抗菌肽的生物合成及醫(yī)學應用

魏岱旭，龔海倫，張旭維

（西北大學生命科學院與醫(yī)學部，陜西 西安 710069）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMP）是一大類對細菌、真菌、寄生蟲和病毒等有害生命體（或病原體）具有抗性功能的活性寡肽［1-3］。因其普遍帶有足量的正電荷并常伴隨疏水性，可在靜電作用下與含有負電的生物膜結(jié)合，穿透并破壞膜結(jié)構(gòu)致細胞死亡［4］。與傳統(tǒng)抗生素的單一靶點殺菌原理不同，抗菌肽可在病原體進行多靶點破壞，能極大程度降低耐藥菌的產(chǎn)生［5］，且具有廣譜抗菌性，是未來替代抗生素的最佳選擇之一［6］。目前，已有抗菌肽用于致病菌感染、創(chuàng)面愈合、癌癥等方面的臨床治療案例，但天然抗菌肽的全面推廣也不可避免受到來源、生產(chǎn)成本、生物安全等因素的困擾。隨著合成生物學及醫(yī)學組織工程等交叉學科的興起，將給抗菌肽的生物設計和合成提供新的思路和技術手段。本文綜述抗菌肽的來源、抗性原理及醫(yī)學應用，并重點探討基于合成生物學技術的抗菌肽生物設計及醫(yī)學應用前景。

1 抗菌肽來源和抗性原理概述

自首次在美國蠶蛹中發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來，迄今為止，科研人員已經(jīng)在自然界發(fā)現(xiàn)并記錄了3791個抗菌肽，來自微生物、植物、無脊椎動物、魚類、兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物［5］；其中動物來源的抗菌肽占比最多（圖1）。

圖1 抗菌肽廣泛分布于多種生物Fig.1 Antimicrobial peptides(AMPs)are widely distributed in many organisms

植物源抗菌肽是植物為了抵御病原體和食草動物的侵害而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)化合物［7］，代表著進化歷史上最古老的先天免疫成分之一，為病原體攻擊提供了宿主防御的第一道防線［8］。常見的植物源抗菌肽為Hevein［9-10］、Knottin［11-12］、α-Hairpinin［13］和Snakins［14］等家族。此外，還存在富含其他氨基酸的植物源抗菌肽［15］。因微生物來源多樣，微生物源抗菌肽的種類也較為豐富且分布廣泛，多集中于細菌，少數(shù)來自于真菌或其原核細胞。

與其他來源的抗菌肽相比，動物源抗菌肽被發(fā)現(xiàn)、分析、改造及應用的報道更多［16］，且人源抗菌肽研究最為系統(tǒng)［17-19］。目前，主要有以天蠶素（Cecropin）為代表的昆蟲源抗菌肽［20-21］，以對蝦素（Penaeidin）、Polyphemusins等為代表的節(jié)肢動物源抗菌肽［22-23］，及以貽貝肽（Myticin）為代表的來自于軟體動物源抗菌肽［24-25］。哺乳動物來源抗菌肽主要包括Cathelicidin（抗菌肽）和Defensin（防御素）兩大家族。Cathelicidins家族的典型代表是hCAP-18/LL-37，也是唯一存在于人體的抗菌肽［26-28］，但其抗菌能力主要來自C末端結(jié)構(gòu)域的37個氨基酸（LL-37）［29］，且對大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、李斯特氏菌甚至部分高危耐藥菌球都具有相當?shù)臍芰Γ?7］。Defensin是一類富含精氨酸而顯正電荷的寡肽，常由18～54個氨基酸組成［30-31］，能殺傷絕大部分需氧細菌，對真菌、病毒也具有抑制作用［18-19］，也常與不同的生物材料結(jié)合使用，用于解決人工骨及牙等輔助修復過程中的厭氧菌抑制問題［32-34］。

目前，主流觀點認為抗菌肽的作用靶點是細菌的細胞膜，為非特異性。陽離子型抗菌肽通過與帶負電荷的細胞膜成分［如革蘭氏陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸和真菌的甘露聚糖］相互作用，且抗菌肽普遍具有較強的疏水性和兩親性結(jié)構(gòu)，也增加了細胞膜的通透性，破壞其穩(wěn)態(tài)，致細胞膜溶解，促進細胞內(nèi)容物釋放，實現(xiàn)抗菌或其他抗性功能［35］。基于現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)，針對陽離子型抗菌肽，提出了一些膜腔形成的4種常見的假設模型［36-40］：桶板模型（barrel-stave）［37］、環(huán)孔模型（toroidal）［38］、地毯式模型（carpet）［39-40］和聚集體模型（aggregate）［41］（圖2）。陽離子型抗菌肽不同，陰離子型抗菌肽的作用機制仍不清楚，但也存在類似的現(xiàn)象［42-48］。

