無(wú)細(xì)胞合成策略在生物材料研究中的應(yīng)用

吉博濤，錢志剛，夏小霞

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部代謝與發(fā)育科學(xué)國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

材料科學(xué)自20世紀(jì)60年代成為一門獨(dú)立的學(xué)科以來(lái)，就一直作為熱門的研究領(lǐng)域而受到大批研究者的青睞［1］。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，該學(xué)科的研究已經(jīng)從相對(duì)簡(jiǎn)單的陶瓷材料覆蓋到復(fù)雜的聚合物材料、半導(dǎo)體材料等。特別是近些年來(lái)，材料科學(xué)與其他學(xué)科的結(jié)合日益緊密，研究成果層出不窮。如何開(kāi)發(fā)新材料并改造它們的性能以造福人類，已經(jīng)成為全世界多個(gè)機(jī)構(gòu)所倡議的目標(biāo)［2］。然而，隨著人類對(duì)物質(zhì)需求的不斷增長(zhǎng)，全球環(huán)境問(wèn)題也日漸嚴(yán)峻：人類每年砍伐約150億棵樹(shù)［3］；對(duì)化石燃料的依賴度高達(dá)總能源的84%；二氧化碳的排放量連續(xù)4年創(chuàng)下歷史新高［4］；而全球海洋中仍有超過(guò)5萬(wàn)億個(gè)難以降解的塑料碎片在漂泊［5］。顯然，人類必須面對(duì)生產(chǎn)大量材料卻難以降解它們而帶來(lái)的不可逆轉(zhuǎn)的全球環(huán)境問(wèn)題［6］。

研究人員一直在為解決以上問(wèn)題而努力著。隨著基因工程的發(fā)展，低成本的基因合成及測(cè)序方法逐漸被開(kāi)發(fā)出來(lái)［7］，只有20多年歷史的合成生物學(xué)（也稱工程生物學(xué)）發(fā)展愈加迅猛。其中，合成生物學(xué)與材料科學(xué)相結(jié)合的材料合成生物學(xué)，作為一個(gè)可以緩解全球環(huán)境問(wèn)題的潛在解決方案，而備受人們的關(guān)注。材料合成生物學(xué)所研究的生物材料可以是可持續(xù)、可再生且可降解的［8］，例如PLA（polylactic acid，聚乳酸）可用作生物塑料，以減輕全球?qū)郾揭蚁┗蚓垡蚁┑然诨剂系木酆衔锊牧系倪^(guò)分依賴，使用后還可以作為家養(yǎng)植物的肥料，從而適當(dāng)緩解全球垃圾處理和化肥生產(chǎn)的壓力［9］；除此之外，生物材料憑借其優(yōu)異的生物相容性，被廣泛用于組織工程、醫(yī)療設(shè)備和制藥行業(yè)［10］，例如絲素與膠原等蛋白材料可以規(guī)避使用合成聚合物而造成的潛在免疫原性和毒性等缺點(diǎn)［11］。在未來(lái)，如何通過(guò)更創(chuàng)新的理念來(lái)設(shè)計(jì)細(xì)菌、真菌和無(wú)細(xì)胞策略以合成難以想象的新型材料，大家都在翹首以盼［12］。注意：嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)，生物材料并不完全等同于由生物系統(tǒng)合成的材料［13］，例如具有生物相容性的環(huán)烯烴共聚物（COC）、聚碳酸酯（PC）、聚醚酰亞胺（PEI）和醫(yī)用級(jí)聚氯乙烯（PVC）等醫(yī)用材料也稱為生物材料［14］。在本文中，生物材料特指由生物系統(tǒng)合成或與生物系統(tǒng)結(jié)合的材料。

