鼠李糖乳桿菌B6抗氧化活性和細(xì)胞保護作用研究

李瑞盈，張怡琳，游春蘋*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海，200436)

氧化應(yīng)激被定義為活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成以及抗氧化防御活性氧之間的嚴(yán)重失衡，導(dǎo)致生物分子的過度氧化損傷[1]。氧化應(yīng)激是衰老和年齡相關(guān)疾病的基本原因之一[2-4]。多項研究表明，乳酸菌、雙歧桿菌等具有良好的抗氧化能力，能夠使抗氧化酶活性得以提高，并對氧化應(yīng)激起到調(diào)節(jié)和緩解的作用。因此，具有抗氧化潛力的乳酸菌可作為食品發(fā)酵的功能性發(fā)酵劑，有望在功能食品領(lǐng)域發(fā)揮作用，給宿主帶來健康益處[5-7]。

對于乳酸菌的抗氧化特性已經(jīng)有很多學(xué)者進行過研究，李喚宇[8]利用植物乳桿菌Y44干預(yù)偶氮二異丁脒鹽酸鹽造成氧化損傷的人腸上皮細(xì)胞Caco-2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Y44不僅調(diào)控了一系列抗氧化酶的表達，還可激活Nrf2-Keap1-ARE信號通路，使Caco-2細(xì)胞的抗氧化活性顯著增強。HOU等[9]研究發(fā)現(xiàn)植入乳桿菌L.plantarumJ26對H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞超氧化物歧化酶活性的降低和谷胱甘肽過氧化物酶活性的升高具有顯著的保護作用。NEMETH等[10]以H2O2處理的Caco-2細(xì)胞作為模型系統(tǒng)，研究炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌L.plantarum2142濃縮培養(yǎng)上清液對H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激存在保護作用。

益生性乳酸菌通過“腦-腸-微生物軸”改善精神健康的作用已經(jīng)得到越來越多研究的證實[11]，但少有利用益生菌代謝產(chǎn)物對于H2O2造成神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷保護作用的研究。PC12細(xì)胞作為大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤分化的細(xì)胞株，不僅具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，且可傳代易培養(yǎng)，在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)出聚集成團和有纖維狀突起等生長特征，類似于神經(jīng)元，因此經(jīng)常被作為神經(jīng)生理和藥理研究的細(xì)胞模型。此外，有學(xué)者研究了植物提取物對PC12細(xì)胞氧化損傷的保護作用，CHU等[12]發(fā)現(xiàn)美洲罌粟花提取物能夠減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性，緩解氧化受損細(xì)胞的氧化應(yīng)激，維持細(xì)胞內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)。CLEMENTI等[13]發(fā)現(xiàn)紅褐藻素通過調(diào)節(jié)ROS水平降低H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性和凋亡。OLATUNJI等[14]研究發(fā)現(xiàn)枸杞中的反式-N-咖啡酰胺通過減輕氧化應(yīng)激，提高過氧化氫酶、SOD活力和還原型谷胱甘肽)的含量，抑制ROS生成和Ca2+內(nèi)流。益生菌代謝產(chǎn)物用于對氧化損傷PC12細(xì)胞保護作用的研究還非常少，因此，有必要建立一套保護神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷的益生菌篩選和評價方法。

本文就結(jié)合了體外化學(xué)方法和細(xì)胞層面的分析，首先對實驗室保藏的4株乳桿菌發(fā)酵過程中不同組分的DPPH自由基、·OH、·O2-清除能力做了比較研究，篩選出綜合抗氧化能力較全面的鼠李糖乳桿菌B6，并在PC12細(xì)胞氧化損傷模型中，對丙二醛(malondialdehyde，MDA)和ROS的含量進行檢測，從化學(xué)檢測到細(xì)胞層面對菌株的抗氧化能力進行綜合分析，旨在為開發(fā)利用該菌株保護神經(jīng)細(xì)胞抗氧化用途提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：鼠李糖乳桿菌B6 (Lactobacillusrhamnosus，CGMCC 13310)，鼠李糖乳桿菌KF7 (Lactobacillusrhamnosus, CGMCC 6430)，副干酪乳桿菌BD5115 (Lactobacillusparacasei, CGMCC 20045)，干酪乳桿菌LC2W(Lactobacilluscasei, CGMCC 0828)，光明乳業(yè)研究院菌種保藏庫；鼠李糖乳桿菌LGG (LactobacillusrhamnosusGG，ATCC 53103)，ATCC菌種保藏中心。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞PC12(GE0414)，江蘇建諾為生物技術(shù)有限公司。