圖2 陽離子型抗菌肽抗菌機制模型Fig.2 Antibacterial mechanisms models of cationic AMPs

除了抗細菌，大部分抗菌肽還對真菌［49-50］、病毒［51-54］、寄生蟲［55-59］乃至癌細胞［60-63］也有抗性或抑制作用。部分抗菌肽主要是通過破壞、阻止真菌細胞壁合成的方式來消滅真菌；也有間接干擾真菌胞內(nèi)的大分子合成從而破壞真菌脂膜等結(jié)構(gòu)抑制真菌的生長［49-50］?？共《绢惪咕闹饕ㄟ^破壞病毒包膜、抑制病毒附著和病毒-細胞膜融合、抑制病毒復制等方式來消滅病毒［64］。目前，抗寄生蟲類抗菌肽的抗性機制制尚不清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)抗菌肽可通過膜透化與去極化等膜溶解機制殺死寄生蟲［57］。

2 抗菌肽的生物合成及生物表達系統(tǒng)

除了按某種特定氨基酸序列進行多肽的化學合成技術［65-67］，越來越多的抗菌肽通過生物合成獲得。對比從動植物及微生物體內(nèi)直接分離、純化得到的抗菌肽的天然提取法，基因工程法及升級的合成生物學法都存在操作程序簡單、成本低、污染小等優(yōu)勢［68］，這已經(jīng)成為獲取抗菌肽的最主要途徑之一。如表1所示，除少數(shù)采用動、植物表達系統(tǒng)外［100］，大部分抗菌肽采用依托微生物表達系統(tǒng)實現(xiàn)生物合成；且隨著合成生物學的快速發(fā)展，科研人員也正在嘗試利用新型底盤細胞和多種合成生物學工具對抗菌肽的微生物合成表達進行改良。

表1 常見的抗菌肽生物表達系統(tǒng)Tab.1 Expression system of antimicrobial peptides in this review

2.1 利用原核表達系統(tǒng)生物合成抗菌肽

因大腸桿菌具有生長速度快、培養(yǎng)成本低、生物背景清晰等優(yōu)勢，最早用于抗菌肽的基因工程法生物合成［101］。最常用的大腸桿菌為E.coliBL21（DE3）菌株［102］，常用的表達載體有pET、pGEX等。

早在20世紀90年代，已利用E.coli重組表達Cecropin及其衍生肽，與提取的天蠶素一樣，重組表達的Cecropin能有效裂解細胞膜、殺死多種細菌［21，69-72］。為了獲得大量的來自亞洲海生蛤蜊的抗菌肽Perinerin，將其編碼序列克隆到pET32a（+）載體中，作為融合蛋白的一部分在E.coliBL21（DE3）中表達且純化，抗菌實驗顯示重組Perinerin具有與天然Perinerin相似的抗菌活性［73］。腺調(diào)素（Adenoregulin，ADR）是從樹蛙皮膚中分離獲得的由33個氨基酸組成的抗菌肽，對絲狀真菌和致病微生物具有廣泛的致死作用，將ADR合成基因克隆到pET32a載體中并在E.coliBL21（DE3）中表達，其蛋白表達量高達全細胞總蛋白20%，其抗菌活性與之前報道的化學合成ADR相似［74］。Kim等［75］用pKSEC1和6HisSUMO-abaecin為載體，E.coliBL21（DE3）為宿主表達了從蜜蜂中分離出的抗菌肽Abaecin，展現(xiàn)出較好的抗菌能力且不影響宿主細胞的活力。Da Costa等［76］也利用E.coliBL21（DE3）菌株重組表達Hep-A200，對革蘭氏陽性及陰性細菌均具備抗菌活性，且無細胞毒性。目前，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)合成的抗菌肽的數(shù)量最多，分布最廣，且技術最成熟，還 實 現(xiàn) 了LL37衍 生 肽MLH［77］、Hal18［78］、Plectasin［79］、Lactoferricin［80］、BuforinⅡ［81-82］等抗菌肽的生物合成。

此外，有些抗菌肽也常用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達系統(tǒng)合成［83］。與大腸桿菌相比，B.subtilis表達系統(tǒng)可將抗菌肽直接分泌到胞外，有利于收集、分離和純化目標蛋白；但也存在分泌蛋白酶、產(chǎn)物易降解、產(chǎn)量低且外泌抗菌肽殺死宿主等缺陷。如抗菌肽Cathelicidin-BF［84］、T9W［85］、Cecropin AD［83］、CiMAM［86］都曾利用枯草芽孢桿菌進行高效表達，且抑菌效果顯著。但該系統(tǒng)主要用來植物病害的治療，在人類健康領域應用較少。

但所有的原核表達系統(tǒng)都也面臨著一些挑戰(zhàn)：①具備生物活性的大部分抗菌肽自身對原核宿主菌株存在廣譜性的殺傷能力；②因絕大多數(shù)抗菌肽具有正凈電荷，易被內(nèi)源性蛋白酶降解，但通過融合蛋白策略可以適當克服此問題［103］。

