430110209,南京化學(xué)試劑有限公司;二甲苯,C0430530209,南京化學(xué)試劑有限公司;Na2HPO4,10020318,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;KH2PO4,10017618,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NH4NO3,A117717-1 g,阿拉丁試劑(上海)有限公司;MgSO4·7H2O,M200,美國phytotech公司;柴油,南京德茗化工科技有限公司;煤油,南京德茗化工科技有限公司;液體石蠟,南京德茗化工科技有限公司;SDS,南京圣比澳生物科技公司。

    1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

    1.2.1 培養(yǎng)基

    種子培養(yǎng)基:酵母粉3.00 g/L,蛋白胨3.00 g/L,K2HPO4·4H2O 2.70 g/L,NaCl 5.00 g/L。

    MSS培養(yǎng)基:NaCl 10.00 g/L,蔗糖10.00 g/L,Na2HPO45.00 g/L,KH2PO42.00 g/L,NH4NO33.00 g/L,MgSO4·7H2O 0.20 g/L。

    1.2.2 培養(yǎng)條件

    在固體培養(yǎng)基MSS中選出一株單菌落,然后接種到培養(yǎng)基里,在250 mL的三角杯中加入約50 mL的菌液,在60 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)12 h。以5%(v∶v)轉(zhuǎn)接量將種子孵化液轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基里,在250 mL三角杯中添加約50 mL的細(xì)菌水,以60 ℃、130 r/min的條件振蕩培養(yǎng)。

    1.3 目的菌株的鑒別

    (1)通過肉眼觀察目的菌株的生長形態(tài)、顏色、外觀的粗細(xì)程度等,并用電子顯微鏡觀察目的菌株的外觀和構(gòu)造。(2)通過16S rDNA測序解析鑒定目的菌株的種類以及屬性。

    1.4 乳化劑的分離提取與純化

    (1)將培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心20 min,倒出上清液;

    (2)抽濾(上清液),濾膜孔徑標(biāo)準(zhǔn)尺寸為0.22 μm;

    (3)將濾液與事先在4 ℃冰箱中預(yù)冷的冰乙醇以1∶3(v∶v)的比例混合,置于4 ℃冰箱中過夜;

    (4)經(jīng)沉淀后的濾液于4 ℃、8 000 r/min的條件下離心20 min,在分離出的沉淀物中加入去離子水使其充分溶解,并將其放于透析袋于4 ℃冰箱透析48 h后,隨后進(jìn)行冷凍干燥操作,得到白色絮狀物質(zhì),儲存于-20 ℃的環(huán)境中。

    1.5 乳化活性的測定

    將生物柴油與發(fā)酵液及萃取物按1∶1(v∶v)混合,渦旋振蕩60 s,靜置48 h以乳化指數(shù)(EI)表征乳化劑的乳化活性。乳化指數(shù)的計算公式:乳化指數(shù)=乳化層高/油相總高。

    1.6 生物乳化劑定性實驗

    (1)糖類定性實驗:在硅膠板上輕輕點樣,晾干后,將硫酸-蒽酮溶液均勻噴灑在硅膠板上,然后放入120 ℃烘箱加熱2~5 min,使其顯示出顏色,若在硅膠板上出現(xiàn)藍(lán)綠色即可證明樣品中存在糖類。

    (2)蛋白質(zhì)定性實驗:在硅膠板點樣品后,晾干,用0.1%茚三酮溶液快速潤濕后放入110 ℃烘箱中加熱15 min顯色。用茚三酮顯色后都呈現(xiàn)出和陽性對照相似的黃色,說明該乳化劑中含有蛋白質(zhì)組分。

    (3)脂類定性實驗:在硅膠板上點樣,吹干,將其放入展層缸中,待展開劑前部距離硅膠板頂端大約1 cm時,取出硅膠板,在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干,均勻展鋪顯色劑后將其置于110 ℃烘箱中加熱5~10 min,觀察顏色是否發(fā)生改變,如果出現(xiàn)紫紅色即可證明樣品中存在脂肽類物質(zhì)。展開劑:氯仿/甲醇/水(65/15/2,v/v/v);將0.2 g的茚三酮溶放入100 mL乙醇溶液中,脂肽顯紫紅色。

    1.7 乳化劑組分分析

    1.7.1 乳化劑的紅外光譜分析

    將樣品與溴化鉀混合置于在研缽中磨碎,制作壓片,上機(jī)掃描。

    1.7.2 乳化劑的氨基酸分析

    乳化劑樣品經(jīng)過6 mol/L HCl水解12 h后進(jìn)行氨基酸組成分析。使用HITACHI L-8800型氨基酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸組成分析,操作過程參照儀器使用說明。

