纖維素酶和木聚糖酶協(xié)同發(fā)酵葡萄籽為主的混合飼料的條件優(yōu)化

■高慧娟 段平平 王 彥 吳 巧 張洋洋 朱國(guó)鑫 李曉卓 許貴善，2*

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

葡萄酒廠將新鮮葡萄榨汁后產(chǎn)生大量的葡萄渣，而這些副產(chǎn)物一般不做任何加工，堆積發(fā)酵后作為肥料，甚至當(dāng)作垃圾處理[1-3]。這不僅容易滋生病菌，還會(huì)造成水源、土壤資源的污染，更是飼料資源的極大浪費(fèi)。而葡萄籽是經(jīng)分離葡萄皮、葡萄梗處理后所得產(chǎn)物。相對(duì)于普通的粗飼料而言，葡萄籽中富含氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素及各種礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4-5]，以及酚類(lèi)物質(zhì)、脂肪、膳食纖維和酒石酸等可利用成分[6]，在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、抗氧化和免疫方面有極大的利用價(jià)值[7-8]。研究表明，將葡萄籽作為草食動(dòng)物飼料應(yīng)用，不僅可以改善動(dòng)物機(jī)體抗氧化和免疫機(jī)能，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和畜產(chǎn)品品質(zhì)[9]，而且還可以節(jié)約常規(guī)飼料資源，降低飼養(yǎng)成本，緩解我國(guó)優(yōu)質(zhì)粗飼料資源緊缺的壓力[10]。

葡萄籽中含有較多粗纖維，纖維物質(zhì)能快速地通過(guò)動(dòng)物消化道，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)吸收率降低，降低葡萄籽及其他飼料的利用效率[11]。為提高葡萄籽的利用率，緩解新疆南疆飼草料資源短缺的現(xiàn)狀，本試驗(yàn)通過(guò)添加纖維素酶和木聚糖酶發(fā)酵葡萄籽為主混合飼料，期望降低葡萄籽中粗纖維的比例，提高還原糖和其他營(yíng)養(yǎng)含量，從而有效地提高葡萄籽的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，達(dá)到將葡萄籽作為非糧性飼料資源開(kāi)發(fā)利用的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

葡萄籽購(gòu)自于新疆伊犁某葡萄酒釀酒廠。棉籽殼、麩皮等飼料原料來(lái)自塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)站。剔除葡萄籽、棉籽殼、麩皮中的雜質(zhì)，將葡萄籽粉碎，過(guò)40 目篩。將葡萄籽、麩皮和棉籽殼按照6∶1∶1的比例混合，混合均勻后裝入呼吸袋中，每袋裝入100 g樣品。

纖維素酶和木聚糖酶，粉末狀，袋裝，試驗(yàn)所用酶制劑均購(gòu)于滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司，型號(hào)為H型100 000 U/g，原封裝在陰涼、干燥環(huán)境下常溫貯存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用兩因素系統(tǒng)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)組A1、A2 分別為纖維素酶和木聚糖酶；試驗(yàn)組A3、A4、A5分別為纖維素酶與木聚糖酶按照1∶1、2∶1、1∶2的比例配成的復(fù)合酶制劑。樣品裝入呼吸袋后用單室真空包裝機(jī)抽真空并封口，放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在20、25 ℃和30 ℃發(fā)酵24、48、72、96 h，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后稱(chēng)重，開(kāi)封后取部分樣品用于測(cè)定pH和氨態(tài)氮（NH3-N），其余樣品105 ℃烘干保存，用于其他指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

粗蛋白（CP）含量采用凱氏定氮法測(cè)定；粗脂肪（EE）含量使用脂肪浸提儀測(cè)定；中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量使用美國(guó)ANKOM 2000i全自動(dòng)纖維分析儀測(cè)定。稱(chēng)取發(fā)酵樣品10 g，加入90 mL純化水，放入4 ℃冰箱24 h后用四層紗布過(guò)濾到燒杯里，使用FiveEasy FE22 pH儀測(cè)定pH。采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定NH3-N含量[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 26.0 軟件中的單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，LSD多重比較差異，以P＜0.05 為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶制劑20 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物常規(guī)養(yǎng)分含量的影響（見(jiàn)表1）