2.2 利用真核表達系統(tǒng)生物合成抗菌肽

真核表達系統(tǒng)的代表是酵母菌表達系統(tǒng)，包括釀酒酵母（S.cerevisiae）、畢赤酵母（P.pastoris）、萊茵衣藻（C.reinhardtii）等，其表達載體有pPICZa、pPIC9K、pGAPZa等［104］。相對于原核表達系統(tǒng)，酵母菌表達系統(tǒng)具有抗菌肽產(chǎn)物毒性低、活性高、易分離等優(yōu)點，還可促進抗菌肽細胞外表達和能夠翻譯后修飾（促進二硫鍵形成、O-糖基化和N-糖基化等）［89，105］；但也存在細胞生長慢、產(chǎn)量低、部分抗菌肽（如蜂毒素）對宿主菌株有害等不足之處。

釀酒酵母（S.cerevisiae）是最常用的真核表達系統(tǒng)，可使用強啟動子以獲得抗菌肽的高效表達量。Xia等［87］將抗菌肽基因cecropinXJ克隆到pYES2/CT/α因子表達載體中，并在S.cerevisiaeINVSc1菌株中成功表達重組蛋白CecropinXJ，且占總蛋白的79.45%。Jiang等［88］在S.cerevisiae中成功合成了具有抗病毒和抗菌雙重性能的抗菌肽Cecropin P1。由于S.cerevisiae在生物合成過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物乙醇，必定會影響菌群數(shù)量和抗菌肽的最終產(chǎn)量。同時，S.cerevisiae還存在過度糖基化、信號肽加工不完全等先天缺陷，這也限制了抗菌肽的規(guī)模化生產(chǎn)。

所以與S.cerevisiae相比，更多的抗菌肽是利用畢赤酵母（P.pastoris）進行重組表達。Meng等［90］成功利用P.pastoris重組表達分泌型的PaDef，在最佳條件（28℃、pH 6.0、1.5%甲醇）下 培 養(yǎng)72 h，PaDef的 積 累 量 高 達79.6 μg/mL。Moridi等［91］采用P.pastorisGS115表達系統(tǒng)制備了蜂毒抗菌肽Melittin，具有廣譜抗菌活性。以畢赤酵母X-33為表達系統(tǒng)，pPICZα-A為載體，Xing等［92］成功重組表達Fowlicidin-2，其表達純度為85.6 mg/L，具有廣譜抑菌性，但重組Fowlicidin-2具有溶血性。Wang等［93］利用P.pastoris重組表達HKABF肽，并對金黃色葡萄球菌和腐生葡萄球菌具有較低濃度的抑菌活性，且其熱穩(wěn)定性好，溶血活性低。為了大量生產(chǎn)Mytichitin-A，Meng等［94］利用6 His標簽的Mytichitin-A插入pPICZαA中，通過電穿孔將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115，使其分泌重組的Mytichitin-A，其純度為97.8%。Zhang等［95］采用pPICZaA為 表 達載體，利 用P.pastoris重組表達的抗菌肽ABP-CM4能分泌至培養(yǎng)基中，且純化后的ABP-CM4與天然提取的抗菌肽蛋白在功能上沒有顯著區(qū)別。Ahmad等［89］也成功在甲基營養(yǎng)型P.pastoris中表達出抗菌肽Cecropin AD。

萊茵衣藻（C.reinhardtii）是一種生長周期短、生長迅速且能自主光合作用的單細胞生物，具有“光合酵母”美譽。與P.pastoris和S.cerevisiae相比，C.reinhardtii表達異源蛋白更穩(wěn)定。Dong等［96］利用C.reinhardtii表達抗菌肽3×Mytichitin-A，其產(chǎn)量占總可溶性蛋白的0.28%，且連續(xù)傳代6個月后表達水平穩(wěn)定。利用C.reinhardtii還成功合成Bacteriocin LS2［97］、ToAMP4［98］、Mytichitin-CB［99］等，這也意味著C.reinhardtii可作為新的合成生物學底盤細胞和微生物合成平臺。

3 抗菌肽的分子設計與合成生物學改造策略

利用微生物表達系統(tǒng)生產(chǎn)天然抗菌肽，有時會出現(xiàn)產(chǎn)率過低、宿主毒性過大、抗性活性不足等缺陷，有的抗菌肽溶血性顯著，難以推廣。為了解決上述問題，研究人員嘗試進行截取有效序列、氨基酸殘基替換、改造結(jié)構(gòu)參數(shù)等基因工程技術對天然抗菌肽基因序列進行1.0版本改造。將天然抗菌肽Chensinin-1蛋白序列中的Gly替換成Trp［106］，或增加原肽中Trp的占比［107-108］，增強了革蘭氏陰性菌的抗性。重新設計抗菌肽LGR16的親疏水區(qū)域，可調(diào)節(jié)其溶血活性和抗性［109］。

