基于全基因組測(cè)序的黃水芽胞桿菌Bacillus aquiflavi 3H-10安全性評(píng)價(jià)

程坤，劉蕊，孫思佳，翟磊，鄭佳，姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644000)

安全性是微生物菌種應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的重要前提，抗生素耐藥性、產(chǎn)毒與致病性是評(píng)價(jià)菌種安全性的重要方面。2002年，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)發(fā)布的適用于食品用益生菌的評(píng)估指南要求：對(duì)于食品用益生菌，應(yīng)考慮菌種在抗生素耐藥性、特定代謝活性物質(zhì)、人體副作用、有害事件的流行病監(jiān)測(cè)以及毒素產(chǎn)生等方面的安全性；任何給定的益生菌在抗生素耐藥性轉(zhuǎn)移、機(jī)會(huì)性毒力方面不應(yīng)存在重大風(fēng)險(xiǎn)[1]。歐盟“安全資格認(rèn)證(Qualified Presumption of Safety，QPS)”評(píng)價(jià)程序[2]和美國“一般認(rèn)為安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)”認(rèn)證[3]同樣強(qiáng)調(diào)了針對(duì)微生物菌種應(yīng)開展抗生素耐藥性、產(chǎn)毒與致病性分析，以評(píng)估其安全性。隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷更迭，人們對(duì)菌種安全性的理解也在不斷發(fā)生變化和趨于完善。2020年益生菌的科學(xué)共識(shí)中指出，對(duì)于新屬種的益生菌菌株，應(yīng)通過全基因組測(cè)序生物信息分析闡述評(píng)估其所攜帶的耐藥基因、致病基因等特征[4]?；诨驕y(cè)序技術(shù)的生物信息學(xué)分析能夠篩查菌種中與抗生素耐藥、毒力和致病性等相關(guān)的基因，挖掘菌種潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)的遺傳機(jī)制，為評(píng)價(jià)微生物菌種的安全性提供一種便捷手段。

目前，芽胞桿菌屬(Bacillus)內(nèi)已有多個(gè)物種被列入歐盟QPS名單[5]和國際乳品聯(lián)合會(huì)IDF 495—2018《發(fā)酵食品用微生物菌種調(diào)查及安全性聲稱》公報(bào)[6]，被證明是安全的。在我國，尚無芽胞桿菌物種被列入《可用于食品的菌種名單》，但該屬內(nèi)多個(gè)物種曾被報(bào)道用于我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中[7]，芽胞桿菌新菌種在使用前需進(jìn)行全面的安全性評(píng)價(jià)。黃水芽胞桿菌Bacillusaquiflavi3H-10是從我國四川省宜賓地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵濃香型白酒黃水樣品中分離的1株新種菌株[8]，可產(chǎn)生蛋白酶以及苯甲醛、2,5-二甲基吡嗪、己酸乙酯等多種風(fēng)味物質(zhì)(暫未發(fā)表)，在白酒發(fā)酵實(shí)際生產(chǎn)中具有應(yīng)用潛力。本文通過測(cè)定黃水芽胞桿菌3H-10的基因組完成圖序列，針對(duì)抗生素耐藥性、產(chǎn)毒與致病性開展相關(guān)安全性基因分析，并結(jié)合抗生素敏感性試驗(yàn)和小鼠毒力試驗(yàn)，對(duì)黃水芽胞桿菌3H-10的安全性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

本研究所用菌種黃水芽胞桿菌3H-10(=CICC 24755T)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，前期由本實(shí)驗(yàn)室分離自我國四川省宜賓地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵濃香型白酒的黃水樣品[8]；所用培養(yǎng)基為大豆酪蛋白TSB培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂TSA培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器與設(shè)備

隔水式培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；Eppendorf微量可調(diào)移液器、5424R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；HG-50高壓滅菌鍋，日本 HIRAYAMA公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡Esco公司；BioDrop核酸蛋白分析儀，豪沃生物科技(上海)有限公司；Qubit 3.0核酸熒光定量儀，美國ThermoFisher Scientific公司；Hiseq2500基因測(cè)序儀，美國Illumina公司；PacBio Sequel基因測(cè)序儀，美國PacBio公司。

