索拉非尼/超支化聚(酰胺-胺)載藥體系的構(gòu)建及其體外藥物釋放動(dòng)力學(xué)研究

何桂金，李順，戚軼昕

（浙江大學(xué) 化學(xué)系，浙江杭州 310058）

面對(duì)某些惡性腫瘤的臨床治療效果不理想的問(wèn)題，通過(guò)篩選新型藥物組合方案、采用有針對(duì)性的納米藥物載體等手段，可以為惡性腫瘤治療提供新策略，提升臨床療效[1]。索拉非尼是一種分子靶向藥物，可用于肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤的治療，主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)[2]。腫瘤單藥靶向治療的效果可通過(guò)構(gòu)建適當(dāng)?shù)募{米藥物載體來(lái)增加藥物在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性與有效循環(huán)時(shí)間，提高內(nèi)部的藥物投遞效率，從而有效增強(qiáng)藥物的治療效果。

超支化聚酰胺-胺（PAMAM）是一類分子內(nèi)部富含酰胺鍵和胺鍵、端基為胺基的超支化聚合物，結(jié)構(gòu)如圖1所示[3]。特殊的結(jié)構(gòu)賦予了其優(yōu)良的水溶性與生物相容性，獨(dú)特的單分子膠束也可以起到藥物增溶的效果[4]。因此，PAMAM是理想的藥物載體，通過(guò)適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，可以有效增進(jìn)所搭載藥物的治療效果；基于PAMAM的藥物載體可以促進(jìn)藥物靶向投遞，增強(qiáng)腫瘤區(qū)域藥物濃度，增強(qiáng)治療效果，減輕藥物副作用[5]。

圖1 超支化聚合物PAMAM的結(jié)構(gòu)示意圖

藥物釋放效果是載藥體系的重要考評(píng)指標(biāo)之一，高效液相色譜法（HPLC）利用高壓泵對(duì)流動(dòng)相施加高壓，可有效提高物質(zhì)的分離與分析的效率，具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。因此，HPLC配合在線檢測(cè)的方式，可快速獲取靶向載藥體系的載藥量與體外釋放過(guò)程的相關(guān)參數(shù)，對(duì)靶向載藥體系的深入研究有積極意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AVANCE Ⅲ 400型核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；Nicholet iS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；PL-GPC-50凝膠滲透色譜儀，美國(guó)Waters公司；Nano ZS納米粒度電位分析儀，美國(guó)Malvern公司；LC 1100高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Luna 5u C8（2）100A（250 mm×4.6 mm, 5 μm），美國(guó)Phenomenex公司。

乙二胺、甲醇、丙烯酸甲酯、乙醚、三氯甲烷，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；索拉非尼（SRF），98.0%，上海麥克林生化科技有限公司；用于高效液相色譜的甲醇、三氟乙酸、十二烷基硫酸鈉，色譜純，Sigma-Aldrich試劑有限公司；磷酸緩沖溶液（PBS）7.4，阿拉丁試劑（上海）有限公司；透析袋，截留分子量3 000 Da，杭州辰通生化科技有限公司。

1.2 PAMAM的合成

乙二胺溶于甲醇后轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，攪拌條件下滴加丙烯酸甲酯（控制乙二胺與丙烯酸的摩爾比分別為1∶3、1∶2和1∶1，所得產(chǎn)物分別命名為PAMAM-1、PAMAM-2、PAMAM-3），室溫下攪拌48 h后停止反應(yīng)，在減壓條件下分別于60 ℃、80 ℃蒸餾1 h；100 ℃、120 ℃蒸餾1.5 h；140 ℃蒸餾3 h?？s合反應(yīng)最后得到黏稠的黃色液體，顏色隨著相對(duì)分子質(zhì)量的提高由橘黃色變成黃綠色。

黏稠的黃色液體粗產(chǎn)物趁熱用50 mL甲醇稀釋，冷卻至室溫后傾入300 mL乙醚中攪拌0.5 h，靜置分層后分去上層乙醚，再分別用100 mL乙醚洗滌兩遍，將黃色產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至適合容器中，于40 ℃下真空干燥6 h得到黃色透明黏稠液體。

1.3 載藥體系SRF@PAMAM的構(gòu)建

PAMAM與SRF分別配制成水溶液和三氯甲烷溶液，混合后高速磁力攪拌1 h，旋蒸除去三氯甲烷；水相部分經(jīng)抽濾除去不溶物后，轉(zhuǎn)移至透析袋中充分透析3天以除去游離的SRF及雜質(zhì)。充分凍干后即可獲得SRF@PAMAM的體系。

1.4 HPLC條件

流動(dòng)相為甲醇-水（含0.05%三氟乙酸和0.14%十二烷基硫酸鈉），體積比為75∶25；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.5 SRF標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取SRF溶于甲醇中，進(jìn)一步稀釋為0.625 μg/mL、1.250 μg/mL、2.500 μg/mL、5.000 μg/mL 和10.000 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在1.4條件下，SRF保留時(shí)間為8.84 min。測(cè)定上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 SRF@PAMAM包封率的計(jì)算