隨著合成生物學的發(fā)展及人工智能（artificial intelligence，AI）的興起，利用計算機對天然抗菌肽序列的數(shù)據(jù)進行分析和學習，可建立預測算法并利用該算法找出相關特征和規(guī)律，有望推廣至未知抗菌肽的預測及精準設計［110］，實現(xiàn)抗菌肽改造的2.0版本（圖3）。目前，已經(jīng)有團隊基于一個基于支持向量機（support vector machine，SVM）平臺來研究α-螺旋抗菌肽的功能共性和序列同源性，依托該平臺可根據(jù)抗菌肽的理化性質(zhì)設計出具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的新型抗菌肽［111］?；谏鲜銎脚_，對286個α-螺旋抗菌肽和286個非抗菌肽數(shù)據(jù)進行訓練，以識別出決定抗菌肽活性的關鍵特性，并以此為依據(jù)進行篩選，其精度高達91.9%，特異性和敏感性也分別達到93.0%和90.7%。目前通過該模型已發(fā)現(xiàn)了數(shù)種通過自然進化或點突變難以產(chǎn)生的α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽［111］。2021年，Das等［112］使用基于變分推斷的自編碼器（variational autoencoder）學習所有通用蛋白質(zhì)資 源（universal protein resource）中 報 道 的 約170萬條多肽，并將抗菌肽單獨取出分為抗菌能力強弱兩類，通過建立多肽抗菌能力的“分類器”，經(jīng)“假設-拒絕采樣”，最終獲得新的高活性抗菌肽。

圖3 計算機輔助及人工智能加速新型抗菌的設計Fig.3 Overview of the proposed computer-assisted and AI-driven approach for accelerated novel antimicrobial peptides(AMPs)design

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是一種在合成生物學范疇的序列特異精準突變方法，也是最新的基因編輯技術。CRISPR/Cas9介導的基因沉默、基因敲除或特定DNA序列的操作也能增多異源抗菌肽的產(chǎn)生，使其正確/更快地折疊或能夠?qū)ζ溥M行適當?shù)姆g后修飾［102］。Park等［113］利用CRISPR/Cas系統(tǒng)，將Cas9核酸酶和特異的RNA導入家蠶卵巢的BM-N細胞，使其內(nèi)源性基因功能減弱，并對起抗感染的Toll通路進行負調(diào)控，成功編輯家蠶Cactus基因，激活家蠶免疫應答信號通路，分泌Moricin和Lebocin等抗菌肽（圖4）。目前，利用CRISPR/Cas9等合成生物學領域的基因編輯技術指導抗菌肽合成和殺菌的研究較少，但未來潛力巨大。

圖4 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)促進細胞分泌抗菌肽Fig.4 Overview of the CRISPR/Cas9 gene editing system promoting the secretion of antimicrobial peptides in mammal cells

4 抗菌肽的醫(yī)學應用

抗菌肽主要對有害病原體的細胞膜進行非特異性的快速殺傷和細胞內(nèi)干擾，并不針對特定的分子途徑，這大大降低細菌對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性的概率［35］。因此，將抗菌肽應用于抗菌藥物的臨床研究具有重要意義。絕大部分情況下，抗菌肽自身常作為抗菌消炎類藥物的原藥（非載體），可通過涂抹或注射等方式進行最終目的為人體治療的研究測試。目前，Daptomycin、Vancomycin、Dalbavancin（BI397，Dalvance，Xydalba）和Colistin 4種抗菌肽已被美國食品及藥物管理局（FDA）批準采用靜脈注射的形式用于抗菌治療（表2）［6，114-116］，另外多種抗菌肽正在臨床開發(fā)中。除了最初的抗菌效應，越來越多的抗菌肽展現(xiàn)出多重作用，包括抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及抗寄生蟲等，也開始與醫(yī)用生物材料相結(jié)合，服務于醫(yī)學組織工程、藥物遞送與醫(yī)療美容，這些嘗試為抗菌肽的應用開辟了新的應用領域（圖5）。

圖5 抗菌肽的醫(yī)學應用Fig.5 Medical applications of antimicrobial peptides(AMPs)

表2 美國食品及藥物管理局（FDA）批準的抗菌肽的名稱、治療的適應證、給藥途徑及臨床試驗標識號Tab.2 Name,indication,deliever and clinical trial identification of antimicrobial peptides approved by US Food and Drug Administration(FDA)[6,114-116]

4.1 抗菌消炎類藥品

絕大部分抗菌肽都曾作為潛在的抗菌消炎類藥品進行研究開發(fā)。細菌素（Bacteriocin）是從細菌中分離出來的一類由30～60個氨基酸殘基形成的陽離子抗菌肽［117］。Nisin是該家族的一員，對多種革蘭氏陽性菌甚至革蘭氏陰性菌都有很高的抗菌活性［118-119］，還可聯(lián)合精油肉桂醛和乙二胺四乙酸（EDTA）控制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的生長［120-121］。也有報道稱，當青霉素或氯霉素聯(lián)合Nisin使用時能提高糞腸桿菌的抑菌效果，但單藥單獨效果欠佳［122］。同樣，從蛙皮中提取的Esculentin-1a抗假單胞菌肽具有殺死假單胞菌細胞的活性，且不誘導耐藥性［123］。因此，抗菌肽也可作為治療耐藥細菌的新選擇，無論是單獨或協(xié)同應用。

