3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)三種水生生物的急性毒性效應(yīng)

李俊，陳蓓蓓，魏杰，廖朝選*

（1.貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽(yáng) 550002；2.貴州省分析測(cè)試研究院，貴州貴陽(yáng) 550014）

農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中至關(guān)重要，對(duì)保障作物的生長(zhǎng)與產(chǎn)量有重要作用，自2013年起，我國(guó)農(nóng)藥的登記數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)[1]。農(nóng)藥在田間施用后，其中很大一部分進(jìn)入環(huán)境，產(chǎn)生暴露風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，除草劑是登記產(chǎn)品中主要的三大類(lèi)別之一，登記量占比持續(xù)上升[2]。除草劑的大量或不當(dāng)使用，使得水環(huán)境受到不同程度的污染[3-4]。比如，除草劑莠去津會(huì)導(dǎo)致水中脊椎動(dòng)物斑馬魚(yú)胚胎畸形[5]，10%(噁)唑酰草胺乳油、20%(噁)唑·滅草松微乳劑、20%(噁)唑·氰氟乳油對(duì)斑馬魚(yú)有中等及以上的毒性作用[6]；利谷隆會(huì)影響穗狀狐尾藻的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、整株長(zhǎng)度、鮮重及干重[7]；敵草隆會(huì)抑制大型溞的活動(dòng)，同時(shí)對(duì)大型溞的初次生殖時(shí)間、總生殖胎數(shù)、體長(zhǎng)和產(chǎn)幼溞數(shù)量等生物學(xué)指標(biāo)均有不良影響[8]。

乙氧氟草醚是美國(guó)羅姆-哈斯公司開(kāi)發(fā)的含氟二苯醚類(lèi)除草劑，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、選擇性好的特點(diǎn)。主要通過(guò)破壞雜草系統(tǒng)的透性，促進(jìn)乙烯的釋放，使得植物細(xì)胞生理功能紊亂，促使葉片或幼芽衰老、萎蔫直至死亡[9]。乙氧氟草醚對(duì)半夏、甘蔗、棉花等田間雜草具有良好的防效，而且對(duì)相應(yīng)作物安全，目前已在大蒜、甘蔗、柑橘和水稻等20個(gè)作物上進(jìn)行雜草防治登記[10-13]。然而，乙氧氟草醚對(duì)水生生物具有一定的毒性，會(huì)影響大鱗副泥鰍血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活力值，同時(shí)會(huì)造成DNA損傷，高劑量下還會(huì)導(dǎo)致死亡，長(zhǎng)期大量使用可能造成水生態(tài)系統(tǒng)的破壞[14]。

評(píng)價(jià)除草劑對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)是農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要組成部分，是我國(guó)農(nóng)藥登記必須通過(guò)的環(huán)節(jié)。目前，對(duì)于乙氧氟草醚的水生生物毒性研究較少，本文選取標(biāo)準(zhǔn)模式生物斑馬魚(yú)、大型溞和羊角月牙藻，結(jié)合相關(guān)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展急性毒性研究，為乙氧氟草醚的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

JY5002電子天平，感量0.000 1 g，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SG9溶解氧測(cè)定儀，梅特勒-托利多科技（中國(guó)）有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PRX-250B智能人工氣候培養(yǎng)箱，上海比朗儀器制造有限公司；8L一體成型玻璃方缸，市售常規(guī)款式；S200藻類(lèi)計(jì)數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司。

3%乙氧氟草醚水乳劑，廣東茂名綠銀農(nóng)化有限公司；魚(yú)和溞試驗(yàn)用水使用活性炭過(guò)濾并脫氯的自來(lái)水，pH在8左右，硬度（以CaCO3計(jì)）為150 mg/L，溶解氧為空氣飽和氧（ASV）的96%；藻試驗(yàn)培養(yǎng)基，參考《農(nóng)藥登記環(huán)境試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)匯編（一）》（以下簡(jiǎn)稱《導(dǎo)則》）[15]規(guī)定方法進(jìn)行配制。

1.2 試驗(yàn)生物

斑馬魚(yú)（Brachydaniorerio），購(gòu)自上海宏業(yè)觀賞魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)，魚(yú)齡2月，全長(zhǎng)2～3 cm，體重0.11～0.14 g。

大型溞（Daphniamagna），引自武漢科樂(lè)多生物科技有限公司，引入后于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)，收集24 h內(nèi)的幼溞用于試驗(yàn)。

羊角月牙藻（Pseudokirchneriellasubcapitata），引自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，引入后于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)

