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    可基因編碼點擊化學在材料合成生物學中的應用

    2022-09-16 03:00:42易琪昆孫晨博楊中光王日寇松姿李朝霞孫飛
    合成生物學 2022年4期
    關鍵詞:活體凝膠蛋白質

    易琪昆,孫晨博,楊中光,王日,寇松姿,李朝霞,孫飛,

    (1香港科技大學化學及生物工程學系,中國香港 000000;2深圳灣實驗室粵港澳生物醫(yī)學創(chuàng)新中心,廣東 深圳 518000;3鹽城工學院海洋與生物工程學院,江蘇 鹽城 224000)

    點擊化學的靈感源于自然界生物分子的合成,著眼于化學反應的高效、選擇性與模塊化。自其問世以來[1],點擊化學,以銅催化的疊氮-炔基Husigen環(huán)加成反應為代表,發(fā)展成為一系列近乎“理想”的化學反應,開辟了以碳-雜原子鍵(C-XC)合成為基礎的組合化學新方法,進而簡單高效地獲得了結構的多樣性。點擊化學是顛覆性的[2],重塑了材料學、生物學等諸多領域。然而,當傳統(tǒng)的點擊化學應用于復雜生物系統(tǒng)時,通常需要對生物分子進行額外的化學修飾,以引入非天然官能團,而這些修飾往往難以在敏感的生物分子或者復雜的生命體系中實現(xiàn)。此外,由于缺乏有效的理性設計與快速的篩選工具,在傳統(tǒng)的化學空間里尋找新的點擊化學反應是極其困難的??上驳氖牵靡嬗诙ㄏ蜻M化與理性設計等蛋白質工程的手段,研究者已經能夠有效地探索生物分子(如天然氨基酸)序列空間,這為很多現(xiàn)實問題提供了新答案、新工具、新方法,包括尋找新的點擊化學。應用蛋白質工程開發(fā)新的化學反應目前已在合成生物學中蔚然成風。

    近年來革蘭氏陽性細菌黏附素中異肽鍵的發(fā)現(xiàn)推動了一系列基于多肽/蛋白質共價反應對的發(fā)展[3]。迄今為止,這些新的反應對包括第1代的pilin-C/isopeptag-C和pilin-N/isopeptag-N[4],后來被廣泛應用的諜化學[SpyTag/SpyCatcher,圖1(a)]及其正交版本SnoopTag/SnoopCatcher,優(yōu)化后的升級版本Spy002和Spy003[圖1(b)][5-9],非共價反應的SpyDock可逆系統(tǒng)[圖1(c)][10],以及三組分的反應體系SpyStapler/BDTag/SpyTag[圖1(d)][11]。因其特異且極穩(wěn)定的結合能力,這些反應對也被稱為“細菌超能膠”(bacterial superglue)[12-20]。以諜化學為例,這類蛋白質化學的獨特之處在于該反應集分子識別和自發(fā)的異肽鍵形成于一體,不僅具有傳統(tǒng)點擊化學的特征,包括快速的動力學、高產率、等摩爾配比、模塊化、化學選擇性和單一反應軌跡等,而且超越了其他常見的蛋白分子連接技術(如sortase、split intein等),能夠發(fā)生在蛋白分子的任意位點(N,C兩端或者中間),極大拓展了對蛋白分子的結構控制[21-23]。更重要的是,諜化學的底物完全由天然氨基酸構成,可實現(xiàn)基因編碼[21]。由此觀之,諜化學是一種近乎理想的蛋白質-多肽反應對,既有點擊化學的基本特征又可以在基因層面進行編碼。因此,諜化學是一種可基因編碼點擊化學(genetically encoded click chemistry,GECC)。

    圖1 可基因編碼點擊化學(GECC)概覽(a)代表性的可基因編碼點擊化學——諜化學(SpyTag/SpyCatcher chemistry)。伴隨著SpyTag與SpyCatcher的特異性的分子識別與結合,天冬氨酸與賴氨酸的側鏈自發(fā)形成異肽鍵[5-7]。SpyTag/SpyCatcher復合物結構的PDB編號為4MLI。(b)諜化學及其優(yōu)化版本(Spy002與Spy003)的二級反應動力學常數(shù)[8,9]。(c)無異肽鍵的SpyTag/SpyDock可逆反應體系[10]。SpyDock為SpyCatcher-E77A突變體,失去了形成異肽鍵的能力。(d)三組分SpyStapler/SpyTag/BDTag反應體系及其二級反應動力學常數(shù)[11]Fig.1 Overview of genetically encoded click chemistry(GECC)(a)SpyChemistry(SpyTag/SpyCatcher Chemistry),a representative GECC.The side chains of aspartic acid and lysine spontaneously form isopeptide bond when SpyTag and SpyCatcher specifically recognize and react with each other[5-7].PDB ID of SpyTag/SpyCatcher complex:4MLI.(b)Second order reaction kinetic constants of SpyChemistry and its optimized systems(Spy002 and Spy003)[8-9].(c)Reversible SpyTag/SpyDock system without isopeptide bond[10].SpyDock is the E77A mutant of SpyCatcher,which loses the ability to form isopeptide bond.(d)Three-component SpyStapler/SpyTag/BDTag reaction system and its second order reaction kinetic constant[11].