除了具備抗菌能力，部分抗菌肽還可直接或間接參與宿主的免疫調(diào)節(jié)，保護宿主免受感染［124-125］。防御素是另一大類抗菌肽家族，具有多個成員，廣泛存在于中性粒細胞［126］、巨噬細胞［127］、淋巴細胞［128-129］、NK細胞［130］等免疫細胞中，且具有強大的促炎功能（pro-inflammatory function）［131］。其中，人源防御素HBD2、HBD3和HBD4皆可刺激人角質(zhì)形成細胞中IL-6、IL-10等免疫因子的表達；還發(fā)現(xiàn)這些防御素能誘導EGFR、STAT 1和磷酸化STAT3等參與角質(zhì)形成細胞遷移和增殖的細胞內(nèi)信號分子，促進角質(zhì)細胞遷移和增殖參與傷口愈合［132-133］。

4.2 抗病毒藥品

除了抗菌消炎和免疫調(diào)控，有的抗菌肽對病毒還具有廣譜抗性［51］，LL-37最為典型。Barlow等［134］評估了LL-37可降低流感病毒感染模型小鼠的疾病程度和病毒復制能力，其治療效果與特異性抗病毒藥物扎那米韋（Zanamivir）相似；Tripathi等［135］發(fā)現(xiàn)LL-37可直接對流感病毒的膜結(jié)構(gòu)進行破壞而實現(xiàn)病毒抑制。LL-37還可抑制其他具有膜結(jié)構(gòu)的病毒，如人類免疫缺陷病毒（HIV）［52］、牛痘病毒［53］、單純性皰疹病毒［51］和登革病毒［51］等。此外，Todorov等［136］分離得到一種3950 Da大小的新型廣譜抗菌肽，滅活諸多有害菌的同時對單純皰疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和麻疹病毒均有抗性。?？咕?13（APB-13）對豬傳染性腸胃炎病毒的抑制率高達74.1%［137］；經(jīng)透射電鏡確認，Temporin B能直接破壞1型單純皰疹病毒的膜，抑制其在宿主細胞內(nèi)大量擴增［138］。最近的研究表明，抗菌肽Nisin也可以與新冠病毒SARS-CoV-2的刺突蛋白靶向的細胞受體相互作用［139］，從而開啟了使用AMPs對抗新型大流行冠狀病毒的前景［140-141］。

4.3 抗寄生蟲藥品

與上述臨床研究相比，關于抗菌肽的抗寄生蟲類報道較為少見，多集中于抗瘧原蟲、抗利什曼原蟲，抗 錐 蟲 的 研 究。Halictine-2［55］、Dragomide E［56］、Temporin-Sha［57］、BmajPLA2-Ⅱ［59］等不同來源的抗菌肽都具備較強的抗利什曼原蟲能力。此外，大黃魚來源的Lc-P5L4能使刺激海水魚類寄生蟲隱核蟲細胞膜破裂［58］；蛇抗菌肽的衍生的肽LZ1可通過特異性抑制瘧原蟲感染紅細胞中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的產(chǎn)生，實現(xiàn)對血期惡性瘧原蟲的強烈抑制［56］。

4.4 抗癌藥品

最近研究發(fā)現(xiàn)，部分抗菌肽對某些癌細胞也具有抗性，可作為潛在的新型抗癌藥物進行研發(fā)［142］。與正常細胞相比，癌細胞膜表面的陰離子組成是抗菌肽進攻的特異性靶點；抗菌肽通過靜電作用更易與癌細胞表面解除并選擇性地殺死癌細胞，但大部分抗菌肽更偏愛調(diào)節(jié)癌細胞的代謝通路或細胞因子實現(xiàn)抗癌。KillerFLIP可以通過靜電和疏水驅(qū)動力的微調(diào)平衡來選擇性殺死癌細胞［60］；鱷梨來源的防御素PaDef對慢性髓系白血病K562細胞株具有細胞毒性（IC50=97.3 μg/mL）；［61］；LL-37的類似物FF/CAP18定位于結(jié)腸癌細胞的細胞質(zhì)，增強了生長抑制miRNAs的表達，抑制癌細胞增殖［62］；調(diào)節(jié)抗菌肽Myristoly-CM4的濃度可直接干擾白血病細胞（K562、MDR、Jurkat）的凋亡或壞死行為，進行特異性毒殺［63］，且對乳腺癌細胞系（MCF-7、MDA-MB-231、MX-1）具有抑制作用［143］；KT2和RT2可以通過誘導細胞的周期停滯以及凋亡等方式對人結(jié)腸癌HCT-116細胞進行特異性抑制，減少癌細胞的轉(zhuǎn)移［144］；蛋氨酸腦啡肽（methionine enkephalin）能抑制B16黑色素瘤細胞的生長并且誘導其凋亡［145］。這些研究都為研究抗癌藥物的研發(fā)提供了思路。