1.1.3 試劑

TSA瓊脂，美國BD公司；溴代十六烷基三四胺(cetyl trimethyl ammonicum bromide，CTAB)、Tris-飽和酚，美國Sigma公司；氯仿，北京市通廣精細(xì)化工公司；異戊醇，西隴化工股份有限公司；異丙醇，北京化工廠；λDNA/Hind Ⅲ分子量標(biāo)記、Qubit dsDNA HS Assay Kit試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司；GoldView、瓊脂糖，北京全式金生物技術(shù)有限公司；抗生素E-test藥敏紙片，法國生物梅里埃公司；SPF級(jí)ICR小鼠(許可證編號(hào)SCXK(京)2016-0006)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株DNA提取及質(zhì)檢

取TSB于37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)3 d的菌懸液，8 000 r/min離心收集約1 g濕菌體至1.5 mL離心管中，加入600 μL CTAB裂解液，65 ℃水浴45 min，13 000 r/min離心10 min；取上清液于一新離心管中，加入等體積的V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，充分混勻，12 000 r/min離心10 min；取上清液，加等體積的V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1，充分混勻，12 000 r/min離心10 min；取上清液，加等體積的預(yù)冷異丙醇試劑，-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min離心20 min；收集沉淀，75%乙醇沖洗，室溫放置使DNA干燥；使用100 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用Qubit 3.0核酸熒光定量儀測(cè)定DNA樣本濃度；使用BioDrop核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA樣品的A260/A280和A260/A230值，判斷DNA純度。

1.2.2 DNA測(cè)序、數(shù)據(jù)質(zhì)控與組裝

采用Illumina Hiseq 2500基因測(cè)序儀和Pacbio Sequel基因測(cè)序儀分別進(jìn)行小片斷和大片斷文庫測(cè)序。對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行如下質(zhì)控過濾：去除質(zhì)量值連續(xù)≤20的堿基數(shù)達(dá)到40%的reads、去除含N堿基比例≥10%的reads、去除接頭和重復(fù)污染。采用proovread v2.12軟件對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)，并采用Falcon v0.3.0和GATK v6-13軟件分別進(jìn)行序列組裝和單堿基糾錯(cuò)，得到高質(zhì)量的基因組完成圖。

1.2.3 基因預(yù)測(cè)與注釋

采用Glimmer v3.02軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)基因序列與COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)基因的注釋信息。

1.2.4 耐藥基因檢測(cè)

通過與Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)[9]和ResFinder[10]數(shù)據(jù)庫比對(duì)，檢測(cè)菌株基因組中的潛在耐藥基因。通過RGI軟件將預(yù)測(cè)基因的氨基酸序列與CARD數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，以“perfect”和“strict”算法輸出結(jié)果作為耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果；與ResFinder數(shù)據(jù)庫比對(duì)時(shí)，設(shè)置序列相似性≥90%，序列覆蓋度≥60%。

1.2.5 毒力基因檢測(cè)

通過與Virulence Factors of Pathogenic Bacteria (VFDB)[11]和VirulenceFinder[12]數(shù)據(jù)庫比對(duì)，檢測(cè)菌株基因組中的潛在毒力基因。與VFDB數(shù)據(jù)庫比對(duì)時(shí)，使用的軟件為diamond，E值≤e-5，序列相似性≥70%，序列覆蓋度≥70%；與VirulenceFinder數(shù)據(jù)庫比對(duì)時(shí)，設(shè)置序列相似性≥90%，序列覆蓋度≥60%。

1.2.6 抗生素敏感性測(cè)定

使用生理鹽水制備并調(diào)整菌懸液至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋褂脽o菌拭子沾取菌懸液并均勻涂布于CAMHB固體平板上，待瓊脂表面干燥后，使用無菌鑷子取抗生素E-test試劑條置于平板表面，37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察結(jié)果。橢圓形抑菌環(huán)與E-test試條的交界點(diǎn)藥物濃度即為最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI M45—2016《Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria:approved guideline》[13]共選取10種、9類常見抗生素用于藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。菌種耐藥性的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照歐盟指南《Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms》[14]與CLSI M45—2016[13]。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌CICC 10473T(=ATCC 29213T)。