    伴隨著合成生物學的發(fā)展,材料學科亦迎來了新機遇。作為合成生物學的一個新的分支,材料合成生物學有望從根本上改變人類對新材料的開發(fā)與獲取方式。在此過程中,以GECC為代表的新的蛋白質化學已經并將持續(xù)為材料合成生物學提供有力的工具[11-12,19,24]。此文將著重闡述GECC在材料合成生物學中的已知應用,并探討可能的新發(fā)展。

    1 可基因編碼點擊化學與蛋白質拓撲工程

    與傳統(tǒng)化學合成相比,大分子的生物合成有如下優(yōu)勢:①能夠對大分子的尺寸、序列及立體化學實現(xiàn)精確控制;②可利用自然進化的成果,引入天然的蛋白質序列,實現(xiàn)生物功能;③可借助定向進化等手段進行優(yōu)化。然而生物合成并不完美:從拓撲結構上看,中心法則中的3類生物大分子DNA、RNA與蛋白質多是線性大分子。雖然很多RNA與蛋白質可通過折疊形成三維結構,但本質上仍為線性大分子。學術界面臨的一個根本問題便是:能否利用生物體系精確地合成非線性的大分子?若能實現(xiàn)這一點,便有望拓展蛋白質工程,發(fā)展新的生物材料,并為生物學研究提供新的思路。

    天然蛋白質多為線性分子,即氨基酸從N端到C端依次通過肽鍵連接起來,而不會產生分支、閉環(huán)甚至更高等級的復雜拓撲結構。但自然進化仍然產生了少量具有非線性結構的蛋白質分子,比如環(huán)形的細菌素AS-48和防御素RTD-1、打結型的甲基轉移酶YbeA和泛素羧基末端水解酶UCH-L3、索烴型的二硫化碳水解酶、嗜氣桿菌檸檬酸合成酶等等[25-30]。這些拓撲結構對于蛋白質的熱穩(wěn)定性、蛋白酶抗性、機械穩(wěn)定性等具有重要的意義,因此,通過拓撲工程改變蛋白質性質逐漸成為蛋白質工程的一個新的維度。

    一直以來,蛋白質拓撲工程依賴于有限的幾種工具,包括內含肽、轉肽酶以及蝶豆黏酶等[31-33]。但是這些工具能夠實現(xiàn)的拓撲結構極其有限,且轉化率和反應速率不高,這大大限制了蛋白質拓撲工程的應用范圍。GECC作為一種模塊化的快速蛋白質偶聯(lián)方法,亦可作為蛋白質拓撲工程的工具。近年來,通過GECC構建具有高級拓撲結構蛋白質的研究層出不窮。例如將SpyTag和SpyCatcher對應的基因插入到彈性蛋白ELP(elastin-like polypeptide)的基因中,構建了多種非線性的蛋白分子,包括分支狀、H型、環(huán)型、蝌蚪型等多種拓撲結構(圖2)[34]。Zhang等[21]在此基礎上,進一步插入了能夠相互交叉形成二聚體的p53結構域,令大腸桿菌表達SpyTagp53-SpyCatcher重組蛋白并在細胞內互相反應,高產率地得到多種具有不同拓撲結構的蛋白質索烴。

    圖2 蛋白質拓撲結構的控制Fig.2 Controlling the protein topological structures

    在構建多種復雜拓撲結構的基礎上,蛋白質拓撲工程能夠進一步優(yōu)化蛋白質功能。Howarth等[35]將SpyTag和SpyCatcher分別放置于β-內酰胺酶的N端和C端,通過控制蛋白的表達條件可以直接獲得環(huán)化的β-內酰胺酶。經過環(huán)化,在酶活性幾乎不發(fā)生改變的同時,β-內酰胺酶能夠耐受100℃的高溫,相較于野生型的37℃有了顯著提升。對于二氫葉酸還原酶、苯丙氨酸脫氫酶、海藻糖合成酶等,SpyTag/SpyCatcher介導的環(huán)化有相似的效果[35-37]。除了熱穩(wěn)定性,這種環(huán)化策略對于蛋白的化學穩(wěn)定性、蛋白酶抗性等亦有顯著提升。在SpyTag/SpyCatcher和p53介導的蛋白索烴的構建中,研究人員在基因中插入了二氫葉酸還原酶,使得生成的索烴相套兩環(huán)中各有一個。這樣的構造使得酶熔化溫度提升了4℃,并將催化效率提升了27%,顯著高于線性酶和環(huán)化酶,證明了索烴結構對于酶學性質的重要影響[12]。利用相似的策略,Zheng等[38]將工業(yè)用耐熱γ-lactamase的活性提高了1.8~2.4倍,說明該技術具有很強的實用價值。

    綜上所述,利用GECC技術,不僅能夠方便快捷地創(chuàng)造非天然拓撲形式的功能蛋白,還能借此調節(jié)分子的性質,優(yōu)化其功能??梢姡S著GECC工具包的拓展,對于蛋白質多樣化拓撲結構的構造與性質研究亦會獲得明顯助益。

    2 可基因編碼點擊化學與全蛋白水凝膠材料

    水凝膠是具有極高含水量的親水聚合物分子網絡,其存在由聚合物鏈之間的交聯(lián)作用與分子網絡在溶液中的溶解過程所達成的微妙平衡所維持[39-40]。由于可高度模擬天然細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的生物物理特性,水凝膠被視為生物大分子和干細胞的理想載體,有著諸多生物醫(yī)學應用,包括組織工程、干細胞療法和藥物遞送等,極具發(fā)展前景[41-43]。

    化學合成的水凝膠材料雖然易得,但是受限于生物活性的匱乏[43-44]。利用蛋白質來構建具有生物活性的水凝膠有望將生物分子多樣性、生物活性與可工程優(yōu)化(定向進化)等優(yōu)勢充分整合到聚合物學科中[45]。蛋白質的性質(包括其高級結構、穩(wěn)定性和生物功能)基本由其氨基酸序列決定,因而利用蛋白質構建的水凝膠材料可通過基因編碼實現(xiàn)對其生化和機械性能的調控,這一優(yōu)勢令全蛋白水凝膠相較大多數(shù)天然和合成生物材料更具有吸引力[46]。