4.5 醫(yī)學組織工程

隨著組織工程學和醫(yī)用生物材料的不斷發(fā)展［146-152］，組織工程支架的抗菌性研究和新型抗菌材料已經(jīng)是未來重點發(fā)展的方向之一。由于抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性，具有對于細菌、真菌、寄生蟲、病毒等多種病原體的廣譜抗性。與傳統(tǒng)抗生素和納米金屬類新型抗菌劑對比，抗菌肽毋庸置疑是下一代抗菌劑的主力軍。為了避免免疫原性等因素，應用于醫(yī)學組織工程及再生醫(yī)學領域的抗菌肽多為人類來源的LL-37和人防御素（human defense）系列，且多為化學固定或物理混合的形式與各種醫(yī)療器械、體內(nèi)植入物、藥物制劑載體、醫(yī)療耗材、外傷敷料相結(jié)合。目前，與抗菌肽結(jié)合的組織工程支架已經(jīng)應用于骨［153-155］、牙［34］、皮膚［156］、眼角膜［157］等諸多器官和組織的修復。

炎癥性骨丟失的修復和再生仍然是一個骨科臨床挑戰(zhàn)。LL-37除了抗菌消炎，在細胞遷移、細胞因子產(chǎn)生、細胞凋亡和血管生成中發(fā)揮重要作用［158］。通過對間充質(zhì)干細胞和LPS誘導的小鼠顱骨溶解性骨缺損模型進行體外和體內(nèi)的研究，發(fā)現(xiàn)LL-37在體外可有效抑制LPS誘導的破骨細胞形成和有害細菌的活性［154］。同樣，通過聚多巴胺涂層可實現(xiàn)三維PLGA多孔支架的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和Ponericin G1功能化修飾，該支架能有效調(diào)節(jié)前成骨細胞的成骨分化，同時抑制致病微生物，從而提高生物活性［153］。除了PLGA，也可將抗菌肽LF1-11修飾于鈦合金表面植入物，在大力提高間充質(zhì)干細胞的黏附能力（因添加RGD序列）的同時，還對金黃色葡萄球菌具有有效的抗菌作用［155］。為解決在臨床假牙或鈦合金骨支架常存在的細菌感染及成骨效率低雙重困局，Liu等［34］開發(fā)了一種雙功能鈦合金納米羥基磷灰石涂層，能夠持續(xù)釋放重組的HBD-3和BMP-2。該涂層能同步釋放兩種活性物質(zhì)，并能在抑制細菌生長的同時促進骨組織再生，在骨或牙組織工程中具有很大的臨床潛力。Lin等［156］將抗菌肽Tet213固定于海藻酸、透明質(zhì)酸和膠原蛋白的創(chuàng)面敷料中，該創(chuàng)面敷料對大腸桿菌、MRSA和金黃色葡萄球菌3種病原菌都具有抗菌活性，并能促進NIH3T3成纖維細胞的增殖；此外，與市售銀基敷料相比，該創(chuàng)面敷料的傷口愈合效果更佳。采用基于磁力的組織工程技術，可制備出能過表達HBD-3基因的多層角化細胞抗菌薄片，為感染性疾病提供一種新的基因治療策略［157］。

4.6 藥物遞送系統(tǒng)

由于大部分抗菌肽的本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽，在用藥途中（如口服）極易受蛋白酶降解而失效，且有些抗菌肽具備非特異性的細胞毒性，能同時抑制甚至殺死腫瘤細胞和正常細胞，這一特性也限制了該類種抗菌肽的臨床推廣［159-160］?？蓞⒖妓幬镞f送系統(tǒng)［161-163］，利用納米尺寸的載體可負載濃縮抗菌肽，以降低運輸過程中藥物的釋放并在一定程度避免蛋白酶降解，提升抗菌肽對癌細胞抗性及靶向性［164］，也能提升部分抗菌肽對細菌［165］或真菌［166］的抗性。目前，與抗菌肽結(jié)合的納米載體包括可降解的生物高分子、脂質(zhì)體，及不可降解的磁性納米顆粒等［165，167-169］。

與游離的LL-37抗菌肽治療相比，磁性納米顆粒連接的LL-37能導致癌細胞活力下降和凋亡率上升，這表明磁性納米顆粒化的LL-37是潛在的結(jié)腸癌治療方案之一［166］。該系統(tǒng)還可用于抗真菌治療，且不干擾成骨細胞的增殖和活力，具有較高的生物相容性［170］。Falciani等［168］報道了一種基于非天然抗菌肽SET-M33肽與單鏈葡聚糖納米顆粒的新型納米復合體（M33-NS），改復合體能抵抗生物液體中的降解，對臨床分離出的耐藥性革蘭氏陰性病菌存在治療效果，且在肺炎、敗血癥和皮膚感染的臨床前感染模型中也有生物效應。Lam等［165］展示了一類被稱為“結(jié)構(gòu)納米工程抗菌肽聚合物”的復合抗菌劑，對所有耐藥性革蘭氏陰性細菌都表現(xiàn)出較好的殺傷性，同時顯示出低的細胞毒性。納米尺度的高分子微凝膠（microgel）與多肽的相互作用以靜電為主。通過調(diào)節(jié)電荷密度，微凝膠能結(jié)合或釋放抗菌肽KYE28，殺死大腸桿菌并對人單核細胞起到抗炎作用［169］。

