懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁模型的保護(hù)作用及機(jī)制研究

盧仁睿，張 莉, 2，徐瑞豪，王慧慧，馮衛(wèi)生, 2，鄭曉珂, 2

懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁模型的保護(hù)作用及機(jī)制研究

盧仁睿1，張 莉1, 2，徐瑞豪1，王慧慧1，馮衛(wèi)生1, 2*，鄭曉珂1, 2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046

通過皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的小鼠抑郁癥模型和腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞損傷模型，研究懷菊花提取物的抗抑郁作用。將雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、氟西汀（5 mg/kg）組和懷菊花提取物低、中、高劑量（1.67、3.33、6.67 g/kg）組，模型組和各給藥組連續(xù)21 d sc皮質(zhì)酮（20 mg/kg），造模同時(shí)ig相應(yīng)藥物，給藥結(jié)束后進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中皮質(zhì)酮及神經(jīng)遞質(zhì)水平；采用Western blotting檢測(cè)海馬組織中環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic adenosine monophosphate-response element binding protein，CREB）通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)。皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)懷菊花提取物對(duì)細(xì)胞凋亡及活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影響；采用In-Cell Western法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白及CREB通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)。懷菊花提取物能夠顯著改善小鼠的糖水偏好率（＜0.05、0.01），增加小鼠的站立次數(shù)（＜0.05、0.01），減少小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間（＜0.01），顯著降低血清中皮質(zhì)酮水平（＜0.01），升高血清中5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、多巴胺（dopamine，DA）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）水平（＜0.05、0.01），上調(diào)海馬組織中CREB、磷酸化CREB（phosphorylated CREB，p-CREB）、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。懷菊花提取物顯著抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞內(nèi)ROS水平（＜0.01），抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（＜0.01），上調(diào)CREB通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)（＜0.01）。懷菊花提取物可能通過調(diào)節(jié)CREB通路、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善抑郁。

懷菊花；皮質(zhì)酮；抑郁；環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白；凋亡

抑郁癥臨床表現(xiàn)為顯著而持久的心情低落、思維遲鈍、認(rèn)知功能損害、意志活動(dòng)減弱等[1]。在世界范圍內(nèi)，抑郁癥已成為患者負(fù)擔(dān)最嚴(yán)重的疾病之一[2]。目前臨床抗抑郁藥物以化學(xué)藥為主，其優(yōu)勢(shì)在于起效較快、療效確切，不足在于不良反應(yīng)較大，患者對(duì)藥物存在依賴性，復(fù)發(fā)率較高，而中藥的藥效穩(wěn)定且不良反應(yīng)少，安全性高[3-4]。因此從中藥中發(fā)掘潛在的抗抑郁藥物具有重要意義。菊花是藥食同源的典型植物，具有較好的醫(yī)療保健功效，在我國(guó)的文字記載中已經(jīng)有4000年的歷史[5]。Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，菊花提取物能夠減輕慢性不可預(yù)知的溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）誘導(dǎo)的小鼠模型中的抑郁樣行為，同時(shí)對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic pituitary adrenal，HPA）軸的過度活躍和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)有抑制作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，懷菊花有較好的抗菌、降壓、抗氧化等作用[7]。本課題組在對(duì)河南產(chǎn)中藥進(jìn)行抗抑郁活性篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)懷菊花具有較好的抗抑郁作用，因此本研究采用體內(nèi)外抑郁模型，研究懷菊花的抗抑郁作用以及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于18～22 ℃清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，空氣流通，12 h光照，晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DWLL2018080003）。

1.2 細(xì)胞

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3 藥材

懷菊花采購于焦作武陟，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定為菊科植物菊Ramat.的干燥頭狀花序。