    可基因編碼點擊化學(GECC)無須借助任何化學修飾力量,便可在溫和條件下實現(xiàn)蛋白質的共價組裝,進而形成穩(wěn)定的分子網絡。基于GECC的共價組裝技術相較于其他基于分子的物理相互作用或者酶促反應構建的蛋白水凝膠具有更加穩(wěn)定高效的優(yōu)勢[33,47]。利用GECC設計蛋白網絡可以通過基因編碼引入各種天然甚至“從頭設計”(de novodesign)的功能蛋白或多肽序列[48],從而實現(xiàn)了將功能從分子層面到宏觀材料層面的無損轉移[49-56]。

    作為蛋白質拓撲工程的一個延伸性應用,Sun等利用GECC合成了具有生物活性的全蛋白分子網絡——“諜網絡”(spy network)[圖3(a)][49],并以此為靈感進一步構建了各類智能響應的全蛋白質水凝膠材料[52]。

    圖3 利用GECC構建全蛋白水凝膠材料LIF—白血病抑制因子;A-LIF-A—SpyTag-ELP-LIF-ELP-SpyTagFig.3 Development of entirely protein-based hydrogels based on GECC(Adapted from Ref.49 with permission from National Academy of Sciences,copyright 2014.)LIF—Leukemia inhibitory factor;A-LIF-A—SpyTag-ELP-LIF-LEP-SpyTag

    “諜網絡”由含有多個GECC反應基團的重組蛋 白 如SpyTag-ELP-SpyTag-ELP-SpyTag(AAA)和SpyCatcher-ELP-SpyCatcher(BB)自組裝形成,并且可以通過基因工程引入各種具有生物活性的蛋白序列,包括細胞結合配體Arg-Gly-Asp(RGD),幫助細胞進行對細胞外基質(ECM)重塑的金屬蛋白酶(MMP)識別位點,以及用于維持干細胞多能性(pluripotency)的白血病抑制因子(LIF)。Gao等[56]利用相似的原理將一種球狀蛋白(GB1)共價交聯(lián)成分子網絡,獲得了具有高機械強度的生物相容的水凝膠材料,并用于細胞的3D培養(yǎng)。

    GECC還被用于構建智能水凝膠。Wang等[52]利用諜化學組裝光響應蛋白CarHC,構建了一類依賴B12的光響應全蛋白水凝膠[圖4(a)]。CarH是細菌內控制類胡蘿卜素合成的光敏轉錄調控因子,其C端結構域(CarHC)在黑暗條件下與AdoB12結合并形成四聚體,在綠光下隨著AdoB12的光解而分解成單體[57-59]。通過重組蛋白質SpyTag-ELPCarHC-ELP-SpyTag(ACA)和SpyCatcher-ELP-CarHCELP-SpyCatcher(BCB)的等當量混合所得的線性聚合物(溶液),能夠在AdoB12誘導下快速組裝形成水凝膠(固體),實現(xiàn)液固相變;在光照下,CarHC四聚體解離,繼而經歷快速的固液相變[52]。Luo等[60-61]則利用了生物體系中普遍存在的鈣調蛋白(CaM)與其結合肽(M13)構建鈣離子響應的蛋白質水凝膠。在CaM、Ca2+的誘導下,從富含helix的閉合結構變?yōu)閱♀彔罱Y構,進而與其配體M13結合[62]。受此啟發(fā),該研究利用 諜化學將CaM/M13直接組裝成了聚合物,成功構建了Ca2+依賴、具有可控黏彈性(viscoelasticity)和應力松弛行為(stress relaxation)的動態(tài)水凝膠。Yang等[55]則利用綠色熒光蛋白裂分片段(splitGFP)的自主重構直接在大腸桿菌細胞內合成了一種四臂星狀蛋白——(SpyCatcher)4GFP。這一星狀蛋白可通過諜化學進一步共價組裝成具有規(guī)整空間結構的分子網絡。

    圖4 利用GECC制備“智能”光響應水凝膠(a)利用諜化學將CarHc組裝成線性聚合物,后者在黑暗條件下經歷AdoB12誘導的液固相變與光誘導的固液相變。(b)光誘導的細胞釋放。3T3—成纖維細胞;hMSCs—人間充質干細胞。Fig.4 Development of smart photo-responsive hydrogel based on GECC Adapted from Ref.52 with permission from National Academy of Sciences,copyright 2017.(a)Constructing CarHc into linear polymer utilizing SpyChemistry,which can undergo liquid-to-solid phase transition induced by AdoB12,and solid-to-liquid phase transition induced by light.(b)Photo-induced release of 3T3 cells or hMSCs.

    由于在可基因編碼性(genetic programmability)和生物功能化(biofunctionalization)方面的優(yōu)勢,上述基于GECC的全蛋白水凝膠在細胞三維培養(yǎng)和組織工程等領域中有巨大的應用前景。上文提到的Spy network水凝膠,經過白血病抑制因子(LIF)修飾后,可用于小鼠胚胎干細胞(mESC)的三維培養(yǎng)并且能夠維持其多能性[圖3(b)][49]??蒲腥藛T也利用GECC以成膠后修飾的方式將LIF整合到全蛋白水凝膠中,后者作為激活JAK/STAT3通路的關鍵細胞因子,可以促進神經元的軸突生長[53,63]。

    目前面臨細胞三維培養(yǎng)的一個關鍵挑戰(zhàn)便是如何從培養(yǎng)基質中回收并傳代細胞。盡管不少水凝膠都可以用于細胞三維培養(yǎng),卻無法實現(xiàn)細胞的有效釋放與回收。Wang等[52]合成的CarHC水凝膠在B12的誘導下可以完成快速的液固相變,從而實現(xiàn)對3T3成纖維細胞和人間充質干細胞(hMSCs)的三維封裝;在三維培養(yǎng)之后,這些水凝膠可在白光或綠光照射下迅速液化,釋放這些細胞,而且釋放后的細胞擁有良好的存活率[圖4(b)]。該體系是為數(shù)不多的能夠實現(xiàn)多代細胞三維培養(yǎng)及無害轉移的體系。