1.2.7 小鼠毒力試驗(yàn)

將菌種轉(zhuǎn)接于TSB培養(yǎng)基中，置于37 ℃，好氧培養(yǎng)72 h至計(jì)數(shù)約108CFU/mL，作為培養(yǎng)物原液備用。取部分培養(yǎng)物原液濃縮5倍，作為培養(yǎng)物5倍濃縮液備用。選用SPF級(jí)ICR小鼠80只，雌雄各半，在北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司動(dòng)物房[許可證編號(hào)為SYXK(京)2017-0022]飼養(yǎng)。雄性小鼠體重16.0～25.0 g，雌性小鼠體重16.0～25.0 g。ICR小鼠80只，雌雄各半，分別隨機(jī)分為4組，每組10只。劑量組設(shè)置為：培養(yǎng)基原液對(duì)照組，培養(yǎng)物原液組，培養(yǎng)基5倍濃縮對(duì)照組，培養(yǎng)物5倍濃縮組。將受試物以20.0 mL/kg BW劑量給小鼠連續(xù)灌胃3 d，觀察7 d，記錄實(shí)驗(yàn)過程中小鼠的體重變化、中毒表現(xiàn)及死亡情況。使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，培養(yǎng)物組與對(duì)照組間定量資料的比較用兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水芽胞桿菌3H-10全基因組概況

通過Illumina和PacBio平臺(tái)分別測(cè)序獲得569×和788×原始下機(jī)數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控過濾與拼接，獲得菌株3H-10的基因組信息。其基因組為一條共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA(圖1-a)，大小3 806 094 bp，G+C含量為35.66%(摩爾百分含量)。基因組中共預(yù)測(cè)到4 031個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、81個(gè)tRNA基因、各9個(gè)5S/16S/23S rRNA基因、16個(gè)sRNA基因。通過與多個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，最終注釋基因3 324個(gè)。黃水芽胞桿菌3H-10的基因組大小與G+C含量符合芽胞桿菌屬物種基因組的一般特征[15]。與近緣物種基因組相比，黃水芽胞桿菌3H-10在基因組大小和G+C含量等方面與WeizamanniaginsengihumiGsoil 114T較相似(表1)。

a-菌株3H-10基因組圈圖，從外到內(nèi)8圈依次代基因組大小、預(yù)測(cè)基因、正鏈基因、負(fù)鏈基因、tRNA、rRNA、sRNA、GC含量和GC偏移； b-菌株3H-10預(yù)測(cè)基因COG功能分類圖1 黃水芽胞桿菌3H-10的基因組完成圖與預(yù)測(cè)基因COG功能分類Fig.1 Circos plot for the complete genome of B.aquiflavi 3H-10 and the COG function classification of the predicted genes

對(duì)黃水芽胞桿菌3H-10基因功能進(jìn)行分析，利用COG進(jìn)行基因注釋與功能分類，共注釋基因2 385個(gè)(59.16%)，可分為24個(gè)功能組(圖1-b)，其中預(yù)測(cè)為一般功能基因分組最多。黃水芽胞桿菌3H-10基因組中涉及氨基酸運(yùn)輸與代謝，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成，轉(zhuǎn)錄、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與翻譯、脂轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換等的注釋基因數(shù)相對(duì)較多，在150～250。通過與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株3H-10中存在較完整的氨基酸、脂類、碳水化合物、輔因子與維生素的代謝途徑，并包含對(duì)芳香族、萜類和聚酮等化合物的降解途徑，推測(cè)菌株3H-10具有產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，這可能與白酒釀造中豐富的風(fēng)味物質(zhì)形成相關(guān)。

表1 黃水芽胞桿菌3H-10及其近緣物種基因組的基本特征Table 1 Basic information of the assembled genomes of B.aquiflavi 3H-10 and closely relatives