生物系統(tǒng)的復(fù)雜性使其必須采用工程上設(shè)計(jì)周期的概念，即迭代地設(shè)計(jì)、構(gòu)建和測(cè)試生物系統(tǒng)［15-17］。但是，當(dāng)前的單元設(shè)計(jì)方法通常昂貴且費(fèi)時(shí)費(fèi)力［18］，相比之下，無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)則非常適合實(shí)現(xiàn)快速的設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試（DBT）循環(huán)［19］。此外，無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)還為生物材料的合成提供了多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)：①通過(guò)引入帶有新型側(cè)鏈基團(tuán)的非天然氨基酸（unnatural amino acids，UNAAs）來(lái)擴(kuò)展生物材料的功能［20］；②將輸入的資源集中于目標(biāo)產(chǎn)物的合成而無(wú)需維持活細(xì)胞的內(nèi)部代謝活動(dòng)，從而帶來(lái)更高的資源利用率［21］，且無(wú)需考慮產(chǎn)品和中間體可能帶來(lái)的細(xì)胞毒性［22］；③可以更精確地設(shè)計(jì)和控制系統(tǒng)組件，實(shí)現(xiàn)通路設(shè)計(jì)更大的系統(tǒng)性及靈活性；④無(wú)需破碎細(xì)胞膜，使產(chǎn)品純化更為簡(jiǎn)單；⑤選擇使用多種環(huán)境條件甚至是非生理環(huán)境進(jìn)行反應(yīng)，從而具有環(huán)境條件的高包容性。這些優(yōu)點(diǎn)使無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在生物材料的設(shè)計(jì)合成方面展現(xiàn)出引人注目的潛力［21］。

如今，無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)越來(lái)越多地被應(yīng)用于生物材料的開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。隨著文獻(xiàn)中示例的不斷增加，有理由相信生物材料將成為無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的下一個(gè)應(yīng)用前沿?；诖?，本文圍繞無(wú)細(xì)胞策略與材料結(jié)合這一主題，首先介紹無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)及其與傳統(tǒng)體系相比的優(yōu)劣勢(shì)；隨后展示無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與材料結(jié)合的多種創(chuàng)新型設(shè)計(jì)以及無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)賦予材料智能化及功能化的能力；其次列舉無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)用于加速新型生物材料開(kāi)發(fā)的優(yōu)勢(shì)；最后本文還將探討無(wú)細(xì)胞材料合成生物學(xué)的現(xiàn)有機(jī)遇及挑戰(zhàn)，并推測(cè)它們未來(lái)為材料合成生物學(xué)這一新興研究領(lǐng)域帶來(lái)的深遠(yuǎn)影響。

1 無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

作為一個(gè)新興的科學(xué)領(lǐng)域，合成生物學(xué)將來(lái)自生命世界的各種靈感與工程原理相結(jié)合，在醫(yī)學(xué)、生物制造和綠色化學(xué)等領(lǐng)域取得了很多值得肯定的成就［18，23］。然而細(xì)胞膜本身及其復(fù)雜的內(nèi)源代謝網(wǎng)絡(luò)帶來(lái)的壁壘性，也阻礙著合成生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展［18］。基于此，研究人員開(kāi)發(fā)了無(wú)細(xì)胞表達(dá)（CFE）系統(tǒng)，并希望其可以成為解決這些問(wèn)題的重要工具［24］。例如，Eduard Buchner［25］開(kāi)創(chuàng)性地使用酵母細(xì)胞提取物將糖轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳方面的成果已經(jīng)獲得諾貝爾獎(jiǎng)（1907年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）的肯定。之后，Nirenberg及其同事［26］通過(guò)使用大腸桿菌提取物發(fā)現(xiàn)了遺傳密碼子，也獲得了1968年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

CFE系統(tǒng)是一種使用細(xì)胞粗提物，而非完整活細(xì)胞進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的生物系統(tǒng)。因?yàn)榧?xì)胞粗提物在一定程度上保留了細(xì)胞原有的天然轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，所以只需外源補(bǔ)充相應(yīng)的物質(zhì)就可以啟動(dòng)蛋白質(zhì)的合成。CFE系統(tǒng)和細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在蛋白質(zhì)合成步驟上存在較大差異（圖1）。具體而言，CFE系統(tǒng)首先將宿主接種于富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，接著通過(guò)高壓勻漿、超聲或凍融等方式進(jìn)行細(xì)胞裂解，隨后通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片和原細(xì)胞基因來(lái)獲得粗提物——該細(xì)胞粗提物中含有后期蛋白質(zhì)合成所必需的物質(zhì)，如核糖體、RNA聚合酶、用于能量和ATP再生的代謝酶以及其他用于轉(zhuǎn)錄和翻譯輔助蛋白（如Sigma因子、起始因子和延伸因子）等。最后，將表達(dá)目標(biāo)蛋白的DNA模板（質(zhì)粒DNA或線性DNA，通常濃度為1～20 nmol/L）、能源物質(zhì)（如葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、糖酵解中間體、磷酸肌酸等）、輔因子（如NAD+、輔酶A）和鹽（如谷氨酸鹽、乙酸鹽）等加入細(xì)胞提取物中，并在合適的條件下反應(yīng)（一般為16～37℃，1～24 h）。一般標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體積為10 μL，但可以根據(jù)應(yīng)用將反應(yīng)體積在10-15～103L之間切換。以上反應(yīng)通常在批次反應(yīng)中完成，模式蛋白質(zhì)的產(chǎn)量可高達(dá)2 mg/mL［18，20，27］。