    具有可控藥物遞送能力的水凝膠,尤其是由具有高時空精度和低侵害特性的光響應水凝膠,在生物醫(yī)學領域有較高需求[63-64]。Yang等[55]利用GECC合成了四臂星狀蛋白(CarHC)4GFP,后者所具備的可控相變行為,包括AdoB12誘導的液固相變和光誘導的固液相變,被用于生物被膜降解酶PslG的封裝和光控釋放。該體系可以有效抑制細菌生物被膜的形成,有望用來對抗由多重耐藥細菌病原體引起的慢性感染。Jiang等[65]以CarHC為基元設計了另外一種可注射的光響應全蛋白水凝膠。研究者利用金屬離子(Zn2+/His6-tag的配位以及AdoB12誘導的CarHC四聚這兩種反應機理構建水凝膠網絡。該體系兼具了可注射(源自物理交聯(lián))與光響應(源自CarHC)這兩個主要特性。該體系,作為LIF的載體,被注射到小鼠視神經的缺損位置,可以長期激活JAK/STAT3信號傳導,并增強軸突再生,驗證了其在藥物遞送和神經再生等領域的應用潛力。

    由于其優(yōu)異的止血與傷口閉合效果,防水生物黏合劑被視為外科手術中傳統(tǒng)縫合線和縫合釘?shù)睦硐胩娲罚?6-67]。常用的生物黏合劑如合成聚合物(例如聚氰基丙烯酸酯[68]和PEG[67])或生物大分子(例如纖維蛋白[69]、明膠[70]或多糖[71])具有降解性差、毒性高、引起炎癥和組織壞死可能性高等風險。具有高生物相容性的防水蛋白黏合劑原則上可以規(guī)避這些缺陷。自然界的貽貝足蛋白(Mfp)是海洋貽貝(Mytilus edulis)實現(xiàn)水下黏附的主要原因,其分子機制啟發(fā)了眾多涂層和黏合劑材料的開發(fā)[72-73]。Sun課題組利用重組抗生素鏈霉菌酪氨酸酶(Streptomyces antibioticustyrosinase)[74]對重組貽貝足蛋白Mfp3或者具有Mfp序列特征的多肽進行氧化修飾,進而合成了具有水下黏合能力的全蛋白水凝膠[75-76]。這些材料具有強防水黏合和高細胞相容性的特點,同時這些材料含有SpyTag或SpyCatcher等反應基元,因此可以通過GECC以成膠后修飾的形式將具有生物活性的蛋白分子整合到材料之中。

    蛋白質材料也為能源與環(huán)境問題的解決提供了新的思路。在這個亟需替代能源的時代,核裂變在可預見的將來依然是低碳能源的主要來源。迄今為止,幾乎所有的鈾燃料都來自陸地開采。然而陸地鈾礦儲量有限,并非取之不盡,而且當前的采礦工藝對環(huán)境的破壞巨大。另一方面,海洋中的鈾儲量巨大,為陸地儲量的1000倍。但海水鈾(UO2+2)的絕對濃度極低(約14 nmol/L),加上海水中大量的鈣鎂及碳酸根離子,使得大規(guī)模低成本提取海水鈾的設想依舊停留在理論或小規(guī)模的試驗階段[77]。自然進化與蛋白質工程技術已經提供了各類特異的金屬離子結合蛋白,但是這些蛋白的應用常常受限于穩(wěn)定性差、成本高、可擴展性差等缺點[78]。將這些蛋白組裝成宏觀材料可以提高蛋白分子的穩(wěn)定性,實現(xiàn)重復使用,進而降低成本。Kou等[51]利用GECC將重組超級鈾酰結合蛋白(SUP)——一種對鈾具有飛摩爾級別結合能力的金屬蛋白——及其優(yōu)化的突變體SUP-E64D[79]共價組裝成全蛋白水凝膠材料,并利用微流體裝置制造了單分散的SUP水凝膠微珠,成功從海水中提取UO2+2(圖5)。類似的分離技術也可以擴展至重金屬離子的去除等其他環(huán)境問題[80]。Kou等[51]將鉬酸鹽/鉻酸鹽結合蛋白ModA共價組裝成分子網絡,用于去除自來水中的污染物之一——鉻酸鹽。

    圖5 利用GECC合成重金屬結合蛋白水凝膠(a)超級鈾酰吸附蛋白材料與鉻酸根吸附蛋白材料的合成。(b)SUP水凝膠與擁有更強鈾酰結合能力的突變體SUP(E64D)水凝膠從天然海水中富集鈾元素。富集指數(shù)是指富集后蛋白材料中鈾的濃度與水體中鈾的濃度的比值。(c)ModA水凝膠去除自來水樣品中的鉻酸鹽。去除比例是指吸附后水體中鉻酸鹽的減少比例。去除效率是指蛋白材料吸附鉻酸鹽的實際質量與理論上最大可能質量的比例Fig.5 Applying GECC to develop heavy-metal binding protein hydrogel Adapted from Ref.51 with permission from The Royal Society of Chemistry,copyright 2017.(a)Synthesis of super uranyl-binding protein(SUP)materials and chromate-binding protein materials.(b)Uranium extraction from seawater using the hydrogels comprising SUP or its mutant,SUP-E64D,which exhibits stronger uranyl binding.Enrichment index was calculated as the ratio of uranium concentration in protien material to that in water body after enrichment.(c)Removal of chromate from tap water using ModA hydrogels.Removal percentage was calculated as the reduced percentage of chromate in water body after removal.Removal efficiency was calculated as the ratio of the actual amount of chromate absorbed by the material to the theoretical maximum by the material.