    1.7.3 蛋白質(zhì)電泳

    蛋白質(zhì)定量方法:通過SDS-PAGE電泳檢測,使蛋白分離原理是憑借其蛋白分子量亞基不同,在樣品介質(zhì)和Acrylamide gel中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后,亞基分子量大小決定蛋白質(zhì)亞基電泳遷移速率。使用考馬斯亮藍(lán)染色。

    1.8 乳化劑的性質(zhì)研究

    1.8.1 乳化劑對不同底物的乳化作用

    以甲苯、二甲苯、煤油、生物柴油和液蠟等為主要乳化對象,測試計算發(fā)酵液和離心去菌體的上清液的EI值。

    1.8.2 乳化劑的稀釋性能

    將乳化劑樣品溶解在重蒸水中,并逐級稀釋到原液濃度的1/1、1/2、1/4、1/6和1/10,以柴油為有機(jī)相,靜置72 h后測定其乳化活性,EI-72。

    1.8.3 乳化劑酸敏性

    取乳化的試樣混合為乳狀液,并分別測其在pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的環(huán)境下乳化活性,EI-24。

    1.8.4 溫度對乳化劑的影響

    將與乳化劑和柴油充分接觸形成的乳狀液分別置于 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和 95 ℃下,放置 24 h后再測定其EI-24。

    1.9 數(shù)據(jù)分析

    將篩選得到的高溫菌株進(jìn)行DNA的提取后,利用細(xì)菌16SrDNA基因通用引物來擴(kuò)增16SrDNA基因序列,序列在GenBank中用BLAST比對。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的菌株的鑒別

    由圖1可知,菌株SL-2呈棒桿狀形態(tài),且其外層有一層透明物質(zhì),該物質(zhì)可能是由多糖莢膜組成的。根據(jù)16SrDNA的測序結(jié)果,登陸https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,將其結(jié)果在GenBank中用BLAST比對,得出菌株SL-2與Geobacillus pallidus.的同源性為100%。

    圖1 菌株SL-2的掃描電鏡圖

    2.2 生物乳化劑定性實驗

    2.2.1 菌株SL-2發(fā)酵液的乳化活性

    菌株SL-2在以葡萄糖為碳源時可以產(chǎn)生一種生物乳化劑,該乳化劑的乳化活性隨著菌株的生長有所變化。在生產(chǎn)乳化劑培養(yǎng)基發(fā)酵過程中,發(fā)現(xiàn)表面張力略有下降,發(fā)酵5 h乳化活性達(dá)到100%;72 h后,乳化液可以穩(wěn)定在2個月以上。發(fā)酵液對0#柴油的EI-24為100%。菌株SL-2在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,經(jīng)離心、抽濾、沉淀、凍干的步驟,可獲得乳化劑的產(chǎn)量為0.362 g/L。

    2.2.2 乳化劑樣品的薄層分析

    采用薄層定性分析法可以對試樣中的化學(xué)組成進(jìn)行研究,該試驗的基本原理是采用具有差異的特異性顯色劑方法。將酸水解后所得的試樣用毛細(xì)管在點樣或有機(jī)硅板上點樣,噴灑硫酸-蒽酮溶液后呈出現(xiàn)藍(lán)綠色,這一顯色顏色反應(yīng)現(xiàn)象可以證實乳化劑試樣中含有葡萄糖類成分;用茚三酮顯色的水解物試樣呈現(xiàn)淡淡橙色,而水解后的乳化物試樣呈現(xiàn)紫黃色,這一顏色變化現(xiàn)象表明乳化試樣中存在含有蛋白質(zhì)。乳化劑樣品經(jīng)過薄層色譜法茚三酮顯色后呈出現(xiàn)紫紅色,說明乳化劑樣品中含有脂類物質(zhì)。通過對特異性顯色法顏色反應(yīng)的薄層定性分析可以證明,菌株SL-2所產(chǎn)生的乳化劑化學(xué)組成主要包括糖、脂類和蛋白質(zhì)(肽)[4]。