2.2 耐藥性分析

2.2.1 耐藥基因分析

抗生素依據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可歸為多種類別，包括常見的氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、葉酸途徑拮抗劑、磷霉素類、糖肽類、林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基咪唑類、多粘菌素類、假單胞菌酸類、利福霉素、鏈陽霉素類、四環(huán)素類、苯丙醇類和磺胺類等。目前，針對(duì)常見抗生素已有大量抗生素耐藥基因被報(bào)道(表2)，并收錄到相關(guān)耐藥基因數(shù)據(jù)庫中。CARD和ResFinder數(shù)據(jù)庫是關(guān)于耐藥基因及其產(chǎn)物和相關(guān)表現(xiàn)型的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，涵蓋了當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的多數(shù)抗生素耐藥基因[9-10]。通過將黃水芽胞桿菌3H-10的基因組序列與這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)，均未檢測(cè)到上述耐藥基因(表2)。

青海將建立健全住房公積金管理部門及人社、財(cái)政、工商、稅務(wù)、工會(huì)等部門聯(lián)合監(jiān)管機(jī)制，對(duì)本行政區(qū)域內(nèi)單位不繳存住房公積金或不為職工設(shè)立公積金賬戶、少繳、欠繳等行為，按照《住房公積金管理?xiàng)l例》規(guī)定給予行政處罰或申請(qǐng)人民法院強(qiáng)制執(zhí)行。

表2 常見抗生素、耐藥基因及黃水芽胞桿菌3H-10在耐藥基因數(shù)據(jù)庫的比對(duì)結(jié)果Table 2 Common antibiotics, antimicrobial resistance genes and the analysis result of the genome of B.aquiflavi 3H-10 against related antimicrobial resistance databases

2020年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)顯示，臨床分離菌株對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率呈現(xiàn)增長趨勢(shì)。芽胞桿菌在自然界中廣泛分布，其生存環(huán)境包括土壤、水、食物及臨床等。該屬中常見的耐藥基因包括氨基糖苷類耐藥基因ant(4′)-Ib、aph(3′)-III和aph(3′)-IV，氯霉素耐藥基因cat86和fexA，紅霉素耐藥基因ermD、ermK和erm34，四環(huán)素耐藥基因tetK、tetL、tetM、tetW和tet42、桿菌肽耐藥基因bacA和bcrA等[18-19]。通過基于序列比對(duì)的靶向分析，在黃水芽胞桿菌3H-10基因組中未檢測(cè)到這些基因。

2.2.2 抗生素敏感性測(cè)定

檢測(cè)結(jié)果顯示，菌株黃水芽胞桿菌3H-10對(duì)所選全部抗生素，即青霉素、美羅培南、萬古霉素、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、氯霉素、利福平，均敏感(表3)。實(shí)驗(yàn)所用9類、10種抗生素依據(jù)CLSI M45—2016[13]選取，基本覆蓋世界衛(wèi)生組織所發(fā)布《對(duì)人類醫(yī)學(xué)至關(guān)重要的抗微生物藥物》中重要抗生素大類，其中頭孢菌素類(第三代、四代和五代)、糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類和酮內(nèi)酯類、多粘菌素類、喹諾酮類被列為最高優(yōu)先至關(guān)重要抗微生物藥物[20]。芽胞桿菌目前未被列入世界衛(wèi)生組織[21]和我國CHINET對(duì)細(xì)菌耐藥性監(jiān)控的微生物之列；有研究報(bào)道，部分芽胞桿菌對(duì)鏈霉素、克林霉素、氯霉素、卡那霉素、紅霉素、四環(huán)素具有耐藥性[18-19]?？股孛舾行栽囼?yàn)顯示，菌株3H-10對(duì)常見重要抗生素?zé)o耐藥性，這與該菌株基因組中未檢測(cè)到相關(guān)耐藥基因的結(jié)果一致。綜合耐藥基因型與表型結(jié)果可見，黃水芽胞桿菌3H-10自身無橫向傳播耐藥性或耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 黃水芽胞桿菌3H-10對(duì)常見抗生素的敏感性檢測(cè)結(jié)果Table 3 Antimicrobial susceptibility test result of B.aquiflavi 3H-10 to common antibiotics