以PAMAM-3作為包封SRF的模板。準(zhǔn)確稱取SRF，溶于三氯甲烷，另取PAMAM-3溶于超純水。充分?jǐn)嚢杌旌希謱雍笕∪燃淄閷?0 μL用甲醇按需要倍數(shù)稀釋，進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)稀釋倍數(shù)推算搭載后三氯甲烷相中的SRF含量C1（mg/mL），從而獲得未包埋的SRF含量，包封率計(jì)算公式如（1）所示：

其中，Rload為包封率；m0為準(zhǔn)確稱取的SRF質(zhì)量，mg；C1為搭載后三氯甲烷相中的SRF含量，mg/mL；V0為三氯甲烷的體積，mL。

1.7 藥物釋放曲線

將SRF@PAMAM-3加入到5 mL含40%乙醇的PBS中并轉(zhuǎn)移到透析袋中，在50 mL含40%乙醇的PBS中透析，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣5 mL，同時(shí)補(bǔ)上5 mL含40%乙醇的PBS。檢測(cè)樣品中SRF的濃度，作SRF釋放曲線。藥物釋放率計(jì)算公式如（2）所示：

其中，Rrelease為釋放率；C’SRF為釋放出來(lái)SRF的濃度，mg/mL；mSRF為載藥體系中SRF的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAMAM的結(jié)構(gòu)表征

PAMAM的核磁共振氫譜如圖2所示，各類氫的特征峰歸屬如下：δ=1.5～ 2.5，CO-CH2；δ=2.5～ 3.0，COCH2CH2NH、NH(CH2)2NH、NH(CH2)2；δ=3.2 ～ 3.5，NCH2；δ=3.5～ 4.0，CH3O。

圖2 PAMAM的核磁共振氫譜

圖3為PAMAM的紅外譜圖。其中，伯胺N-H的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在3 388 cm-1處，而其對(duì)稱伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在3 266 cm-1處；仲酰胺基的N-H的彎曲振動(dòng)峰出現(xiàn)在3 099 cm-1，2 941 cm-1與2 843 cm-1處為飽和碳?xì)涞纳炜s振動(dòng)峰，1 725 cm-1處是典型的酯羰基C=O的特征峰，而1 555 cm-1處可歸屬為C-N的伸縮振動(dòng)峰。

圖3 PAMAM的紅外譜圖

2.2 投料比對(duì)PAMAM的影響

表1的數(shù)據(jù)表明，投料比可用來(lái)控制合成的PAMAM的相對(duì)分子質(zhì)量，隨著丙烯酸投料量的減少，所得聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量從5 300增加到26 800。此外，在乙二胺和丙烯酸甲酯的Michael加成反應(yīng)中，一個(gè)乙二胺分子只與一個(gè)丙烯酸甲酯分子配對(duì)反應(yīng)，因此1∶1的比例更有利于原料利用的最大化，有利于提高聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量。通過(guò)DLS技術(shù)測(cè)出的PAMAM平均粒徑的大小與其相對(duì)分子質(zhì)量密切相關(guān)，其最大平均粒徑可達(dá)11.25 nm。

表1 PAMAM的相對(duì)分子質(zhì)量及相關(guān)物理性質(zhì)參數(shù)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及PAMAM-3對(duì)SRF包封率

整理峰面積（A）與濃度（C）數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)線性擬合得到索拉非尼標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖4。標(biāo)準(zhǔn)方程為A=40.065C-8.484，R2=0.999 7。線性范圍 2.052～104.370 μg/mL。經(jīng)過(guò)計(jì)算，PAMAM-3對(duì)SRF的包封率達(dá)42.3%。

圖4 索拉非尼的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 藥物釋放曲線

SRF@PAMAM-3的藥物釋放動(dòng)力學(xué)曲線如圖5所示。可以發(fā)現(xiàn)，SRF@PAMAM-3在40%乙醇的磷酸緩沖液中的釋放過(guò)程表現(xiàn)出先快后慢的趨勢(shì)：在0～12 h內(nèi)，其釋放率上升較快；隨著釋放時(shí)間的進(jìn)一步增加，釋放率逐步趨于穩(wěn)定。其釋放率與時(shí)間的關(guān)系可通過(guò)公式（3）來(lái)表示：

圖5 SRF@PAMAM-3的藥物釋放過(guò)程及動(dòng)力學(xué)擬合

其中，R為SRF@PAMAM-3體系不同時(shí)間內(nèi)的釋放率，t為釋放的時(shí)間。

該動(dòng)力學(xué)模型與藥物釋放動(dòng)力學(xué)研究中提出的Gompertz曲線相一致[6]。該模型描述的藥物釋放曲線在一開(kāi)始急劇增加，然后緩慢收斂至最大藥物釋放量，即藥物總量。從測(cè)試得到的釋放曲線可看出，一開(kāi)始藥物的釋放較為迅速，可快速起效形成有效濃度；隨后通過(guò)擴(kuò)散控制緩慢釋放到溶液中，直至最大溶出度。

3 結(jié)論

本文開(kāi)發(fā)了SRF@PAMAM的載藥新體系，利用HPLC法研究了抗癌藥物索拉非尼在PAMAM載藥體系中的體外釋放過(guò)程，可準(zhǔn)確、高效地獲得其動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)未來(lái)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的靶向藥物緩釋體系有一定參考價(jià)值。