圖1 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的差別Fig.1 The difference between cell expression system and cell-free expression system

需要注意的是，在本篇文章中，我們認(rèn)為“無(wú)細(xì)胞表達(dá)（CFE）系統(tǒng)”是較為恰當(dāng)?shù)拿⒂盟鼇?lái)指代體外將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA并翻譯為功能性蛋白質(zhì)的方法，在其他發(fā)表的文獻(xiàn)中該方法還經(jīng)常會(huì)被命名為：無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）［28］、無(wú)細(xì)胞 轉(zhuǎn) 錄-翻譯（TX-TL）［29］、無(wú)細(xì)胞代 謝 工程（CFME）［30］、無(wú)細(xì)胞化學(xué)生物合成（CFCB）［31］等。

反映在具體的特征上，CFE系統(tǒng)和細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)［32-34］Tab.1 The advantages and disadvantages of cell-free expression systems

其中，CFE系統(tǒng)最顯著的優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省時(shí)間，可以將1～2周的表達(dá)時(shí)間縮短為1～2天。其次，相較于細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，CFE系統(tǒng)是一種開(kāi)放的系統(tǒng)。相比之下，在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，一旦將DNA模板插入細(xì)胞中，就必須等到整個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)流程完成并裂解細(xì)胞后，才能分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)效果。但是對(duì)于CFE系統(tǒng)，細(xì)胞膜的缺失使得研究人員可以直接控制整個(gè)反應(yīng)環(huán)境，并且可以隨時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行采集和監(jiān)測(cè)。除此之外，CFE系統(tǒng)還可以合成對(duì)細(xì)胞有毒害的蛋白質(zhì)——而這些蛋白質(zhì)一般是細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)難以合成的［27］。但是，必須肯定的是細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)仍然承擔(dān)了目前合成生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域主要的研究和生產(chǎn)任務(wù)，并且其所積累的成果和優(yōu)勢(shì)并非CFE系統(tǒng)可取代的。作為細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的有益補(bǔ)充，CFE系統(tǒng)逐漸在很多細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法勝任的領(lǐng)域開(kāi)始發(fā)揮重要作用?；诖?，本文接下來(lái)將展示CFE系統(tǒng)在材料合成生物學(xué)中令人印象深刻的應(yīng)用，并且這些都強(qiáng)烈地暗示出生物材料的無(wú)細(xì)胞策略在未來(lái)大有可為。

2 無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在生物材料研究中的應(yīng)用

雖然CFE系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究已經(jīng)向人們展示出了它的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但是在初始創(chuàng)立的幾十年中，它的工程應(yīng)用一直受到一些關(guān)鍵因素的限制，如：低且不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)產(chǎn)量、反應(yīng)持續(xù)時(shí)間短、試劑成本高（如額外添加的能源物質(zhì)和酶）、反應(yīng)規(guī)模較小、弱的翻譯后修飾以及昂貴的非標(biāo)準(zhǔn)化的裂解物制備等［22，30，35］。