雖然利用基于納米載體的抗菌肽傳遞系統(tǒng)能有效解決部分抗菌肽的毒性和靶向性，但引入的納米尺寸的載體自身的生物相容性和納米粒子沉積等問題也不可忽視。有研究發(fā)現(xiàn)，當LL-37肽暴露在碳納米顆粒中，其抗菌功能嚴重損失；納米顆粒可以改變宿主防御肽結(jié)構(gòu)和功能［171］，這也表明納米顆粒的引入可能干擾抗菌肽的生物活性，增加疾病的感染性。

4.7 皮膚護理與醫(yī)療美容

除了抗菌消炎，一些抗菌肽能誘導內(nèi)皮細胞生長和促血管生成因子的分泌，削弱因衰老而造成的血管萎縮，促進皮膚損傷后創(chuàng)面愈合，具有潛在的醫(yī)療美容和皮膚護理功效［172-180］。人瘢痕疙瘩組織中，LL-37也被發(fā)現(xiàn)具有緩解皮膚膠原蛋白生成，具備抗纖維化的特性［174］。LL-37還可通過LPS和巨噬細胞的活化誘導內(nèi)皮細胞增殖、遷移和形成小管樣結(jié)構(gòu)，增加了血管化和再上皮化［175］。角質(zhì)形成細胞釋放銀屑病素可抑制成纖維細胞膠原、纖維連接蛋白-1、平滑肌肌動蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子的表達［176］；菌肽AG-30能以誘導內(nèi)皮細胞生長和分泌促血管生成因子的方式，削弱人因為衰老而造成的血管減少的結(jié)果，使皮膚獲得足夠的營養(yǎng)［177-178］；DRGN-1除了抗菌作用外，還可以通過清理感染菌的生物膜和促進角質(zhì)形成細胞遷移和增殖用于加速傷口閉合，形成無疤痕的有效組織再生［179］；CopA3可以抑制紫外線輻射引起的人纖維細胞分泌Ⅰ型前膠原的能力，減少皮膚的老化［180］，因此，抗菌肽在黑色素瘤、痤瘡、糖尿病足潰瘍和銀屑病等多種皮膚疾病治療中起到作用，也可作為新型外用皮膚護理型化妝品的添加劑。

5 抗菌肽的缺陷與醫(yī)學應用瓶頸

雖然抗菌肽具有廣譜抗菌、低耐藥性、抗癌、調(diào)節(jié)免疫等諸多優(yōu)點，但也存缺陷，其主要為抗菌肽的合成成本較高、體內(nèi)的穩(wěn)定型和有效性不足及部分抗菌肽毒副作用大。這限制了抗菌肽在醫(yī)學應用的發(fā)展，也增大了其臨床驗證和審批程序的難度［181-182］。

與成熟的抗生素合成工業(yè)相比，目前抗菌肽的生產(chǎn)基本處于實驗室階段，還沒有工業(yè)化概念和成熟的產(chǎn)業(yè)體系，因此其合成成本普遍較高，是常規(guī)抗生素的5～20倍［182］。

與傳統(tǒng)抗生素或金屬納米抗菌劑相比，抗菌肽因其特殊的多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更易與人體的蛋白酶親和而降解，同時在極端pH或高溫的環(huán)境下也更易失活。因此大部分抗菌肽的穩(wěn)定性不佳，體內(nèi)有效性難以維持，這也導致部分抗菌肽的藥效及納米藥物遞送應用的結(jié)果可能低于預期［183-184］。

除了作用于細菌、真菌等微生物的細胞膜，抗菌肽中的正電荷也可與人體或哺乳動物細胞膜表面的負離子相互作用，形成寡聚體破壞細胞結(jié)構(gòu)［185］，導致不同程度的溶血性、干擾細胞信號肽，引起細胞凋亡、肥大細胞脫?；蚣毎釪NA轉(zhuǎn)移等不良臨床現(xiàn)象［186-188］。目前，只有少數(shù)具有藥用價值的抗菌肽進行了系統(tǒng)的溶血性、免疫原性和毒性等生物安全性評估。Pini等［189］報道M6是一種體內(nèi)使用的低毒抗菌肽，其小鼠的腹腔注射半數(shù)致死量（LD50）為125 mg/kg，其靜脈注射LD50為37.5 mg/kg。JH-3是一種新型抗菌肽，經(jīng)小鼠腹腔注射的LD50為180 mg/kg［190］。Li等［191］通過腹腔和尾靜脈注射不同劑量的Hp1404對小鼠的急性毒性測定。結(jié)果表明，Hp1404對BALB/c小鼠的LD50為89.8 mg/kg（靜脈注射），表現(xiàn)出低毒性。TP1是一種典型的陽離子β-發(fā)夾型抗菌肽，具有膜溶作用機制，但由于其保守的β-發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)基序，TP1在小鼠和人血漿中具有非常高的穩(wěn)定性［192］。