2.3 毒力分析分析

2.3.1 毒力基因分析

毒力是菌種安全性評(píng)價(jià)的重要方面。細(xì)菌的毒力因子主要可分為4大類：與宿主黏附和入侵相關(guān)、細(xì)菌分泌系統(tǒng)和效應(yīng)物、毒素以及鐵離子系統(tǒng)[11]。VFDB和VirulenceFinder數(shù)據(jù)庫收錄了當(dāng)前已報(bào)道的大量細(xì)菌毒力因子基因序列[11-12]，被國內(nèi)外與菌種安全評(píng)價(jià)相關(guān)的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和指南所推薦。通過將黃水芽胞桿菌3H-10的基因組序列與這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，未檢測(cè)到上述毒力基因(表4)。

表4 黃水芽胞桿菌3H-10基因組中毒力基因的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection of virulence genes in the genome of B.aquiflavi 3H-10

在芽胞桿菌中，蠟樣芽胞桿菌常被報(bào)道攜帶毒力基因，包括與嘔吐毒素相關(guān)的非核糖體多肽合成酶系(NRPS)基因、與腹瀉毒素相關(guān)的溶血素BL基因、非溶血性的腸毒素Nhe基因(nheA、nheB、nheC)、腸毒素FM基因(entFM)、腸毒素T基因(bceT)和細(xì)胞毒素K基因(cytK)[22-23]。通過基于序列比對(duì)的靶向分析，在3H-10基因組中未檢測(cè)到這些毒力基因。

小鼠毒力試驗(yàn)是目前檢測(cè)菌株是否存在安全風(fēng)險(xiǎn)最直接、有效的生理學(xué)證據(jù)，在我國食品、保健食品、飼料等領(lǐng)域微生物安全性評(píng)價(jià)中占有重要地位。我國《保健食品原料用菌種安全性檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》(2020年版)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品用菌種安全性評(píng)價(jià)程序(征求意見稿)》、《TCSWSL 016—2019 水產(chǎn)動(dòng)物飼用乳酸菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》、《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)TCSWSL 017—2019 水產(chǎn)動(dòng)物飼用芽孢桿菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》等均要求針對(duì)菌種開展小鼠毒力試驗(yàn)。本文利用菌株黃水芽胞桿菌3H-10培養(yǎng)原液和5倍濃縮液對(duì)SPF級(jí)ICR小鼠進(jìn)行灌喂，觀察菌種對(duì)小鼠體重、毒性反應(yīng)的影響。表5和表6分別顯示3H-10培養(yǎng)物對(duì)雄、雌小鼠體重的影響，可見雄、雌性小鼠的初始體重和終體重在培養(yǎng)物組與其相應(yīng)對(duì)照組間比較均無顯著性差異(P>0.05)，即在試驗(yàn)期間菌株3H-10培養(yǎng)物對(duì)雄、雌性小鼠的體重?zé)o影響。

表5 黃水芽胞桿菌3H-10培養(yǎng)物對(duì)雄性小鼠體重的影響Table 5 Effect of B.aquiflavi 3H-10 culture to weight of male mice

表6 黃水芽胞桿菌3H-10培養(yǎng)物對(duì)雌性小鼠體重的影響Table 6 Effect of B.aquaflavi 3H-10 culture to weight of female mice

表7為菌株3H-10培養(yǎng)物對(duì)小鼠急性毒性的影響。結(jié)果顯示，將菌株3H-10培養(yǎng)物原液和5倍濃縮液，以20.0 mL/kg BW的劑量給小鼠連續(xù)灌胃3 d，觀察7 d，未觀察到受試小鼠有毒性反應(yīng)或死亡。結(jié)合毒力基因與小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果可見，菌株3H-10自身無毒力或致病性風(fēng)險(xiǎn)。