但是，隨著技術(shù)問(wèn)題的不斷突破，上述限制正在逐漸被解決。今天，CFE系統(tǒng)每升反應(yīng)體積的蛋白質(zhì)產(chǎn)量已達(dá)到克級(jí)，間歇反應(yīng)的持續(xù)已超過(guò)10 h，反應(yīng)規(guī)模也已達(dá)到里程碑式的100 L——而這些結(jié)果在10年前都被認(rèn)為是不可能完成的［36-38］；通過(guò)更好地了解和調(diào)控反應(yīng)及代謝過(guò)程，無(wú)細(xì)胞反應(yīng)的成本也已降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)［39］；同時(shí)隨著越來(lái)越多新方法的開(kāi)發(fā)，毒性蛋白、膜蛋白以及翻譯后修飾等問(wèn)題也得到了較好的解決［40］；另外，研究人員也開(kāi)發(fā)出了更簡(jiǎn)單、更低成本且更容易的方案，來(lái)獲得大批量的細(xì)胞提取物［41-42］。經(jīng)過(guò)研究人員近些年來(lái)的努力，CFE系統(tǒng)的應(yīng)用范圍得到了爆炸式的增長(zhǎng)，其不再僅適合于生物過(guò)程中小規(guī)模的機(jī)理研究及原型設(shè)計(jì)，也可以用于更大規(guī)模的生物產(chǎn)品的合成與生產(chǎn)［43］。在上述背景下，本文將在這一章列舉CFE系統(tǒng)與材料合成開(kāi)發(fā)相結(jié)合的應(yīng)用實(shí)例，以彰顯CFE系統(tǒng)在生物材料設(shè)計(jì)與合成方面的巨大應(yīng)用潛力：首先反映在合成方面，CFE系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)生物材料的綠色可持續(xù)生產(chǎn)，同時(shí)借助材料也可以提升CFE系統(tǒng)的合成性能及應(yīng)用范圍（2.1&2.2）；接著在生物材料的創(chuàng)新設(shè)計(jì)方面，借助CFE系統(tǒng)可以賦予現(xiàn)有材料更為豐富的功能和應(yīng)用，并且加速未來(lái)新型生物材料的設(shè)計(jì)與篩選（2.3&2.4）。

2.1 可持續(xù)生物材料合成的無(wú)細(xì)胞策略

如今，化學(xué)品和材料的原料幾乎全部來(lái)自化石燃料及其產(chǎn)品［44］。例如，石化行業(yè)歷來(lái)專注的7種低成本、大規(guī)模的商業(yè)化學(xué)品（甲醇、乙烯、丙烯、丁二烯、苯、甲苯、二甲苯）幾乎合成了所有的常用材料［45］。然而大規(guī)模使用化石燃料，也帶來(lái)了愈加嚴(yán)峻的環(huán)境問(wèn)題。相較基于化石燃料的生產(chǎn)模式，生物合成方式有著眾多優(yōu)勢(shì)［46］，例如：可再生、不增加溫室氣體的排放、產(chǎn)品通常是可生物降解的等［47］。但是，生物產(chǎn)品在成本上往往處于劣勢(shì)［48］，而近些年無(wú)細(xì)胞策略在降低材料合成成本方面做出較大貢獻(xiàn)，將在一定程度上推動(dòng)生物材料可持續(xù)合成的商業(yè)化。

降低生物材料合成成本的重點(diǎn)研究方向之一是如何利用廉價(jià)、本地化的原料來(lái)生產(chǎn)所需的生物材料［49］。以聚羥基脂肪酸酯（PHA）為例，作為一種生物聚合物，其具有與石化衍生塑料類似的理想的材料性質(zhì)［50］。然而，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)PHA最主要的瓶頸之一是其微生物碳底物的成本過(guò)高（據(jù)估計(jì)占整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程成本的28%～50%）［51］。目前解決此問(wèn)題的潛在方案是使用食物垃圾等低成本、本地化的資源替代原有昂貴的原料［50］，例如，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出以食物垃圾為原料來(lái)合成生物材料的無(wú)細(xì)胞策略：Kelwick等使用奶酪制作過(guò)程的副產(chǎn)品乳清為原料，去除其中部分的鹽，并將得到的乳清滲透物加入CFE系統(tǒng)中，從而開(kāi)發(fā)出了PHA的無(wú)細(xì)胞生產(chǎn)平臺(tái)［52］，該研究成果值得關(guān)注的是，一些微生物的PHA生產(chǎn)策略可以與CFE系統(tǒng)兼容，特別是使用本地采購(gòu)得到的低成本原料（例如乳清滲透物）時(shí)，可能有助于使PHA生產(chǎn)更具經(jīng)濟(jì)可行性［52-53］。類似的，因?yàn)镃FE系統(tǒng)有克服體內(nèi)代謝工程所遇到的內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制、細(xì)胞生長(zhǎng)代謝負(fù)擔(dān)和活細(xì)胞化學(xué)敏感度等方面挑戰(zhàn)的潛力［33，54］，Kopp等［55］通過(guò)構(gòu)建以廢咖啡渣（SCG）為原料的無(wú)細(xì)胞平臺(tái)，生產(chǎn)出了乳酸（LA）［56］（可生物降解的聚合物聚乳酸的原料），并取得了良好的成果。除此之外，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)還有利于快速評(píng)估代謝通路性能和識(shí)別潛在瓶頸，并對(duì)微生物的代謝研究給予啟發(fā)［55］。