除了上述3種普遍存在的缺陷，部分抗菌肽對病原體的親和能力也可能反向促進感染。志賀氏菌以人腸道防御素HD5為靶點，但HD5能促進志賀氏菌的吞噬和繁殖并導致巨噬細胞死亡，最終釋放大量的細菌感染腸道細胞［193-194］。

6 小結(jié)與展望

自青霉素問世以來，抗生素已經(jīng)在人類醫(yī)療系統(tǒng)中頻繁使用挽救了無數(shù)生命；但隨之產(chǎn)生了多種人體耐藥菌增加了相關治療的難度，給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來嚴重挑戰(zhàn)，這成為21世紀公共衛(wèi)生威脅之一?？咕囊蚓哂歇毺氐目咕再|(zhì)，廣譜抗擊微生物（含耐藥菌）、病毒、寄生蟲等各種病原體，且不易產(chǎn)生耐藥性病原微生物等諸多優(yōu)點，可能成為未來抗生素的替代品；同時，強大的免疫調(diào)節(jié)和抗癌特性也增大抗菌肽的醫(yī)藥應用前景。但成本高、穩(wěn)定性差、生物毒性等缺點也限制了抗菌肽的臨床醫(yī)學發(fā)展。隨著合成生物學和人工智能等新型交叉學科的快速發(fā)展，可能給抗菌肽的設計、合成提供新的技術平臺，也在不同層面和角度推動抗菌肽的轉(zhuǎn)化和應用。其中主要的可行的發(fā)展策略包括：

（1）利用計算機對天然抗菌肽結(jié)構(gòu)進行分析，了解抗菌肽序列中氨基酸殘基的作用與功能，預測抗菌肽的抗菌活性、空間構(gòu)象、突變體等性能，實現(xiàn)抗菌肽的高通量篩選，設計出兼具廣譜抗性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的新型抗菌肽，滿足更多市場需求，提高抗菌肽的利用率。

（2）基于合成生物學技術，利用CRISPR/Cas9等新型的基因編輯技術對天然抗菌肽基因進行定向編輯，例如增加、替換、刪除某些氨基酸殘基，減少抗菌肽對生產(chǎn)菌株及人體細胞的毒性，增加抗菌肽的抗菌性能。

（3）篩選優(yōu)化新型生物合成菌株系統(tǒng)（或底盤細胞），傳統(tǒng)的原核宿主細胞（如大腸桿菌）雖均有生長速度快、培養(yǎng)成本低、生物背景清晰的優(yōu)點被廣泛應用，但其生產(chǎn)的抗菌肽一般還需與融合蛋白或包涵體等分離，純化程序復雜。其他新型的表達系統(tǒng)及生物合成菌株或許能調(diào)控合成菌株的氨基酸代謝流，增強抗菌肽的體內(nèi)積累。

（4）利用微生物形態(tài)工程技術優(yōu)化宿主細胞的形態(tài)或者分裂方式基因，使菌株由短桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚L桿狀、橢圓狀等形態(tài)。此外，通過改變菌株的分裂方式，破壞細菌傳統(tǒng)的二分裂方式，使一個細菌細胞可同時分裂成多個細胞，有利于菌體內(nèi)產(chǎn)物的積累，提高生物合成效率，降低生物合成成本。

（5）完善抗菌肽生物合成的工業(yè)化體系，開發(fā)快速回收高純度抗菌肽的工藝。細菌作為宿主細胞生產(chǎn)抗菌肽時，融合蛋白被用于掩蓋抗菌肽，降低其對宿主細胞的殺傷，可利用融合蛋白組分等電點或溶解度差異回收抗菌肽，有利于降低成本，促進抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)。

（6）與現(xiàn)有抗生素聯(lián)合用藥，增強藥效，避免耐藥性。除了作為單一抗菌藥物，抗菌肽還能與青霉素、氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢菌素等常規(guī)抗生素聯(lián)合使用，通過多種殺菌方式聯(lián)合破壞細菌細胞膜的穩(wěn)定性，引起細胞膜破裂或者溶解，使細菌死亡，發(fā)揮更高效的抗菌作用，有利于降低抗生素或抗菌肽的毒副作用，并預防細菌耐藥性。

（7）與生物材料結(jié)合，提高抗菌肽穩(wěn)定性，降低生物毒性。開發(fā)新型抗菌類植入物及手術器材，這類抗菌植入物或手術器材具有雙重殺菌性能，增強治療效果，同時生物材料還能將抗菌肽遞送到作用部位，并緩慢釋放抗菌肽，避免抗菌肽大量降解，確?？咕牡挠行Э咕阅埽泳徑o藥時間，降低藥物對體內(nèi)其他組織器官的損傷。