    3 可基因編碼點擊化學與合成疫苗

    疫苗依賴于機體的免疫系統(tǒng)來識別外源蛋白從而產生免疫應答,并通過產生獲得性免疫來抵御真正病原體的入侵。100多年來,疫苗的誕生已經拯救了無數(shù)生命。但是傳統(tǒng)的滅活或者減毒活疫苗在生物安全性上依舊不夠完美,而且其研發(fā)與生產工藝較為緩慢。隨著氣候變化、生態(tài)變遷、人口增長,人類面臨越來越多的大流行疾病的威脅??紤]到病原體的進化速度之快,人類必須能夠迅速開發(fā)出更加高效安全的新型疫苗。相比于傳統(tǒng)的滅活或者減毒活疫苗,由高度純化的抗原蛋白基元合成的現(xiàn)代疫苗更加安全,但是其誘導保護性免疫的效果較低[81-82]。為了提高合成疫苗的保護效果,研究者致力于發(fā)展相對安全的類病毒顆粒(virus-like particle,VLP),后者表面可以有效結合并有序展示相應的抗原,以模擬病原體、提高免疫原性[83-84]。一些病毒或非病毒來源的天然蛋白或者人工設計的蛋白分子可自組裝成納米顆粒,且具有高度對稱性與穩(wěn)定性,直徑為10~150 nm,適合作為類病毒疫苗載體[18]。而如何在這些納米顆粒表面以可控且可靠的方式連接抗原蛋白便成了一大技術難點。利用傳統(tǒng)重組DNA技術直接合成融合蛋白可能會影響抗原蛋白的折疊或者VLP有效組裝[85]。另一種途徑便是以天然的或工程化的蛋白質納米顆粒作為支架,將異源表達的抗原通過GECC等蛋白共價組裝技術添加到蛋白質納米顆粒上。這種模塊化的策略可作為一個強大的合成疫苗“工具包”,實現(xiàn)含有多種單抗原甚至組合抗原的VLP的設計與合成。

    首先針對瘧疾的疫苗研發(fā),Brune等[86]利用大腸桿菌表達了一類重組噬菌體蛋白,后者可自組裝形成類病毒顆粒(VLP)。研究者進一步利用諜化學將瘧疾抗原蛋白共價連接到VLP表面,并證明了這些修飾后的類病毒顆粒經一次注射后便可以有效誘導小鼠的抗體響應,顯示了這種簡單、高效、模塊化的疫苗合成策略的可行性[87-90]。Brune等[91]還同時利用兩種正交的GECC反應對SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher將 多抗原與VLP進行連接。同時展示兩種瘧疾抗原Pfs25和Pfs2可以增強小鼠體內抗體響應,效果好于單一抗原體系。這種基于GECC的多抗原展示平臺有望為抗擊瘧疾和其他傳染性疾病提供有力武器[圖6(a)]。最近,純理性設計的基于Mi3的多孔十二面體蛋白質納米顆粒[92]也被應用于合成疫苗的設計,Brune等將SpyCatcher展示于納米顆粒表面,并通過諜化學與抗原蛋白連接[圖6(b)],結果證實該種完全計算設計的蛋白質納米顆粒疫苗亦能引起較強的抗體響應。計算設計出的形成納米籠的蛋白(包括Mi3)通常在組成、結構和折疊方式方面會有所不同,繼而會影響其表面所展示抗原的空間位置、方向與數(shù)量,而這些因素會共同影響合成疫苗的免疫原性,因此疫苗的設計與優(yōu)化需要考慮這些因素[93]。

    圖6 GECC在重組蛋白質疫苗中的應用Fig.6 Application of GECC in recombinant protein vaccines Adapted from Ref.91,92 and 98 with permissions.

    利用腫瘤新生抗原發(fā)展個體化治療性疫苗是腫瘤免疫療法的重要方向之一。而相關疫苗設計的關鍵在于快速鑒別獲取新抗原并實現(xiàn)在疫苗顆粒表面的有效展示。Wang等[94]利用鐵蛋白(ferritin)納米顆粒來作為腫瘤抗原的載體,其表面通過GECC得以展示特異性腫瘤抗原。修飾后的鐵蛋白納米顆??裳杆俦涣馨徒Y并靶向樹突狀細胞識別,進而產生特異的免疫T細胞響應。該成果展示了基于GECC的合成疫苗平臺在個性化腫瘤免疫療法這一領域的巨大潛力。

    始于2019年末的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)已造成席卷全球的疫情大流行,各類疫苗包括全蛋白的合成疫苗已成為人類應對這場公共健康危機的有力武器。目前已有不少基于GECC的新冠疫苗的設計與研究,在此做一些簡單的總結。