將輸入的資源盡可能地用于生物材料本身的合成，也是節(jié)約成本的重要策略。而CFE系統(tǒng)作為一個(gè)專注于目標(biāo)蛋白質(zhì)合成本身的系統(tǒng)，可以消除活細(xì)胞中不需要的副反應(yīng)，從而使輸入糖的理論產(chǎn)量接近100%［31］。Opgenorth等［57］認(rèn)為，為了控制成本，在CFE系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)行時(shí)，必須盡可能少地消耗原料化學(xué)品。因此他們構(gòu)建了一種穩(wěn)健、高效、以葡萄糖為原料的CFE系統(tǒng)，并將其用于生產(chǎn)聚羥基丁酸酯（PHB）的生物塑料，該系統(tǒng)的性能展現(xiàn)了其有大規(guī)模工業(yè)化的潛力。同時(shí)，Ullah等［58］利用無(wú)細(xì)胞策略合成纖維素的研究結(jié)果更形象地體現(xiàn)了這一優(yōu)勢(shì)：以葡萄糖為唯一碳源，15 d的時(shí)間內(nèi)CFE系統(tǒng)獲得了基于葡萄糖消耗量計(jì)算的57.68%的纖維素產(chǎn)量，而傳統(tǒng)微生物系統(tǒng)只獲得了39.62%的纖維素產(chǎn)量。由此可見(jiàn)，CFE系統(tǒng)在生產(chǎn)纖維素方面憑借更高的能源利用率和更高的產(chǎn)量，非常具有工業(yè)化的潛力?？梢韵胂螅?dāng)CFE系統(tǒng)得到大范圍應(yīng)用時(shí)，將極大程度促進(jìn)生物材料的可持續(xù)、低成本生產(chǎn)。

除此之外，傳統(tǒng)的微生物合成生物材料面臨的一個(gè)固有挑戰(zhàn)是：必須在合成目標(biāo)產(chǎn)物的同時(shí)維持細(xì)胞的自身生長(zhǎng)代謝。研究人員幾乎不可能使細(xì)胞正常生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的合成都維持在最佳狀態(tài)，而這極大限制了當(dāng)前最先進(jìn)的生物合成技術(shù)的各種應(yīng)用，例如作為目標(biāo)分子或中間產(chǎn)物的丁醇都應(yīng)低于約2.5%（體積分?jǐn)?shù)）以維持對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的水平［59］。不同的是，CFE系統(tǒng)可以適應(yīng)更苛刻的反應(yīng)環(huán)境，甚至包括直接添加化學(xué)試劑、鹽、有毒物質(zhì)和高溫等［31］。例如，Endoh等［60］所構(gòu)建的CFE系統(tǒng)在80℃下依然有蛋白質(zhì)合成的活力，并在65℃的最適溫度下合成了幾丁質(zhì)酶。

基于以上優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多以葡萄糖為基質(zhì)的可持續(xù)合成CFE系統(tǒng)被設(shè)計(jì)出來(lái)，并且都表現(xiàn)出了較高的資源利用率，例如乙醇（57%）［34］、異丁醇（53%）［34］、正 丁 醇（83%）［61］、蘋(píng) 果 酸（63%）［62］等。幾乎可以肯定的是，當(dāng)CFE系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和相應(yīng)的應(yīng)用方法被越來(lái)越多地開(kāi)發(fā)出來(lái)后，其完全有可能成為可持續(xù)生物材料合成的通用平臺(tái)，并為各種生物材料的低成本、可持續(xù)合成提供極大助力（圖2）。

圖2 基于無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的可持續(xù)生物材料合成策略Fig.2 Sustainable biomaterial synthesis strategy based on cell-free expression system