1.4 藥品與試劑

皮質(zhì)酮（批號(hào)16063）購自Cayman Chemical；鹽酸氟西汀分散片（批號(hào)7298A）購自法國(guó)Patheon France；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)1213C0215）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210915）購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠皮質(zhì)酮、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）試劑盒（批號(hào)E20181001A）購自江蘇卡爾文生物技術(shù)有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體、Caspase-9抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）抗體、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）抗體、磷酸化CREB（phosphorylated CREB，p-CREB）抗體、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體、β-actin抗體購自英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab13847、ab202068、ab32503、ab59348、ab48394、ab56416、ab31387、ab32096、ab26322；羊抗兔二抗（批號(hào)C80911-11）、羊抗鼠二抗（批號(hào)C80816-10）購自美國(guó)LI-COR公司；AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)0020694）購自美國(guó)BD公司；對(duì)照品金合歡素（批號(hào)C12O8Q45551）、綠原酸（批號(hào)Y24J7K16726）、柚皮素（批號(hào)X21M7C11378）、芹菜素（批號(hào)Y27A6C1）、香葉木素（批號(hào)T22F7X9844）、木犀草苷（批號(hào)Y05D8H49919）、木犀草素（批號(hào)YA0408YA13）購自上海源葉生物制品有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)MUST-12042403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自成都曼斯特生物科技有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.5 儀器

BioMate 3S型分光光度計(jì)、Forma 3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；HVA-85型全自動(dòng)高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB204-N型萬分之一精密分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Arium 611VF型超純水儀（德國(guó)Sartorius公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ECLIPSE TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；微量加樣器（德國(guó)Eppendorf公司）；iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BD FACSAria III流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Odyssey CLx雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司）；TMV-100S型行為學(xué)實(shí)驗(yàn)站（成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

2.1 懷菊花提取物的制備及成分分析

2.1.1 懷菊花提取物的制備 稱取懷菊花1 kg，加入10倍量水，煎煮3次，每次1 h，紗布濾過，合并濾液，減壓濃縮干燥，稱定質(zhì)量，計(jì)算提取率為28.0 %。取懷菊花水提物4.5 mg于錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水，超聲提取30 min，1200 r/min離心10 min，取上清液于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)行UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芹菜素、柚皮素、香葉木素、金合歡素、木犀草苷、咖啡酸、綠原酸、木犀草素對(duì)照品適量，至10 mL量瓶中，加蒸餾水定容，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述各對(duì)照品溶液1 mL，加蒸餾水定容至10 mL，得到混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件 RSLC 120 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，5%～12% B；3～7 min，12%～15% B；7～12 min，15%～20% B；12～20 min，20% B；20～30 min，20%～95% B。柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)，掃描范圍/50～1000；離子源能量為3.0 eV；碰撞能量為5.0 eV；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；去溶劑氣為N2；去溶劑氣體積流量為8.0 L/min；脫溶劑氣溫度為230 ℃。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物模型的建立、分組及給藥 C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)體質(zhì)量均衡原則隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、氟西?。? mg/kg）組和懷菊花提取物低、中、高劑量（1.67、3.33、6.67 g/kg）組，每組8只。模型組和各給藥組sc皮質(zhì)酮（20 mg/kg），對(duì)照組sc等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)21 d[8]。造模同時(shí)，各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），1次/d，連續(xù)21 d。

2.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

（1）糖水偏好實(shí)驗(yàn)：末次給藥結(jié)束后，小鼠單籠飼養(yǎng)，并放入2瓶含1%蔗糖的水溶液，24 h后將其中1瓶換成純水，12 h后調(diào)換2個(gè)水瓶位置，再飼養(yǎng)12 h，適應(yīng)期結(jié)束后，將小鼠禁食禁水24 h，之后進(jìn)行基線測(cè)試。在鼠籠上放置已稱定質(zhì)量的2個(gè)瓶子，分別為含1%蔗糖的水溶液與純水，小鼠禁食12 h后，取下瓶子，記錄2個(gè)瓶子的液體消耗量，計(jì)算糖水偏好率[9]。

糖水偏好率＝糖水消耗量/(糖水消耗量＋純水消耗量)

（2）懸尾實(shí)驗(yàn)：在小鼠尾部三分之一處固定，懸掛于支架上，使小鼠頭部距離臺(tái)面15 cm，適應(yīng)1 min后記錄小鼠5 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間[9]。

（3）自主活動(dòng)測(cè)定：將小鼠放到自主活動(dòng)箱中，蓋上閉光板，適應(yīng)2 min后，記錄5 min內(nèi)小鼠的站立次數(shù)和活動(dòng)次數(shù)[9]。

2.2.3 血清CORT、5-HT、DA、Ach和NE水平的測(cè)定 行為學(xué)測(cè)試完畢后，小鼠摘眼球取血，離心后取血清，按試劑盒說明書測(cè)定CORT、5-HT、DA、Ach和NE水平。