    利用GECC可以實現(xiàn)快速多樣的疫苗設計與合成,以應對SARS-CoV2的不斷突變。天然的二氧四氫蝶啶合酶(lumazine synthase,LuS)和鐵蛋白ferritin可分別自組裝成60聚體和24聚體的納米顆粒[95],Zhang等利用此特點,構建了帶有SpyTag的LuS和ferritin納米顆粒。這些納米顆粒進一步與融合了SpyCatcher的SARS-CoV-2抗原——刺突糖蛋白受體結合區(qū)域(spike glycoprotein RBD)——共價結合。最終生成的全蛋白合成疫苗在體內能夠引起非常強的中和抗體反應,為對照組(未經修飾的S蛋白)的約25倍。Kang等[96]則利用諜化學同時構建了3類蛋白質納米顆粒候選疫苗,包括RBD-ferritin(24聚體)、RBD-Mi3(60聚體)和RBD-I53-50(120聚體)。研究結果顯示所得這些設計在小鼠體內引起的中和抗體活性比單體RBD高8~120倍,而且所產生的小鼠血清在體外能有效阻斷RBD與人體細胞表面受體ACE2的結合。Ma等[97]開發(fā)了另一類合成疫苗。他們通過諜化學將SARS-CoV-2的受體結合區(qū)域(RBD)和七肽重復區(qū)(HR)連接到了鐵蛋白納米顆粒上。接種此疫苗后,感染了SARS-CoV-2的轉基因小鼠的肺部病毒載量顯著降低。整合了RBD或RBD-HR的疫苗在小鼠上同時引起了中和抗體響應與較強的T細胞免疫響應。RBD-HR疫苗更是引起了針對其他冠狀病毒的交叉免疫響應?;诤愫雍锏幕铙w實驗進一步證實此種疫苗產生持續(xù)(3個月以上)免疫響應的能力(包括中和抗體響應與T細胞響應等)。這些結果進一步證實了GECC是實現(xiàn)快速多樣的構建疫苗的有效工具。除了當前的SARSCoV2,自然界冠狀病毒的種類紛繁,宿主多樣,因而人類必將持續(xù)面對這類病毒的威脅。理想的疫苗應當能夠保護人體免于多種冠狀病毒的侵染。Cohen等[98]利用GECC將多種冠狀病毒(包括SARS-CoV-2和一些寄生于動物的β-冠狀病毒)的RBD連接到Mi3蛋白納米顆粒上,構建了原則上可以針對數(shù)種冠狀病毒的普適疫苗。這類多抗原的組合疫苗在小鼠體內產生的抗體響應可識別多種異源RBD,中和抗體效應也有所增強。該方法表明這種含多抗原的組合體合成疫苗策略有望應對現(xiàn)有的和潛在的冠狀病毒對公共健康的威脅[圖6(c)]。值得注意的是,該課題組[99]用類似的方法將8種來自流感病毒的血球凝集素蛋白(hemagglutinin,HA)整合到疫苗顆粒表面,所產生的多抗原組合體相較于同抗原納米顆粒的混合物并不能更有效地引起免疫反應,這結果表明多抗原組合體疫苗的設計策略的普適性還需進一步提高。

    新冠疫情的全球蔓延為疫苗的貯存運輸分配帶來了巨大挑戰(zhàn),尤其是在發(fā)展中國家、基礎設施薄弱及偏遠地區(qū),這對疫苗的穩(wěn)定性及可靠度提出了新的要求。Tan等[100-101]利用了第3代諜化學Spy003在Mi3蛋白納米顆粒表面實現(xiàn)了對不同對稱性的抗原(包括S蛋白RBD)的展示。所產生的蛋白納米顆粒顯示了更特異的免疫原性,而且耐高溫、抗凍,有望在實際應用中可減少對冷鏈的依賴。

    4 可基因編碼點擊化學與工程活體材料

    自然界中的生命體能夠通過基因編碼的方式發(fā)展出多種不同尺度、不同功能的生物復合材料,例如木質纖維、貝殼、肌肉組織,這類材料能幫助生命體適應外部環(huán)境的變化,并對外界刺激做出響應,同時往往還具有自我修復的能力。受此啟發(fā),“工程活體材料”(engineered living material,ELM)這一概念被提出,并在近年有了廣泛的研究發(fā)展。在工程活體材料中,活體細胞(如細菌、真菌、哺乳動物細胞)作為主體,通過產生不同類型的生物大分子聚合物(如蛋白質、纖維素),或者通過與外加的高分子、微?;蚱渌羌芊磻?,自組裝形成更大規(guī)模的材料[102-105]。相較于傳統(tǒng)材料,工程活體材料不僅能人為機械控制其組裝過程和材料的拓撲形態(tài),還能通過活體細胞基因表達這一高穩(wěn)健性的方式進行自我調節(jié);同樣的通過基因編輯的方式,工程活體材料能對特定的外界刺激進行動態(tài)響應,或表現(xiàn)出特定的生物功能;活體細胞的存在也給予了工程活體材料自我修復、自我生長的特性[圖7(a)][102,106]?;谶@些特點,工程活體材料在生物傳感、生物催化、藥物釋放等領域均有建樹[107-109]。

    GECC因其高共價鍵強度、高效率、高度特異性,在工程活體材料的發(fā)展中被廣泛運用。大腸桿菌curli生物被膜是一種常見的工程活體材料,主要通過基因工程使大腸桿菌分泌淀粉樣蛋白CsgA,并以此為基元互相連接形成,一般通過對CsgA蛋白的修飾來改變材料的性能。然而,研究表明CsgA蛋白與大于260個氨基酸的蛋白融合表達會嚴重影響生物被膜的形成[110]。Joshi等[111-112]將SpyTag基因插入淀粉樣蛋白CsgA基因中,使SpyTag在不影響CsgA蛋白功能的前提下融合,并共表達在生物被膜上,同時將SpyCatcher與功能蛋白融合,再利用這一特異性點擊反應,將功能蛋白固定在生物被膜上,通過基因編輯的方式成功實現(xiàn)了對生物被膜的功能控制,并將多種酶固定在生物薄膜上以用于生物催化[圖7(b)]。Chen等[113]則在此基礎上將SpyCatcher與金納米顆?;蛄孔狱c融合,制作出具有良好導電效應的生物被膜納米電子元件。利用GECC對生物被膜進行功能化修飾已經成為一種普適的方法。

    圖7 GECC與工程活體材料(a)工程活體材料的特點[102]。(b)利用GECC修飾大腸桿菌生物被膜[111]。(c)利用GECC修飾新月柄桿菌表層蛋白晶格。左圖:原子力顯微鏡下修飾有SpyTag的新月柄桿菌表層蛋白晶格結構,比例尺40 nm;右圖:用SpyCatcher-mRFP1熒光蛋白特異性標記的含SpyTag的新月柄桿菌材料,比例尺3 μm[114]Fig.7 GECC and engineered living materials(a)Features of engineered living materials.(b)Decoration of E.coli biofilm via GECC.(c)Decoration of 2D hexameric protein lattice(S-layer)on the surface of C.crescentus via GECC.Left:SpyTagged S-layer visualized by AFM.Scale bar:40 nm.Right:the C.crescentus material labelled with SpyCatcher-mRFP1 imaged via fluorescence microscopy.Scale bar:3 μm.