由表1 可知，發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí)，發(fā)酵96 h 時(shí)，試驗(yàn)組A2、A3、A4 粗脂肪含量均顯著低于發(fā)酵72 h（P＜0.05）；發(fā)酵24、48、72 h 時(shí)，試驗(yàn)組A1、A5 粗脂肪含量顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組A2、A3、A4、A5 的NDF 含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組A1的NDF含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均最低，且顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。各試驗(yàn)組在不同發(fā)酵時(shí)間ADF含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵24、48、72 h和96 h時(shí)試驗(yàn)組A2、A3的ADF含量較高，在0.32～0.38，且顯著高于試驗(yàn)組A1、A5（P＜0.05）。不同時(shí)間點(diǎn)添加不同酶制劑發(fā)酵樣水分含量均差異不顯著（P＞0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間增加，試驗(yàn)組A2 的粗蛋白含量均顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

表1 不同酶制劑20 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物常規(guī)養(yǎng)分含量的影響

2.2 不同酶制劑25 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物常規(guī)養(yǎng)分含量的影響（見(jiàn)表2）

由表2 可知，發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，96 h 試驗(yàn)組A1、A2、A3、A4 粗脂肪含量明顯低于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）。相同發(fā)酵時(shí)間，試驗(yàn)組A3 粗脂肪含量顯著低于試驗(yàn)組A1、A5（P＜0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，試驗(yàn)組A3、A4、A5 的NDF 含量差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)組A2 的NDF 含量顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；試驗(yàn)組A1 的ADF 含量顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。不同發(fā)酵時(shí)間添加不同酶制劑發(fā)酵樣水分和粗蛋白含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同酶制劑25 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物常規(guī)養(yǎng)分含量的影響

2.3 不同酶制劑30 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物常規(guī)養(yǎng)分含量的影響（見(jiàn)表3）

由表3 可知，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，在發(fā)酵24、72、96 h 時(shí)，試驗(yàn)組A3 的粗脂肪含量均低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組A1、A2 的NDF 含量差異不顯著（P＞0.05）。相同發(fā)酵時(shí)間，試驗(yàn)組A3 的NDF 含量最低為0.31～0.39，顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，試驗(yàn)組A1、A5 的ADF 含量差異不顯著（P＞0.05）。相同發(fā)酵時(shí)間，試驗(yàn)組A1 的ADF 含量最低，在0.20～0.22，顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。不同發(fā)酵時(shí)間添加不同酶制劑發(fā)酵樣水分和粗蛋白含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 不同酶制劑30 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物常規(guī)養(yǎng)分含量的影響

2.4 不同酶制劑20 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)pH、NH3-N的影響（見(jiàn)表4）

由表4 可知，發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組pH 逐漸降低。發(fā)酵24、48 h 后，均為試驗(yàn)組A5 的pH 最低，為4.79 和4.02，顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。試驗(yàn)組A1 發(fā)酵96 h、試驗(yàn)組A2發(fā)酵72 h、試驗(yàn)組A3 發(fā)酵24 h、試驗(yàn)組A4 發(fā)酵48 h后，NH3-N最高分別為8.67、7.13、6.71、7.39 mg/dL，分別顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）。發(fā)酵24 h 的試驗(yàn)組A3、發(fā)酵48 h的試驗(yàn)組A4、發(fā)酵72 h的試驗(yàn)組A2、發(fā)酵96 h 的試驗(yàn)組A1 的NH3-N 含量最高，分別為6.71、7.39、7.13、8.67 mg/dL，顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

表4 不同酶制劑20 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)pH、NH3-N的影響

2.5 不同酶制劑25 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)pH、NH3-N的影響（見(jiàn)表5）

表5 不同酶制劑25 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)pH、NH3-N的影響

由表5 可知，發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，各試驗(yàn)組在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)pH 均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組的pH逐漸降低，24 h各試驗(yàn)組的pH均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）。發(fā)酵24 h的試驗(yàn)組A2、發(fā)酵96 h的試驗(yàn)組A1的NH3-N均顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；發(fā)酵48 h的A4顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

2.6 不同酶制劑30 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)pH、NH3-N的影響（見(jiàn)表6）