2.2.4 Western blotting檢測(cè)海馬組織CREB通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取各組小鼠海馬組織，加入裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于封閉液中封閉2 h，分別加入CREB、p-CREB、cAMP、BDNF和β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌5次，每次6 min，加入熒光二抗（1∶10 000），避光孵育1 h；TBST洗滌5次，使用雙色紅外激光成像系統(tǒng)700 nm和800 nm雙通道進(jìn)行檢測(cè)和分析[9]。

2.3 體外實(shí)驗(yàn)

2.3.1 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 PC-12細(xì)胞用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，以4×104/mL接種于96孔板，每孔200 μL，待細(xì)胞完全貼壁后培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組和懷菊花提取物（1、10、50、100、500 μg/mL）組，對(duì)照組加入含1%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，模型組和各給藥組加入皮質(zhì)酮（500 μmol/L），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（）值[10]。

2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 PC-12細(xì)胞以8×104/mL接種于6孔板，每孔3 mL，待細(xì)胞完全貼壁后培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、氟西?。?.3 μmol/L）組和懷菊花提取物（100 μg/mL）組，對(duì)照組加入含1%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，模型組和各給藥組加入皮質(zhì)酮（500 μmol/L），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，加入1×Loading Buffer重懸細(xì)胞，再用PI和FITC進(jìn)行染色，避光15 min后，上機(jī)檢測(cè)[10]。

2.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS水平 按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，處理24 h后，棄去上清液，用PBS清洗后，裝載探針，用培養(yǎng)液洗去多余探針，胰酶消化后，收集細(xì)胞，重懸，上機(jī)檢測(cè)[11]。

2.3.4 In-Cell Western法檢測(cè)凋亡通路和CREB通路相關(guān)蛋白表達(dá) 按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，處理24 h后，收集細(xì)胞，依次進(jìn)行固定、透化，于5%脫脂牛奶中封閉1.5 h，分別加入一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜；PBST洗滌5次，5 min/次，加入二抗，孵育1 h；PBST洗滌4次，PBS洗滌1次后顯影，使用雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)和分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 懷菊花提取物的成分分析

如圖1所示，懷菊花提取物中含有芹菜素、柚皮素、香葉木素、金合歡素、木犀草苷、咖啡酸、綠原酸和木犀草素。

1-綠原酸 2-咖啡酸 3-木犀草苷 4-木犀草素 5-柚皮素 6-芹菜素 7-香葉木素 8-金合歡素

3.2 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠行為學(xué)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠糖水偏好率顯著降低（＜0.01），懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間顯著增加（＜0.01），自主活動(dòng)數(shù)和站立次數(shù)顯著減少（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間顯著減少（＜0.01），站立次數(shù)顯著增加（＜0.05、0.01）；氟西汀組和懷菊花提取物低、中劑量組小鼠糖水偏好率顯著升高（＜0.05、0.01）；懷菊花提取物低劑量組小鼠自主活動(dòng)數(shù)顯著增加（＜0.05）。

3.3 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠血清中皮質(zhì)酮水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中皮質(zhì)酮水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組和懷菊花提取物低、中劑量組小鼠血清中皮質(zhì)酮水平均顯著降低（＜0.01）。

3.4 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中5-HT、DA、Ach和NE水平均顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中5-HT水平顯著升高（＜0.05、0.01），氟西汀組和懷菊花提取物低劑量組DA水平顯著升高（＜0.05、0.01），氟西汀組和懷菊花提取物低、中劑量組Ach水平顯著升高（＜0.05、0.01），懷菊花提取物中劑量組NE水平顯著升高（＜0.05）。

C-對(duì)照組 M-模型組 F-氟西汀組 JH-懷菊花提取物 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

圖3 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠血清中皮質(zhì)酮水平的影響(, n = 8)

3.5 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠臟器指數(shù)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)顯著下降（＜0.05），其他臟器指數(shù)無明顯變化；與模型組比較，各給藥組小鼠臟器指數(shù)均沒有明顯變化。

圖4 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響(, n = 8)

圖5 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠臟器指數(shù)的影響(, n = 8)