    新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)的表層是由RsaA蛋白組成的高度有序二維晶格結構,每個細菌表面約有450 000個晶胞,加之其相較大腸桿菌的低內毒素水平和致病性,是一種潛在的高密度生物功能材料基底。Charrier等[114]通過基因編輯,將SpyTag插入到RsaA中,使其展示在新月柄桿菌的表面,再利用GECC對其進行功能化修飾,從而制成了一種具有二維高度有序結構的工程活體材料。這種材料可被含有SpyCatcher的熒光蛋白特異性標記[圖7(c)]。此外,他們還發(fā)現(xiàn)通過將SpyTag插入到RsaA蛋白的不同位點,得到的細菌與SpyCatcher的反應率不同,由此可以證明該材料的功能化程度可以通過基因控制的方法實現(xiàn)。

    在此基礎上,Orozco-Hidalgo等[115]發(fā)展出了一種可自組裝并自封裝的工程活體材料。他們通過基因編輯改造了一種新月柄桿菌,使其表達并分泌與SpyCatcher融合的ELP蛋白,產率高達60 mg/L,再將這種桿菌與表面有SpyTag的桿菌混合,SpyCacher-ELP蛋白會與SpyTag反應形成三維網狀結構,最終形成黏附在桿菌外表面的水凝膠,并將桿菌封裝在其中。這種合成的細胞外基質不僅具有極高的表達效率和良好的機械強度,同時能通過GECC對其進一步功能化。

    傳統(tǒng)的生物制造工業(yè)往往只能進行大批量生產,且需要多種復雜的設備協(xié)作,在物流、技術人員等方面也有各種限制。為了彌補這些不足,Dai等[116]發(fā)展了一種基于刺激相應的細胞-材料反饋的通用的生物制造技術,他們將基因編輯過的可產生目的產物的大腸桿菌包裹在天然殼聚糖膠囊中進行培養(yǎng),當大腸桿菌在膠囊中的局部濃度足夠高時,它們會自動發(fā)生局部自裂解,釋放目的小分子或蛋白;培養(yǎng)過程中的環(huán)境變化會導致膠囊體積改變,產生擠壓效應,促進目的產物轉運到膠囊外部,而大腸桿菌仍留在內部;最后,通過補充營養(yǎng)物質,能重置膠囊內部環(huán)境條件,使大腸桿菌數(shù)量恢復[圖8(a)]。通過這種思路,構建了一種用于生產的微生物群機器人平臺,是一種可以模塊化的工程活體材料。用這種方法合成酶可以直接與后續(xù)的模塊一起,流水線化進行定量的酶活性檢測。他們以修飾有SpyTag的mCherry和融合了SpyCatcher的GFP為例,令平臺同時生產這兩種蛋白,隨著蛋白被排出膠囊,進入監(jiān)測單元,兩種熒光蛋白會因點擊化學而相互結合,產生熒光共振能量轉移信號(FRET),而在監(jiān)測單元中被定量測定其活性[圖8(b)]。

    圖8 基于GECC的智能化平臺Fig.8 Smart production platform enabled by GECC.

    基于這種工程活體材料,他們發(fā)展了一種新的互穿插的聚合物網絡結構[117]。通過基因編輯讓上述大腸桿菌表達含有多個SpyTag或SpyCatcher的類彈性蛋白多肽(elastin-like protein,ELP),以此作為單體;將兩種大腸桿菌在高聚物膠囊中共同培養(yǎng),隨著大腸桿菌的自裂解,兩種單體釋放到膠囊中,通過點擊化學反應自組裝成穿插在膠囊內的高分子網狀結構[圖8(c)]。這種工程活體材料有更強的機械性能,且可以通過基因編輯在ELP上融合更多功能蛋白,賦予其更多功能。通過將β-內酰胺酶加入體系中,這種膠囊可以幫助降解小鼠腸胃內積累的多余的內酰胺抗生素,減少使用內酰胺時對腸道微生物群的擾動。

    直接以GECC連接細胞的方式構筑工程活體材料的研究也有所進展。Kozlowski等[118]通過基因編輯,在大腸桿菌表面分別表達了SpyTag和SpyCatcher蛋白,再將這兩種細菌混合,通過點擊反應使其自然相互結合、聚集成網狀結構材料[圖9(a)]。通過讓大腸桿菌同時在體內表達不同的熒光蛋白,可以對這兩種大腸桿菌在聚集體中的分布進行準確的定位。而通過控制兩種大腸桿菌的混合比例及順序,可以合成殼層結構的聚集體[圖9(b)]。作者推測形成的聚集體大小與大腸桿菌表面表達的蛋白數(shù)量有關,于是通過基因編輯減少了近4倍的蛋白表達并通過免疫染色等方法驗證,隨后用這些新編碼過的大腸桿菌自組裝成聚集體,發(fā)現(xiàn)聚集體的體積減少了近1個數(shù)量級,證明可以通過控制蛋白表達的方式對聚集體的大小進行控制。最后,通過引入哈維弧菌(Vibrio harveyi)的群聚感應系統(tǒng)LuxR-LuxI到這種工程化大腸桿菌中,該系統(tǒng)能夠被自誘導劑AHL激活進而表達特定基因,此處他們選擇mWasabi熒光蛋白作為報告基因[圖9(c)]。研究者們認為這種通過點擊化學形成的聚集體能夠使得自誘導劑AHL的局部濃度增加,進而不斷地激活這個系統(tǒng),促使細菌產生群聚感應效應,最終整個聚集體產生綠色熒光;而作為對照,當未表達SpyTag/SpyCatcher的大腸桿菌與外源性AHL混合時,僅少量細菌會產生熒光;該實驗證明這種材料能產生群聚感應效應,能自我調節(jié)基因表達。這種基于GECC的新型工程活體材料優(yōu)點眾多,尤其是其群聚感應特性,在全細胞生物催化等領域頗具潛力,而這種構建方法和思路也能推廣開來,用于發(fā)展基于其他微生物的工程活體材料。