表7 黃水芽胞桿菌3H-10培養(yǎng)物對(duì)小鼠急性毒性作用Table 7 Acute toxicity effect of B.aquiflavi 3H-10 culture to mice

3 結(jié)論

近年來，高通量測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，基因組測(cè)序逐漸成為微生物鑒定、分型溯源和功能挖掘等分析中的常規(guī)手段，也使得從基因?qū)用嬖u(píng)估菌種的安全性、解析風(fēng)險(xiǎn)因素的遺傳機(jī)制成為可能。目前，國內(nèi)外已有多個(gè)關(guān)于抗生素耐藥基因、毒力與致病基因的數(shù)據(jù)庫。其中，CARD是關(guān)于耐藥基因及其產(chǎn)物和相關(guān)表現(xiàn)型的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，于2013年由加拿大McMaster大學(xué)開發(fā)[9]。目前包含263種病原菌，14 795個(gè)WGS拼接序列，175 753條等位序列，覆蓋與28類、336種抗生素相關(guān)的3 014條耐藥基因序列。ResFinder數(shù)據(jù)庫于2012年由丹麥技術(shù)大學(xué)開發(fā)與維護(hù)，目前包括與27類、127種抗生素相關(guān)的2 817條耐藥序列[10]。VFDB數(shù)據(jù)庫由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)于2005年建立，目前包括74種病原菌屬、951株細(xì)菌、1 284種毒力因子、32 827條毒力相關(guān)基因序列[11]。VirulenceFinder由丹麥技術(shù)大學(xué)開發(fā)，覆蓋4種常見致病菌(李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和腸球菌)中與7種主要毒力因子相關(guān)的502種毒力基因[12]。這些與安全性相關(guān)數(shù)據(jù)庫為篩查菌種全基因組序列中的耐藥、毒力與致病性等風(fēng)險(xiǎn)基因提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，具有重要應(yīng)用價(jià)值。SULTHANA等[24]對(duì)枯草芽胞桿菌BacillussubtilisUBBS-14進(jìn)行全基因組測(cè)序和基因安全性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)該菌株不攜帶任何含抗生素耐藥性基因的質(zhì)粒，不包含任何推定的有害毒力因子編碼基因，從而在基因組水平上證實(shí)了該菌株作為益生菌的安全性。SAROJ等[25]對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌BacilluscoagulansLBSC (DSM 17654)進(jìn)行全基因組測(cè)序，并對(duì)耐藥基因、產(chǎn)生物胺、毒力因子基因等安全相關(guān)基因開展分析，從分子水平上證明該菌株的安全性?；虬踩苑治鍪蔷N安全性評(píng)價(jià)的重要方面，與抗生素敏感性、小鼠毒力試驗(yàn)等傳統(tǒng)分析方法有機(jī)結(jié)合、互為補(bǔ)充，可實(shí)現(xiàn)對(duì)工業(yè)用菌種全面而系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)。

本研究對(duì)分離自我國四川省宜賓地區(qū)的黃水芽胞桿菌3H-10進(jìn)行全基因組測(cè)序，并開展基于基因型與表型的抗生素耐藥性、毒力與致病性分析，全面評(píng)價(jià)菌種的安全性。黃水芽胞桿菌3H-10基因組中不含有耐藥基因，對(duì)常見抗生素敏感；基因組中無毒力相關(guān)基因，受試小鼠不產(chǎn)生毒性反應(yīng)或死亡反應(yīng)。因此推測(cè)，菌株3H-10無橫向轉(zhuǎn)移耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)，無毒力或人體致病性。黃水芽胞桿菌3H-10分離自我國傳統(tǒng)發(fā)酵濃香型白酒黃水樣品，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的產(chǎn)蛋白酶活性，并可產(chǎn)生多種次級(jí)代謝風(fēng)味物質(zhì)，在濃香型白酒發(fā)酵中具有一定應(yīng)用潛力。本研究對(duì)黃水芽胞桿菌3H-10在抗生素耐藥性、毒力與致病性方面的安全性評(píng)估，為該菌株在濃香型白酒發(fā)酵中的實(shí)際應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。