3.6 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠海馬組織CREB通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬組織中CREB、p-CREB、cAMP和BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，懷菊花提取物低、中劑量組小鼠海馬組織中CREB和cAMP蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），懷菊花提取物低劑量組小鼠海馬組織中p-CREB蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），氟西汀組小鼠海馬組織中上述蛋白表達(dá)均無明顯變化。

圖6 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁小鼠海馬組織CREB通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.7 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞存活率的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞存活率均顯著升高（＜0.01），懷菊花提取物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)效果最佳。

圖7 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞存活率的影響(, n = 6)

3.8 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組活細(xì)胞數(shù)顯著降低（＜0.01），凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組活細(xì)胞數(shù)顯著升高（＜0.01），凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.9 懷菊花對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖9所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低（＜0.01）。

3.10 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

如圖10所示，與對(duì)照組比較，模型組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），Bax/Bcl-2值顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），Bax/Bcl-2值顯著降低（＜0.01），懷菊花提取物組Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

圖8 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡的影響(, n = 3)

圖9 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(, n = 3)

圖10 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.11 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞CREB通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

如圖11所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞CREB、p-CREB、cAMP和BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組CREB、p-CREB、cAMP和BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖11 懷菊花提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞CREB通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，人們的精神壓力越來越大，抑郁癥患者數(shù)量逐年上升。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，2017年全世界有超過3.22億抑郁癥患者，而且這個(gè)數(shù)字一直在增加[12]。中醫(yī)雖無抑郁癥病名，但根據(jù)抑郁癥臨床表現(xiàn)在古籍中找到臟躁、梅核氣、奔豚氣、郁證、百合病等相關(guān)病名[13]。目前對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)及其受體假說、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說、神經(jīng)免疫假說、神經(jīng)可塑性假說、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路系統(tǒng)異常假說和神經(jīng)-內(nèi)分泌假說。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的發(fā)生與糖皮質(zhì)激素有密切關(guān)系，當(dāng)機(jī)體處于長(zhǎng)期應(yīng)激狀態(tài)，HPA系統(tǒng)持續(xù)亢奮，會(huì)產(chǎn)生大量的糖皮質(zhì)激素，通過血腦屏障入腦，易與海馬組織中神經(jīng)元的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合產(chǎn)生神經(jīng)毒性，造成海馬萎縮[9]，而海馬參與情緒的控制和反應(yīng)，對(duì)情緒反應(yīng)起非特異性抑制作用。當(dāng)皮質(zhì)酮升高時(shí)可誘使抑郁的發(fā)生，因此本研究采用糖皮質(zhì)激素——皮質(zhì)酮誘導(dǎo)抑郁癥模型，行為學(xué)結(jié)果顯示，模型組小鼠糖水消耗量減少，懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，自主活動(dòng)數(shù)減少，表明小鼠快感缺乏，即造模成功；懷菊花提取物能夠不同程度地改善小鼠的抑郁行為。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說是目前公認(rèn)的抑郁癥發(fā)病機(jī)制之一，5-HT、NE和DA在情緒、認(rèn)知、學(xué)習(xí)、運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、警覺、獎(jiǎng)勵(lì)、睡眠和食欲等方面發(fā)揮著重要作用[14]，它們?cè)谀X內(nèi)分泌的減少將會(huì)影響神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而產(chǎn)生抑郁情緒。因此，增加腦內(nèi)突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)水平是緩解抑郁癥的途徑之一[15]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腦內(nèi)和血清中5-HT、NE和DA水平均降低[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組血清中神經(jīng)遞質(zhì)水平均降低，懷菊花提取物可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平來緩解抑郁癥。