參考《導(dǎo)則》[15]，將3%乙氧氟草醚水乳劑用去離子水溶解，用試驗(yàn)水稀釋制備為有效成分含量0.008 mg/L、0.014 mg/L、0.025 mg/L、0.044 mg/L 和0.080 mg/L的梯度試驗(yàn)溶液，并設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。試驗(yàn)環(huán)境條件為（24±1）℃、溶解氧＞60%ASV、pH6.0～8.5、光暗比為16 h/8 h，每日觀察并記錄試驗(yàn)魚(yú)發(fā)生毒性效應(yīng)及死亡情況，試驗(yàn)周期96 h。

1.3.2 溞類(lèi)活動(dòng)抑制試驗(yàn)

與魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)相似，將3%乙氧氟草醚水乳劑用去離子水溶解后，用試驗(yàn)水稀釋制備為有效成分含量0.024 mg/L、0.029 mg/L、0.035 mg/L、0.042 mg/L、0.050 mg/L、0.060 mg/L的五個(gè)處理濃度，并設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。添加試驗(yàn)幼溞后，于（20±1）℃、pH為6～9、溶解氧＞60%ASV、避光條件下開(kāi)展試驗(yàn)。每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)使用5只試驗(yàn)溞。在48 h內(nèi)每日觀測(cè)記錄大型溞受抑制的情況。

1.3.3 藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

參照藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)方法[15]，先對(duì)羊角月牙藻藻種進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)藻細(xì)胞數(shù)量和擬制備試驗(yàn)液濃度，用藻試驗(yàn)培養(yǎng)基將羊角月牙藻藻種稀釋至2×104個(gè)/mL的藻液備用。然后取3%乙氧氟草醚水乳劑，用上述制備的藻液稀釋為有效成分含量0.10 μg/L、0.16 μg/L、0.26 μg/L、0.41 μg/L、0.66 μg/L 和1.05 μg/L的處理組試驗(yàn)液，然后置于（23±1）℃、持續(xù)光強(qiáng)6 000 Lx的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置不添加供試農(nóng)藥的空白對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，在72 h內(nèi)每日觀察并記錄藻類(lèi)的生長(zhǎng)情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)觀察的毒性測(cè)試結(jié)果，采用Origin 2019b進(jìn)行濃度-效應(yīng)曲線擬合，采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析LC50/EC50與95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒性效應(yīng)

在魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)中，試驗(yàn)承載量為0.45 g/L，溫度23.1～24.3 ℃，pH 7.53～7.64，溶解氧83.7%～97.8%ASV，對(duì)照組試驗(yàn)魚(yú)死亡率為0%。經(jīng)3%乙氧氟草醚水乳劑暴露后，斑馬魚(yú)發(fā)生體色變黑、游動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍、頻繁換氣癥狀，嚴(yán)重者發(fā)生死亡。

溞類(lèi)活動(dòng)抑制試驗(yàn)的溫度19.3～20.6 ℃，pH 7.30～7.75，溶解氧為85.2%～97.5%ASV，滿足大型溞正常生長(zhǎng)需求，對(duì)照組溞死亡率為0%，符合試驗(yàn)要求。經(jīng)3%乙氧氟草醚水乳劑暴露后，大型溞發(fā)生游動(dòng)無(wú)力現(xiàn)象，在輕微晃動(dòng)試驗(yàn)容器下，部分大型溞15 s內(nèi)無(wú)法游動(dòng)，嚴(yán)重者發(fā)生死亡。

使用羊角月牙藻測(cè)試3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)藻類(lèi)的毒性效應(yīng)，試驗(yàn)中溫度22.4～23.5 ℃，對(duì)照組藻濃度從初始的2×104個(gè)/mL增長(zhǎng)至1.8×106個(gè)/mL。藻細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)，試驗(yàn)周期內(nèi)共計(jì)增長(zhǎng)89倍，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的增長(zhǎng)倍數(shù)≥16倍要求，試驗(yàn)條件和程序滿足羊角月牙藻正常生長(zhǎng)需要，試驗(yàn)藻類(lèi)適宜開(kāi)展毒性研究。研究表明，3%乙氧氟草醚水乳劑不會(huì)引起藻類(lèi)形態(tài)改變，但對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)量和特定生長(zhǎng)率均有顯著的影響。

2.2 50%效應(yīng)濃度與毒性等級(jí)