表6 不同酶制劑30 ℃下發(fā)酵葡萄籽對(duì)pH、NH3-N的影響

由表6 可知，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵24 h 的試驗(yàn)組A1、A2、A5 的pH 顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）；發(fā)酵48、72、96 h 時(shí)各試驗(yàn)組pH 均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組A1 發(fā)酵72 h和96 h、試驗(yàn)組A3 發(fā)酵24 h、試驗(yàn)組A5 發(fā)酵24 h 和48 h 后NH3-N 顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）；發(fā)酵24 h 的試驗(yàn)組A3、發(fā)酵48 h 的試驗(yàn)組A5、發(fā)酵72 h和96 h 的試驗(yàn)組A1 的NH3-N 顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 不同發(fā)酵時(shí)間和酶制劑對(duì)葡萄籽發(fā)酵后常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響

葡萄籽發(fā)酵后的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要包括水分、CP、EE、NDF 和ADF。干物質(zhì)過(guò)低，營(yíng)養(yǎng)成分不足，不易發(fā)酵；干物質(zhì)過(guò)高，發(fā)酵后樣品纖維老化，適口性降低，限制采食量，也不易壓實(shí)。NDF 和ADF 是反映適口性和采食量的指標(biāo)，含量越低，說(shuō)明適口性越好。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加不同酶制劑發(fā)酵葡萄籽提高了飼料脂肪含量，顯著降低了飼料中的ADF、NDF 含量，蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著變化。發(fā)酵后CP 含量為0.08～0.20，EE 含量為0.07～0.19，ADF 和NDF 含量大致為0.30 左右。試驗(yàn)組A1 在25 ℃和30 ℃對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)改善效果最佳。這與南珊珊等[13]研究葡萄籽粕發(fā)酵后常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量類(lèi)似。各試驗(yàn)組發(fā)酵結(jié)束后，常規(guī)養(yǎng)分含量指標(biāo)有一定波動(dòng)，這與王濤等[14]研究不同酶制劑對(duì)以玉米秸稈為主要纖維來(lái)源的FTMR 發(fā)酵品質(zhì)結(jié)果一致，主要原因是添加酶制劑引起纖維素的降解，以及發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的微生物的分解作用。研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，ADF 和NDF 含量降低，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是纖維素酶和木聚糖酶協(xié)同作用于細(xì)胞壁，破壞并降解了纖維素和半纖維素，使得蛋白質(zhì)含量增加。

3.2 不同發(fā)酵時(shí)間和酶制劑對(duì)葡萄籽發(fā)酵后綜合品質(zhì)的影響

研究表明，pH 的變化趨勢(shì)是葡萄籽發(fā)酵成功與否的最直接標(biāo)志。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，各試驗(yàn)組pH降低，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵周期內(nèi)pH的變化趨勢(shì)主要為先降低后趨于平緩。在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，復(fù)合酶1∶2 試驗(yàn)組（A5 組）的pH 大都低于其他試驗(yàn)組。丁浩等[15]研究在象草青貯中添加纖維素酶和木聚糖酶造成pH下降，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，原因是添加酶制劑促進(jìn)了粗纖維的降解，釋放水溶性碳水化合物，加快了乳酸的產(chǎn)生速度，從而降低了pH。

NH3-N 是青貯飼料蛋白質(zhì)保存或分解的重要評(píng)判指標(biāo)之一[16]，當(dāng)飼料中蛋白質(zhì)被微生物利用時(shí)，飼料中的氨態(tài)氮就會(huì)增加。一般情況下，若NH3-N 在10 mg/dL 以下，則表明發(fā)酵過(guò)程良好，本試驗(yàn)得出發(fā)酵葡萄籽NH3-N為3～8 mg/dL，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，各試驗(yàn)組NH3-N 先升高后降低。由于葡萄籽原料來(lái)自于釀酒廠，所以原料中本身就含有一定適合發(fā)酵的微生物，所以發(fā)酵過(guò)程中前期NH3-N 呈現(xiàn)出增加趨勢(shì)。在不同發(fā)酵溫度下，試驗(yàn)組A5 對(duì)發(fā)酵品質(zhì)改善效果最優(yōu)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，NH3-N 呈較低水平，這可能是由于添加酶制劑發(fā)酵后，乳酸含量升高、pH 降低，抑制了有害微生物的生長(zhǎng)活性，減少了對(duì)蛋白質(zhì)的降解，造成NH3-N比值降低。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，纖維素酶與木聚糖酶1∶2、在20 ℃發(fā)酵72 h，可不同程度改善葡萄籽為主混合飼料的發(fā)酵效果，是制作發(fā)酵飼料的適宜參數(shù)。