脫脂乳粉，新西蘭恒天然公司；MRS肉湯培養(yǎng)基，德國Merck公司；DPPH、無水乙醇、鄰二氮菲、FeSO4、Tris-HCl、鄰苯三酚，生工生物工程(上海)股份有限公司；3% H2O2，Sigma試劑公司；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)液，HyClone公司；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、抗生素(青霉素-鏈霉素)，賽默飛世爾科技公司；Cell Counting-Kit-8(CCK8試劑盒)，美國Gibco公司；MDA含量檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒，碧云天試劑有限公司。

培養(yǎng)基：10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)脫脂乳培養(yǎng)基(115 ℃、滅菌15 min)；MRS培養(yǎng)基(121 ℃、滅菌15 min)；DMEM完全培養(yǎng)基由94% DMEM培養(yǎng)液，5%的胎牛血清，1%抗生素(青霉素-鏈霉素)組成。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，三洋電機株式會社；WNB45L4恒溫水浴鍋，美墨尓特(上海)貿(mào)易有限公司；Spectra M5型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；A35厭氧生化培養(yǎng)箱，英國Don Whitley Scientific公司；SCIENTZ-IID超聲細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；5424R高速離心機，德國Eppendorf公司；Olympus IX71倒置顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；HERAce11240CO2型恒溫培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的培養(yǎng)及發(fā)酵上清液，菌體的制備

發(fā)酵上清液制備：將MRS固體培養(yǎng)基上活化得到的單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基或脫脂乳培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18～24 h，將上述菌液按照3%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的接種量接種到MRS培養(yǎng)基或脫脂乳培養(yǎng)基中繼續(xù)活化18～24 h，8 000 r/min 4 ℃離心15 min得到發(fā)酵上清液。

活化菌體：收集MRS發(fā)酵菌液離心得到的菌體，用PBS(pH 7.4)洗滌(10 000 r/min 4 ℃離心8 min)3次，4 ℃保存?zhèn)溆?菌體濃度為2.0×108CFU/mL)；

熱滅活菌體：用PBS(pH 7.4)洗滌菌體，將菌體重懸后置于恒溫水浴鍋中滅活(98 ℃, 1 h)，PBS清洗沉淀3次(10 000 r/min 4 ℃，8 min)[15]；

1.3.2 清除DPPH自由基實驗

參考MARYAM等[16]的方法并略作修改，DPPH用無水乙醇溶解并配制為終濃度0.4 mmol/L，現(xiàn)用現(xiàn)配，待測液和DPPH乙醇溶液各取2 mL混合均勻，室溫下避光反應(yīng)(30 min)后，8 000 r/min室溫離心10 min，測定上清液在517 nm處的吸光度，測3組平行。DPPH自由基清除率按公式(1)計算：

(1)

式中：Ai，實驗組吸光度值；A0，對照組(2 mL 無菌水+2 mL DPPH乙醇溶液)吸光度值；Aj,空白組(2 mL 待測液+2 mL 無水乙醇)吸光度值。

1.3.3 清除·OH實驗

參考YANG等[17]的方法并略作修改。實驗組As：試管中分別依次加入PBS(1 mL，0.05 mmol/L pH 7.4)，鄰二氮菲(0.5 mL，6 mmol/L)、FeSO4溶液(0.5 mL，6 mmol/L)和H2O2溶液(0.5 mL，0.1%)，充分混合均勻后再加入0.5 mL樣品；對照組Ac：用0.5 mL 蒸餾水取代0.5 mL樣品；空白組Ab：用1 mL 蒸餾水取代樣品和H2O2溶液；將混合液在37 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h，利用酶標(biāo)儀測定其在536 nm處的吸光值?！H清除率按公式(2)計算：

(2)