如圖1所示，斑馬魚(yú)和大型溞分別暴露于不同濃度的3%乙氧氟草醚水乳劑后，發(fā)生了不同程度的致死或活動(dòng)抑制效應(yīng)，其致死率或活動(dòng)抑制率與濃度具有線性相關(guān)性，隨3%乙氧氟草醚水乳劑濃度增大，死亡率或活動(dòng)抑制率增高。羊角月牙藻在0.10～1.05 mg/L的3%乙氧氟草醚水乳劑中暴露后，生長(zhǎng)量和生長(zhǎng)率受到不同程度的抑制，在不同濃度段抑制率增大幅度不同。

圖1 不同濃度3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)3種水生生物的抑制率

如表1所示，通過(guò)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析，3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)斑馬魚(yú)的96 h的半致死濃度LC50為0.072 6 mg/L，95%置信限為0.055 3～0.098 3 mg/L；對(duì)大型溞48 h的50%效應(yīng)濃度EC50為0.047 5 mg/L，95%置信限為0.043 7～0.051 7 mg/L；對(duì)羊角月牙藻生長(zhǎng)量的72 h的50%效應(yīng)濃度EyC50為0.194 mg/L，95%置信限為0.150～0.239 mg/L；對(duì)羊角月牙藻生長(zhǎng)率抑制的50%效應(yīng)濃度ErC50為0.359 mg/L，95%置信限為0.326～0.397 mg/L。

表1 3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)3種水生生物的毒性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)《導(dǎo)則》[15]要求，農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類(lèi)、溞類(lèi)、藻類(lèi)的毒性判定分別以毒性終點(diǎn)LC50（96 h）、EC50（48 h）、ErC50/EyC50（72 h）確定。（1）當(dāng)魚(yú)類(lèi)（LC50）或溞類(lèi)（EC50）的毒性終點(diǎn)＞10時(shí)，毒性為低毒；1.0＜LC50（EC50）≤10時(shí)，毒性為中毒；0.1＜LC50（EC50）≤1.0時(shí)，毒性為高毒；LC50（EC50）≤0.1時(shí)，毒性為劇毒。（2）對(duì)于藻類(lèi)的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，毒性等級(jí)分為三級(jí)。當(dāng)毒性終點(diǎn)EC50＞3.0時(shí)，毒性為低毒；0.3＜EC50≤3.0時(shí)，毒性為中毒；EC50≤0.3時(shí)，毒性為高毒。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)斑馬魚(yú)的96 h半致死濃度LC50＜0.1 mg/L，毒性等級(jí)為劇毒；對(duì)大型溞的48 h 50%活動(dòng)抑制效應(yīng)EC50＜0.1 mg/L，毒性等級(jí)為劇毒；對(duì)羊角月牙藻生長(zhǎng)量的72 h 50%抑制效應(yīng)EC50＜0.3 mg/L，毒性為高毒。

3 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)室條件下，利用靜態(tài)試驗(yàn)法測(cè)定了3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)斑馬魚(yú)、大型溞和羊角月牙藻三種不同生態(tài)位水生生物的急性毒性。試驗(yàn)中環(huán)境條件與對(duì)照組的死亡率或抑制效應(yīng)均符合相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)要求，試驗(yàn)結(jié)果可靠。通過(guò)測(cè)試分析，3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)三種水生生物均有毒性效應(yīng)，其對(duì)斑馬魚(yú)（LC50）、大型溞（EC50）、羊角月牙藻（ErC50/EyC50）的50%毒性效應(yīng)濃度分別為0.072 6 mg/L、0.047 5 mg/L、0.194/0.359 mg/ L，毒性等級(jí)分別為劇毒、劇毒、高毒。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)離不開(kāi)農(nóng)藥的使用，科學(xué)、安全地使用農(nóng)藥可減少對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞。3%乙氧氟草醚水乳劑對(duì)試驗(yàn)所選的三種水生生物都有較高的毒性，在稻-魚(yú)、稻-蝦、稻-蟹等生態(tài)漁業(yè)中應(yīng)禁止使用，以防產(chǎn)品在田水中殘留，影響漁業(yè)生產(chǎn)；產(chǎn)品包裝物在河流或湖泊等水域隨意丟棄或清洗，或施藥時(shí)漂移至水體，仍然可導(dǎo)致較高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中需要嚴(yán)格注意。此外，農(nóng)藥對(duì)環(huán)境生物的毒性僅僅是影響風(fēng)險(xiǎn)水平中的一個(gè)重要因素，它還與農(nóng)藥自身的性質(zhì)和環(huán)境中的行為特性有關(guān)，同時(shí)環(huán)境中生物種類(lèi)繁多，還需結(jié)合更多種類(lèi)生物的毒性進(jìn)行全面的評(píng)估。