    圖9 基于GECC自組裝的大腸桿菌活體材料及其特點(a)基于GECC自組裝的大腸桿菌活體材料示意圖[118]。(b)自組裝形成的殼層結構工程活體材料,比例尺100 μm。(c)基于SpyTag/SpyCatcher的組裝能夠激活細菌的群聚感應。AHL—N-Acyl-Homoserine Lactone,群聚感應(quorum sensing)的自誘導劑。群聚感應的報告基因為綠色熒光蛋白mWasabi。阿拉伯糖(L-Arabinose或者L-Ara)用于誘導SpyTag/SpyCatcher的表達。比例尺100 μmFig.9 GECC-based self-assembled E.coli living material and its features(a)Diagram of GECC-based self-assembled E.coli living material[118].(b)Self-assembled engineered living materials with core-shell structure,scale bar:100 μm.(c)Intercellular assembly enabled by Spy chemistry activates quorum sensing.AHL,N-Acyl-Homoserine Lactone,an autoinducer of quorum sening.The green fluorescent protein,mWasabi,served as a reporter of quorum sensing.L-Arabinose(L-Ara)was used to induce the expression of SpyTag and SpyCatcher.Scale bar:100 μm.

    5 展望與結論

    盡管GECC在合成生物學領域已經初露鋒芒,我們也需承認目前的GECC工具存在的不足。在諸如有機溶劑等變性環(huán)境下,蛋白質間的點擊反應將無法發(fā)生——不過目前GECC的主要應用領域均要求有高生物相容性,這一缺點暫可不計。在蛋白質拓撲工程的實踐中,研究者們發(fā)現(xiàn)目前的GECC反應效率略有不足(60%~90%),這一策略的動力學特性仍待優(yōu)化[23]。此外,有研究顯示SpyTag/SpyCatcher在細胞內進行反應時,反應程度通常會因為低效率而難以完全,這一問題可能需要優(yōu)化過的反應對如SpyTag003/SpyCather003來解決[119]。此外,還可以通過蛋白質工程進一步在反應多樣性、反應程度和與其他工具相結合的能力方面拓展和優(yōu)化。因此,蛋白質工程的相關研究和發(fā)展,包括從自然界中發(fā)現(xiàn)更多GECC基序以及賦予GECC更多的特征,都有助于解決現(xiàn)有的困境。

    GECC問世至今已迭代出多種不同的版本,我們也期待這一工具包的進一步拓展。原則上,基于異肽鍵的蛋白質化學只是其中一種方式,而GECC并不局限于此——任何高效特異的具有“點擊”特征的蛋白質或多肽的連接化學都將豐富這一概念。鑒于目前GECC多是基于自發(fā)形成異肽鍵的單一化學反應模式,而且缺乏信號響應等控制手段,Yang等[120]通過拆分B12/光響應蛋白CarHC,構建了一套全新的類GECC的蛋白質化學,實現(xiàn)了小分子B12和光誘導的高效特異的蛋白連接。其產物亦因雙組氨酸/鈷離子(Bis-His/Co)的絡合作用而極其穩(wěn)定。研究者進而合成了一系列智能響應的蛋白質水凝膠材料,展示了其在材料合成生物學中的應用。這種全新的蛋白質化學拓展了已有的GECC的設計范式,可作為GECC的一個重要補充。

    從廣義的合成化學角度來看,GECC可視為一種“信息編碼的化學反應”。有關其化學反應性的信息完全編碼在反應組分的序列中,通過鏈折疊和分子識別讀出,并通過自催化轉化為化學鍵。它代表了一種通過改變信息或特定序列來調整化學反應性的獨特方法。如果有關化學結構的信息可以以簡單直接的方式表示,我們認為這種反應控制模式可以擴展到更廣泛意義上的合成分子。例如,我們推測主客體化學(host-guest chemistry)和自催化鍵形成的結合可能會導致一種新的超分子相互作用模式,其中二級相互作用和化學鍵能夠相互加強[23],而這種相互作用模式能催生出更多具有全新性質的材料。

    擁有高特異性、強穩(wěn)定性、快反應速率、可編碼等特性,可基因編碼點擊化學(GECC)已經成為材料合成生物學的一個重要工具。大量基于GECC的合成生物學材料被設計發(fā)展并得到應用,以一種全新的體系為人類應對健康、能源、環(huán)境等領域的重大挑戰(zhàn)提供了新的思路。其中,利用GECC設計的重組疫苗更是為解決新冠肺炎疫情這一緊急公共衛(wèi)生事件添磚加瓦。在可預見的將來,強大的蛋白質工程手段如定向進化與理性設計等必將會生成更多的“完美”的蛋白質化學與生物組裝策略,繼而助力材料合成生物學以解決關乎國計民生的重大應用問題。

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