1.3.4 清除·O2-實驗

參考李穎等[18]的方法并略作修改。A樣：依次加入3 mL 50 mmol/L的Tris-HCl，1 mL樣品，1 mL 1.2 mmol/L的鄰苯三酚；A空：將實驗組中樣品用蒸餾水代替；充分混勻各體系后，反應(yīng)25 min(室溫或25 ℃水浴)，利用酶標(biāo)儀測定325 nm處的吸光值?！2-清除率按公式(3)計算：

(3)

1.3.5 B6對PC12 細(xì)胞抗氧化功能的影響實驗

1.3.5.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)

將PC12細(xì)胞復(fù)蘇后，加入DMEM完全培養(yǎng)基(5%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素混合液)，并培養(yǎng)在37 ℃，含有5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔1 d換1次液，2 d傳1次代，實驗所選用的PC12細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.3.5.2 H2O2誘導(dǎo)氧化損傷PC12 細(xì)胞模型的建立

PC12細(xì)胞以3.0×104個/mL的密度接種于96孔板，在培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液為無血清DMEM培養(yǎng)基(99% DMEM培養(yǎng)液，1%青霉素-鏈霉素混合液，下同)再培養(yǎng)20 h；設(shè)置空白對照組(無H2O2)和H2O2終濃度分別為400、500、600、700、800 μmol/L的5個濃度梯度組，每組設(shè)6個復(fù)孔，作用20 h后，按照1.3.5.4中的CCK8法測定PC12細(xì)胞的存活率，并將細(xì)胞存活率最接近50%的H2O2濃度作為最適的造模濃度。

1.3.5.3 實驗細(xì)胞分組

以3.0×104個/mL的密度將PC12細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓20 h，之后對其進行實驗分組?？瞻讓φ战M：添加無血清DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h；空白脫脂乳組：添加未發(fā)酵脫脂乳含量為15%的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，預(yù)處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)20 h；模型組：添加無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為500 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)20 h；低濃度實驗組：添加鼠李糖乳桿菌B6代謝產(chǎn)物含量為5%的無血清DMEM培養(yǎng)基，預(yù)處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)20 h；中濃度實驗組：添加鼠李糖乳桿菌B6代謝產(chǎn)物含量為10%的無血清DMEM培養(yǎng)基，預(yù)處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)20 h；高濃度實驗組：添加鼠李糖乳桿菌B6代謝產(chǎn)物含量為15%的無血清DMEM培養(yǎng)基，預(yù)處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)20 h；陽性對照組：配制終濃度為200 μmol/L的維生素C溶液作為陽性對照，預(yù)處理4 h后，加入H2O2(終濃度500 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.3.5.4 CCK8法測定細(xì)胞存活率

根據(jù)李盡文等[19]的方法，將PC12細(xì)胞以3.0×104個/mL的密度接種于96孔板中，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，之后所有組更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，除空白對照組和模型組外，實驗組更換為鼠李糖乳桿菌B6代謝產(chǎn)物含量分別為5%、10%、15%的溶液，進行預(yù)處理(4 h)；除對照組外，模型組和實驗組加入終濃度為500 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)20 h。孵育結(jié)束后，分別在各組的前3個孔中加入10 μL的CCK8溶液，避光孵育2～4 h后，通過酶標(biāo)儀測定450和650 nm時各孔的吸光度。細(xì)胞存活率按公式(4)計算：

(4)

式中：A，實驗組的吸光度值(A450-A650)；A0，對照組的吸光度值(A450-A650)。

1.3.5.5 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將PC12以3×104個/mL的密度接種到6孔板，按照1.3.5.4進行實驗分組處理后，在倒置顯微鏡(×20)下觀察不同組的細(xì)胞生長狀態(tài)并拍照記錄。

1.3.5.6 MDA和ROS含量測定

采用試劑盒測定，按照說明操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式，利用SPSS進行單因素方差分析進行多組間的比較，顯著水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPPH 自由基清除率

DPPH法是檢測化合物清除自由基或供氫能力以及評價食物抗氧化能力最常用的方法之一[20]?？寡趸瘎PPH自由基的還原能力可以通過檢測其在515～528 nm處吸光度的下降來評估[21]。4株乳桿菌在2.0×108CFU/mL濃度下各組分的DPPH 自由基清除率如圖1所示。

圖1 幾株乳酸菌不同組分對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of different lactic acid bacteria strains注：圖中不同字母表示各組的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(下同)