    2.2.3 乳化劑的紅外光譜分析

    將菌株SL-2所產(chǎn)的乳化劑試樣用溴化鉀壓片后在400~4 000 cm-1波數(shù)下掃描[5],結(jié)果如圖2所示。該乳化物于1 065 cm-1、1 548 cm-1、1 651 cm-1、2 935 cm-1和3 314 cm-1處存在特征性吸收峰。其中,吸收峰(1 065 cm-1)是由C—O伸縮振動產(chǎn)生,吸收峰(1 548 cm-1)是由糖環(huán)上的C—O—C伸縮振動產(chǎn)生,吸收峰(1 651 cm-1)是酰胺鍵上羰基的特征吸收峰,(1 651 cm-1)是糖類C—H伸縮振動的特性吸收峰,而吸收寬峰(3314 cm-1)是由O—H的伸縮振動而形成。從菌株SL-2所產(chǎn)乳化劑的紅外光譜可發(fā)現(xiàn),該物質(zhì)中存在較多-OH和RCO-NHR基團(tuán),且上述基團(tuán)都是糖蛋白的特征官能團(tuán),因此能夠最終判斷糖類和蛋白質(zhì)都是該乳化劑的主要化學(xué)組成。

    圖2 菌株SL-2產(chǎn)生的生物乳化劑的紅外光譜分析

    2.2.4 乳化劑的氨基酸分析

    乳化劑樣品經(jīng)酸水解12 h后進(jìn)行氨基酸組成分析。其中,極性氨基酸有7種,分別是Thr、Asp、Glu、His、Ser、Arg和 Lys,約為乳化劑總量的13.74%;非極性氨基酸有10種,分別為Ile、Val、Cys、Met、Ala、Tyr、Leu、Gly、Pro 和 Phe,約為乳化劑總質(zhì)量的14.01%。

    2.2.5 乳化劑的蛋白質(zhì)分析

    由圖3可知,條帶顏色較亮的是26.0 kDa和 66.4 kDa大小蛋白質(zhì),證明乳化劑中含上述兩種大小的蛋白質(zhì)比較多,其余蛋白質(zhì)條帶顏色很淺證明含量少甚至沒有,實驗證明生物乳化劑含有的蛋白質(zhì)種類較單一,因此還需要進(jìn)一步驗證才能確定生物乳化劑中活性蛋白的成分。

    圖3 蛋白質(zhì)電泳圖

    2.3 乳化劑理化性質(zhì)分析

    2.3.1 乳化劑對不同底物的乳化作用

    本實驗選取的乳化對象分別為甲苯、二甲苯、煤油、柴油和液蠟,分別測試發(fā)酵液和上清液的乳化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液對甲苯、二甲苯、柴油和煤油的EI-24均為100%,對液蠟的乳化效果僅為76%;上清液對二甲苯和柴油的EI-24為 100%,但對甲苯、煤油和液蠟的乳化能力有所降低,其中對液蠟的EI-24只有25%。證明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑對不同的石油烴具有不同的乳化效果,同時也說明菌株本身對石油烴也有一定的乳化效果。

    2.3.2 乳化劑的稀釋特性

    與原液濃度一致時,其EI-72為100%;當(dāng)乳化劑濃度為原液濃度的1/2時,其EI-72仍大于90%;當(dāng)溶液中乳化劑的濃度為原液濃度的1/10時,其EI-72依然大于30%,優(yōu)于已報道的一些生物乳化劑的乳化效果[4-5]。說明菌株SL-2所產(chǎn)生乳化劑在極微量條件下就可以乳化石油烴,是一種高效生物乳化劑。

    2.3.3 乳化劑的酸敏性

    當(dāng)乳化劑溶液的pH值為3~9時,其EI-24均為100%;當(dāng)pH值在10~12時,乳化活性略有下降。說明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑具有較好的耐酸能力。

    2.3.4 溫度對乳化劑活性的影響

    乳狀液的破乳程度隨著放置溫度的增加而增加,在60 ℃高溫生長環(huán)境下形成的生物乳化劑特性非常穩(wěn)定,溫度低于80 ℃時,EI-24仍為100%;當(dāng)放置溫度為 95 ℃時,其EI-24仍大于40%,說明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑具有一定的耐高溫性質(zhì)。

    圖4 溫度對菌株SL-2乳化活性的影響

    3 結(jié)論

    本實驗對蒼白地芽胞桿菌SL-2所產(chǎn)的生物乳化劑進(jìn)行了分離純化及化學(xué)組分分析,發(fā)現(xiàn)該生物乳化劑由糖類、脂類和蛋白質(zhì)組成;對其所產(chǎn)生物乳化劑的理化性能進(jìn)行分析,結(jié)果顯示菌株SL-2在60 ℃高溫生長環(huán)境下形成的生物乳化劑性質(zhì)穩(wěn)定,證實了菌株SL-2是一株能夠適用于中高溫油藏的原位生物驅(qū)油菌種,并有著很重要的科研價值。但目前對該菌株生產(chǎn)生物乳化劑的機(jī)制尚不清楚,因此研究該菌株合成乳化劑的代謝途徑和調(diào)控機(jī)制將是筆者未來的研究方向與重點。

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