Cariporide對癲癇模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

馬鵬飛，彭爽，謝懂君，吳旭玲，鄭乾，馮占輝

癲癇是臨床常見的慢性疾病[1]。全世界約有9 000萬癲癇患者，其中30%屬于難治性癲癇，而在我國每年新增患者約為45萬[2-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，癲癇患者死亡率約為正常人群的2倍[4]。有研究顯示，約88%的癲癇患者在癲癇發(fā)作中死亡[5]。因此早期干預(yù)及減少癲癇猝死是臨床面臨的主要問題。有研究顯示心律失常與癲癇發(fā)作密切相關(guān)。顳葉癲癇發(fā)作會導(dǎo)致以交感神經(jīng)或者副交感神經(jīng)過度活躍為主的自主神經(jīng)功能障礙[6]。

Cariporide是鈉氫交換體 1(sodium hydrogen exchanger,NHE-1)的抑制劑，具有抗心律失常作用[7-8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可以降低再灌注時室速和室顫的發(fā)生率以及大鼠的死亡率[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NHE-1在癲癇模型鼠心臟表達(dá)增高，考慮該蛋白與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[10]。為此，本文探討Cariporide是否能夠通過下調(diào)NHE-1來減少癲癇模型大鼠心肌組織凋亡情況，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)備及試劑

匹羅卡品和氯化鋰(美國Sigma公司)，地西泮注射液(成都倍特公司)，NHE-1抗體(美國Abcam公司)，β-actin抗體(上海鈺博生物科技有限公司)，Cariporide(碧云天生物技術(shù)有限公司)，山羊抗兔二抗(中杉金橋)，RNAisoPlus 和 PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TakeraBio公司)，顯色劑(ECL，美國 Pierce公司)，PM20自動顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2 模型制作

建立癲癇大鼠模型[8]，腹腔注射氯化鋰，劑量為127 mg/kg，20 h后腹腔注射硫酸阿托品，劑量為1 mg/kg，30 min后腹腔注射匹羅卡品，劑量為50 mg/kg，用藥后觀察大鼠行為學(xué)改變，以Racine分級作為標(biāo)準(zhǔn)。RacineⅣ級及以上發(fā)作持續(xù)1 h后，應(yīng)用地西泮終止癲癇發(fā)作，劑量為10 mg/kg。

1.3 實驗動物及分組

選取Sprague Dawley(SD)雄性大鼠共45只，隨機(jī)分為模型組30只及對照組15只，模型組中隨機(jī)選取15只作為干預(yù)組。干預(yù)組采用Cariporide(1 mg/kg)每天一次灌胃，連續(xù)用藥4周。對照組及模型組采用等量生理鹽水注射。在自發(fā)性癲癇發(fā)作開始后第60天麻醉處死大鼠后取心肌組織，應(yīng)用蛋白印跡和RT-PCR檢測 NHE-1的表達(dá)，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.4 Western blot 方法

第60天取模型組和對照組大鼠各6只，應(yīng)用10%水合氯醛，劑量為300 mg/kg，麻醉后斷頭處死，快速分離心肌組織，置于液氮中快速冷凍，然后儲存于-80 ℃冰箱中。取心肌組織提取蛋白(按試劑盒要求)，檢測蛋白濃度，提取50 μg蛋白進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)到于8%SDS-PAGE上電泳，電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上；室溫5%BSA孵育聚偏二氟乙烯膜1.5 h，加入兔抗大鼠NHE-1(1∶4 000)和β-actin(1∶1 000)孵育聚偏二氟乙烯膜4 ℃過夜；第2天室溫下孵育NHE-1膜，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h。加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯色試劑對蛋白條帶進(jìn)行顯影。用QuantityOne 4.6.2軟件分析NHE-1的相對含量，β-actin作為內(nèi)參[9]。

1.5 RT-PCR 檢測方法

第60天取模型組和對照組大鼠各6只，采用RT-PCR方法檢測大鼠心肌NHE-1mRNA的表達(dá)。按試劑盒說明書，提取總RNA，應(yīng)用分光光度法測定RNA濃度和純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。由TakaraBio設(shè)計合成RT-PCR引物。選擇GAPDH為管家基因：F-引物5′-CCCCCAAT GTATCCGTTGTG-3′和R-引物5′-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′；大鼠NHE-1基因：F-引物5′-GCGGCGAGCAGATCAATAA-3′和R-引物5′-ACAGTGACGGCATCGTTGAG-3′[8]。

1.6 流式細(xì)胞檢測

取1 g心肌組織濾紙拭干，加生理鹽水進(jìn)行2次洗滌，然后將心肌組織剪碎，大小約1～3 mm3；進(jìn)一步加入0.25 g/100 mL的胰蛋白酶5 mL進(jìn)行消化，然后采用恒溫水浴，再用尼龍網(wǎng)過濾，進(jìn)一步以800 r/min離心；丟棄上清液，70%乙醇中固定，將上清液丟棄，用冰生理鹽水漂洗2次，保證細(xì)胞數(shù)在1×106個/mL，加入碘化丙啶染液1.0 mL，置于4 ℃恒溫箱中30 min，最后檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 模型的制作