由圖1可知，4株乳桿菌發(fā)酵MRS上清液，菌體均表現(xiàn)出較好的DPPH自由基清除能力，但其差異較大。B6、KF7和BD511的MRS發(fā)酵上清液DPPH自由基清除能力較強，分別為(63.23±1.38)%、(89.21±0.33)%、(77.26±2.30)%，高于LGG的(47.92%±0.34%)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中鼠李糖乳桿菌KF7 發(fā)酵MRS上清液的DPPH自由基清除能力明顯高于其他菌株，其次是副干酪乳桿菌BD5115、鼠李糖乳桿菌B6。4株乳桿菌的活性菌體和滅活菌體對DPPH自由基的清除能力與LGG相比均未見優(yōu)勢，鼠李糖乳桿菌B6滅活菌體對DPPH自由基清除能力高于其他3株菌。綜合看鼠李糖乳桿菌B6的DPPH自由基清除能力相對其他3株菌較全面。實驗結(jié)果表明，不同乳桿菌對DPPH的清除能力不同，發(fā)酵上清液對DPPH的清除能力均高于菌體，推測清除DPPH的活性物質(zhì)主要存在于菌株的發(fā)酵上清液中[22-24]。

2.2 ·OH清除率

·OH被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的主要來源。因此，抑制它們的形成或清除它們具有極其重要的生物學(xué)意義[25]。測定4株乳桿菌不同組分對·OH的清除能力進一步驗證其抗氧化能力，對比結(jié)果如圖2所示。

圖2 幾株乳酸菌不同組分對·OH的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of different lactic acid bacteria strains

由圖2可知，4株乳桿菌均呈現(xiàn)一定的·OH清除能力，鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵MRS上清液對·OH清除能力最強，清除率為(99.38±2.46)%，高于LGG的(98.12±0.20)%；4株乳酸菌活性菌體的·OH清除能力均低于LGG[(99.01±1.90)%]，其中鼠李糖乳桿菌B6清除率為(85.11±1.91)%，高于其他3株乳桿菌。鼠李糖乳桿菌B6滅活菌體對·OH清除率為(96.27±0.48)%，高于LGG的(93.66±0.34)%且和其他菌株差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

實驗結(jié)果表明，不同乳桿菌對·OH的清除能力存在一定差異，其發(fā)酵代謝產(chǎn)物和菌體均可對·OH的清除起到作用。綜合來講，鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵MRS上清液、活性菌體和滅活菌體對·OH的清除能力最強，分別為(99.38±2.46)%、(85.11±1.91)%、(96.27±0.48)%。

2.3 ·O2-清除率

·O2-作為一種信號分子，調(diào)節(jié)許多生物過程，包括細(xì)胞凋亡和衰老[26]。然而，當(dāng)·O2-產(chǎn)生過多或抗氧化防御缺乏時，氧化應(yīng)激就會發(fā)生，從而破壞重要的生物分子并改變其生理功能[27]。乳酸菌發(fā)酵MRS上清液、活性菌體和滅活菌體清除·O2-的結(jié)果如圖3所示。

圖3 幾株乳酸菌不同組分對·O2-的清除能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging ability of different lactic acid bacteria strains

由圖3可知，4株乳桿菌的MRS發(fā)酵上清液、活性菌體和滅活菌體均呈現(xiàn)一定的·O2-清除能力，其中鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵MRS上清液和滅活菌體的·O2-清除能力最強，分別為(26.35±2.21)%、(17.53±8.02)%，高于LGG[(13.97±3.19)%、(5.96±3.69)%]及其余3株乳桿菌且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鼠李糖乳桿菌B6和副干酪乳桿菌BD5115活性菌體的·O2-清除能力最強，分別為(26.48±3.59)%、(25.70±3.33)%，高于LGG的(16.45±0.69)%且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上，鼠李糖乳桿菌B6抗氧化能力較其他3株菌更為全面，其發(fā)酵MRS上清液較菌體的抗氧化綜合能力更強。

2.4 不同培養(yǎng)基鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵上清液自由基清除率

鼠李糖乳桿菌B6分別發(fā)酵MRS和脫脂乳得到發(fā)酵代謝產(chǎn)物，其中鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳得到的上清液對DPPH自由基和·O2-的清除率分別為(74.73±2.99)%、(34.78±2.60)%，都高于其發(fā)酵MRS上清液(表1)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