cAMP/CREB/BDNF信號(hào)通路在抑郁癥中起著關(guān)鍵作用，且與增強(qiáng)認(rèn)知有關(guān)[17]。cAMP作為第二信使與其下游CREB結(jié)合，CREB是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元及BDNF表達(dá)[17]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說認(rèn)為抑郁的發(fā)生與BDNF表達(dá)減少有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，海馬組織BDNF信號(hào)受損可致抑郁，給予抗抑郁藥物治療后，海馬組織BDNF表達(dá)升高[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組海馬組織中CREB、p-CREB、cAMP、BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著降低，懷菊花提取物組以上蛋白的表達(dá)均顯著升高，表明懷菊花能夠通過調(diào)節(jié)cAMP/CREB/BDNF信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用。此外，持續(xù)地激活HPA軸，會(huì)造成機(jī)體穩(wěn)態(tài)失衡，由此改變神經(jīng)生化物質(zhì)，導(dǎo)致大腦發(fā)生器質(zhì)性的變化[9]。抑郁癥、ROS與神經(jīng)細(xì)胞凋亡之間聯(lián)系密切[19]。因此，采用流式細(xì)胞術(shù)和In-Cell Western技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡和凋亡蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，懷菊花提取物能夠抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)酮能夠影響小鼠胸腺組織，表明抑郁的發(fā)生與免疫系統(tǒng)有一定的聯(lián)系，推測(cè)懷菊花能夠在一定程度上調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)。

綜合，懷菊花在體內(nèi)外均能夠有效緩解抑郁模型的相關(guān)指標(biāo)，提示其可能是抗抑郁的潛在藥物，懷菊花提取物可能通過調(diào)節(jié)CREB通路、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善抑郁。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect and mechanism of Huaiextract on corticosterone-induced depression model

LU Ren-rui1, ZHANG Li1, 2, XU Rui-hao1, WANG Hui-hui1, FENG Wei-sheng1, 2, ZHENG Xiao-ke1, 2

1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Engineering Technology Research Center for Chinese Medicine Development, Zhengzhou 450046, China

To study antidepressant effect of Huai Juhua () extract on corticosterone-induced mouse depression model and adrenal pheochromocytoma PC-12 cell injury model.Male C57BL/6 mice were randomly divided into control group, model group, fluoxetine (5 mg/kg) group and Huaiextract low-, medium-and high-dose (1.67, 3.33, 6.67 g/kg) groups. Model group and each administration group were sc corticosterone (20 mg/kg) for 21 consecutive days, and corresponding drugs were given at the same time during modeling. After administration, sugar water preference experiment, tail suspension experiment and open field experiment were performed; Corticosterone and neurotransmitter levels in serum of mice were detected by kits; Western blotting was used to detect the expression of key proteins in cyclic adenosine monophosphate-response element binding protein (CREB) pathway in hippocampus. Corticosterone induced PC-12 cells was used to establish a cell injury model, flow cytometry was used to detect the effect of Huaiextract on cell apoptosis and reactive oxygen species (ROS) levels; In-Cell Western method was used to detect apoptosis-related protein and CREB pathway key protein expressions.Huaiextract significantly improved the sugar water preference rate of mice (< 0.05, 0.01), increased the number of standing times (< 0.05, 0.01), reduced the immobility time of mice in tail suspension test (< 0.01), significantly decreased corticosterone level in serum (< 0.01), increased levels of 5-hydroxytryptamine (5-HT), norepinephrine (NE), dopamine (DA) and acetylcholine (Ach) in serum (< 0.05, 0.01), up-regulated the protein expression levels of CREB, phosphorylated CREB (p-CREB) and cyclic adenosine monophosphate (cAMP) in hippocampus (< 0.05, 0.01). Huaiextract significantly inhibited corticosterone-induced PC-12 cells apoptosis and intracellular ROS level (< 0.01), inhibited the expression of apoptosis-related proteins (< 0.01), and up-regulated the expression of key proteins in CREB pathway (< 0.01).Huaiextract may improve depression by regulating CREB pathway and inhibiting neuronal apoptosis.

Huai; corticosterone; depression; cyclic adenosine monophosphate-response element binding protein; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)18 - 5750 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.018

2022-07-08

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1702800）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題（20-21ZY2148）；河南省重大科技專項(xiàng)（171100310500）；河南省高層次人才特殊支持“中原千人計(jì)劃”項(xiàng)目（ZYQR201810080）；河南省教育廳河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（212102311106）；河南中醫(yī)藥大學(xué)2018年度博士科研基金資助項(xiàng)目（BSJJ2018-04）

盧仁睿（1998—），女，在讀碩士研究生，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。E-mail: 13203703171@163.com

馮衛(wèi)生，男，教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。E-mail: fwsh@hactcm.edu.cn

鄭曉珂，女，教授，從事中藥活性及其作用機(jī)制研究。Tel: (0371)60190296 E-mail: zhengxk.2006@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]