30只SD大鼠用于制作模型鼠，制作模型過程中死亡7只(模型組死亡3只，干預(yù)組死亡4只)，死亡率為23%。

2.2 Western-blot檢測

第60天模型組大鼠心肌細(xì)胞NHE-1蛋白表達(dá)較對照組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組NHE-1蛋白表達(dá)較模型組降低(P<0.05)。詳見圖1。

注：模型組和干預(yù)組與對照組比較，*P<0.05;干預(yù)組與模型組比較，*P<0.05。圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞NHE-1的Western-blot檢測結(jié)果

2.3 RT-PCR檢測

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞NHE-1 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組大鼠NHE-1 mRNA表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)。詳見圖2。

2.4 流式細(xì)胞檢測

經(jīng)流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較模型組降低(P<0.05)。詳見圖 3。

注：模型組和干預(yù)組與對照組比較，*P<0.05;干預(yù)組與模型組比較，*P<0.05。圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測結(jié)果

3 討論

癲癇是大腦皮層神經(jīng)元同步過度放電所導(dǎo)致的一類疾病，臨床以反復(fù)抽搐為主要表現(xiàn)。在發(fā)作過程中患者可出現(xiàn)癲癇猝死，有研究顯示，心源性猝死是癲癇猝死的重要原因，然而導(dǎo)致癲癇猝死的機(jī)制目前尚不清楚[4-5]，為進(jìn)一步探討慢性癲癇患者心肌細(xì)胞是否出現(xiàn)異常，課題組前期制作慢性癲癇鼠模型，分析慢性癲癇模型鼠第60天時心肌細(xì)胞的凋亡情況，明確 NHE-1 的表達(dá)特點以及細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞在第60天時凋亡明顯[10]。本研究進(jìn)一步采用NHE-1抑制劑Cariporide處理模型大鼠，結(jié)果顯示干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞 NHE-1蛋白和mRNA 表達(dá)均下降，同時也發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡率較模型組明顯降低。

基于上述研究結(jié)果，課題組認(rèn)為在癲癇反復(fù)發(fā)作的情況下，心臟也不斷受到影響，有研究報道心臟會出現(xiàn)心律失常[11]。而這種心律失常可能與NHE-1調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)。而心肌細(xì)胞可能會在癲癇發(fā)作反復(fù)出現(xiàn)的情況下，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi) Ca2+信號通路功能過強(qiáng)的問題，從而加劇心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12-13]。抑制NHE-1的功能有助于減少心肌細(xì)胞的損害。NHE-1 屬于膜蛋白，在心肌組織中表達(dá)廣泛[14]。其主要功能是穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)心肌細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)時，會促使NHE-1的功能增強(qiáng)，心肌細(xì)胞NHE-1被激活，將H+排出，Na+攝入進(jìn)來，以此恢復(fù)心肌細(xì)胞生理pH值[15]。

凋亡是細(xì)胞應(yīng)對外界環(huán)境改變的一個緩慢調(diào)節(jié)過程[16]。如果心肌細(xì)胞過度凋亡，必然會導(dǎo)致心肌調(diào)節(jié)功能的障礙，患者在某一次癲癇發(fā)作過程中，心肌有可能因為收縮功能障礙而出現(xiàn)停搏[17]。因此能否通過抑制NHE-1達(dá)到減少凋亡的發(fā)生也是一個重要的問題。既往有研究顯示，NHE-1抑制劑可以減少心肌細(xì)胞凋亡，可能與線粒體滲透性轉(zhuǎn)換有關(guān)，本研究結(jié)果與Javadov等[18]的研究結(jié)果一致。

結(jié)合課題組前期的研究結(jié)果，有理由認(rèn)為癲癇的反復(fù)發(fā)作會誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，這個過程是個慢性病程，但是一旦癲癇持續(xù)狀態(tài)出現(xiàn)，心肌細(xì)胞的收縮功能可能出現(xiàn)嚴(yán)重問題，并可出現(xiàn)心律失常[19]。心肌細(xì)胞的凋亡可能在心律失常的發(fā)生中起到重要作用，例如在心臟停搏、房顫及室顫中的發(fā)生[20-21]。

綜上所述，本研究認(rèn)為慢性癲癇患者在不斷的癲癇發(fā)作中，可能會出現(xiàn)心律失常，同時心肌細(xì)胞慢性凋亡增加，早期下調(diào)NHE-1的表達(dá)有助于減少心肌細(xì)胞的凋亡，減少癲癇猝死的可能。