表1 不同培養(yǎng)條件下鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵 上清液自由基清除率Table 1 Free radical scavenging rate of B6 fermentation supernatant under different culture conditions

2.5 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的最適濃度

PC12細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的H2O2處理，使正常的PC12細(xì)胞氧化，以得到實驗所需的細(xì)胞氧化損傷模型。如圖4所示，H2O2干預(yù)濃度達到500 μmol/L時，細(xì)胞的存活率達到53.51%，最接近50%。所以在建立PC12細(xì)胞氧化損傷模型時，條件為500 μmol/L的H2O2處理20 h。

圖4 不同濃度H2O2處理下的PC12細(xì)胞存活率Fig.4 Survival rate of PC12 cells treated with different concentrations of H2O2

2.6 鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖5可知，對照組的PC12細(xì)胞呈現(xiàn)清晰的角狀，是正常PC12細(xì)胞的形態(tài)；空白脫脂乳組對于細(xì)胞形態(tài)也沒有造成損傷；H2O2處理組細(xì)胞不再伸展偽足而是皺縮為圓形，說明H2O2氧化損傷造成細(xì)胞形態(tài)的劣變，而隨著鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，且濃度越高細(xì)胞的生長狀態(tài)越好，說明鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物緩解了細(xì)胞因為H2O2造成的氧化損傷。

a-對照組；b-空白脫脂乳組；c-H2O2處理組；d-低濃度(5%) B6代謝產(chǎn)物干預(yù)組；e-中濃度(10%)B6代謝產(chǎn)物干預(yù)組； f-高濃度(15%)B6代謝產(chǎn)物干預(yù)組；g-陽性對照組 (200 μmol/L 維生素C)圖5 鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物對H2O2 損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)的影響(×20)Fig.5 Effect of L.rhamnosus B6 fermented skim milk metabolites on morphology of PC12 cells damaged by H2O2(×20)

2.7 PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA，ROS含量的測定

由圖6-a可知，空白脫脂乳組和空白對照組沒有顯著性差異，說明空白脫脂乳對細(xì)胞中的MDA含量沒有影響。而H2O2氧化損傷模型相對于空白對照組而言，MDA的含量顯著升高(P<0.05)，這說明H2O2會促進細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞的氧化損傷加重。受損的PC12細(xì)胞經(jīng)含量10%、15%的鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物處理后，MDA含量從模型組的2.902 nmol/107cell分別降低至2.193、1.914 nmol/107cell，且與模型組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，15%的高劑量組作用具有優(yōu)于維生素C組的趨勢。進一步說明了鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物對細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有一定的改善作用。

由圖6-b可知，經(jīng)H2O2處理后的PC12細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量顯著升高，說明H2O2會促進PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生?？瞻酌撝椴粫鸺?xì)胞內(nèi)ROS含量顯著的變化。在經(jīng)過鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物干預(yù)后，氧化損傷的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS含量有降低趨勢，15%含量的鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物干預(yù)組與模型組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且與陽性對照組水平相當(dāng)，最接近空白對照組水平，這進一步表明鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物能夠一定程度上降低氧化損傷細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。

a-MDA;b-ROS圖6 鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物對H2O2 誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞MDA及ROS含量的影響Fig.6 Effects of L.rhamnosus B6 fermented skim milk metabolites on MDA and ROS content in H2O2-induced PC12 cells

3 結(jié)語

研究表明，鼠李糖乳桿菌B6具有較好的抗氧化能力，其發(fā)酵MRS和脫脂乳的代謝產(chǎn)物均對DPPH、·OH、·O2-具有顯著的清除作用。通過建立PC12細(xì)胞氧化損傷模型，觀察其發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物不同干預(yù)濃度對細(xì)胞形態(tài)的影響以及對細(xì)胞中MDA、ROS含量的影響，可進一步驗證鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物可以在一定程度上抑制或減少H2O2對PC12細(xì)胞造成的氧化損傷。研究結(jié)果可為鼠李糖乳桿菌B6發(fā)酵脫脂乳代謝產(chǎn)物作為天然抗氧化劑抑制PC12細(xì)胞的氧化損傷、保護神經(jīng)提供一定的理論基礎(chǔ)。