CFE系統(tǒng)既可以表達(dá)生物酶催化以上生物材料的可持續(xù)合成，也可以表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白使其自身成為蛋白質(zhì)材料，這些材料的組成往往具有不同于催化酶的特征，例如：賦予生物材料抗菌性質(zhì)的抗菌肽（AMP），大多由帶正電的氨基酸組成，對(duì)生產(chǎn)宿主有毒［63］；具有超強(qiáng)力學(xué)性能的蛛絲組分蛋白具有強(qiáng)烈的氨基酸組成偏好，甘氨酸和丙氨酸的含量超過(guò)60%［64］；具有黏附及自愈合性質(zhì)的貽貝蛋白（MAP）則需要引入多巴等非天然氨基酸［20］；糖基化也是關(guān)鍵的翻譯后修飾之一，自然界中基于黏附蛋白的生物材料很多都依賴于高度糖基化后的蛋白質(zhì)［65］。得益于過(guò)去數(shù)十年的發(fā)展，CFE系統(tǒng)針對(duì)不同的目標(biāo)，已經(jīng)制定了多種多樣的合成策略［35，66-67］（表2）。

表2 CFE系統(tǒng)針對(duì)特殊蛋白質(zhì)合成的應(yīng)對(duì)方法Tab.2 Corresponding methods for special protein synthesis using CFE system

通過(guò)這些努力，CFE系統(tǒng)已經(jīng)基本具備合成多種多樣蛋白質(zhì)材料的能力。以生產(chǎn)對(duì)宿主有毒的蛋白質(zhì)為例，預(yù)防細(xì)菌感染是新一代生物材料面臨的主要挑戰(zhàn)之一，一種備受關(guān)注的方法是在生物材料上引入抗菌肽（AMP）來(lái)制備抗菌材料［89］。例如，與AMP共價(jià)交聯(lián)制備的水凝膠是臨床上防止皮膚感染的解決方案［89］。但AMP本身作為破壞生物膜穩(wěn)定性而具有毒害作用的物質(zhì)，傳統(tǒng)方法較難合成，而通過(guò)CFE系統(tǒng)的努力，凍干的大腸桿菌CFE系統(tǒng)，已成功合成了10種不同的AMP，并通過(guò)大腸桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)證明了BP100、Cecropin B和Cecropin P1的 功 能［90］。除 此 之外，基于CFE系統(tǒng)的平臺(tái)也為篩選生物活性AMP［91］及毒素（如thermostable direct hemolysin，TDH）提供了新的方法［92］。

2.2 基于材料的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)性能提升

雖然CFE系統(tǒng)憑借自身優(yōu)勢(shì)成為一種快速生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，然而想要利用CFE系統(tǒng)得到高體積產(chǎn)量（超過(guò)mg/mL級(jí)別）的功能性蛋白質(zhì)仍然具有挑戰(zhàn)性。鑒于幾乎所有CFE系統(tǒng)都是液相系統(tǒng)（SPS）——即其基因表達(dá)模板是分散在溶液中的［93］，Park等開(kāi)發(fā)了一種完全由DNA制成的凝膠［94］，該凝膠支架由基因與分支DNA結(jié)構(gòu)酶促交聯(lián)形成，命名為“X-DNA”。DNA連接酶將X-DNA上的回文黏性末端與線性化質(zhì)粒的黏性末端互補(bǔ)交聯(lián)，之后使用這種交聯(lián)的DNA為唯一成分制備“P-凝膠”［93］。這是水凝膠材料首次用于生產(chǎn)功能性蛋白質(zhì)，并且產(chǎn)量高達(dá)5 mg/mL［95］。Ruiz等［96］在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了基于微流體裝置的“P-凝膠”無(wú)細(xì)胞大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)平臺(tái)，并設(shè)想將該平臺(tái)作為傳統(tǒng)活細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)的強(qiáng)力替代品（目前該平臺(tái)已商業(yè)化）。而Kahn等［97］考慮到在很多生物制品中基因不易表達(dá)的問(wèn)題，設(shè)計(jì)出了一種新的基于DNA的水凝膠無(wú)細(xì)胞平臺(tái)，以解決蛋白質(zhì)工程的基本挑戰(zhàn)——包括高蛋白質(zhì)產(chǎn)量、基因組分離和蛋白質(zhì)展示等。另外關(guān)于DNA水凝膠的成本問(wèn)題，Cui等［98］構(gòu)建了由聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和DNA制備的低成本混合水凝膠。該水凝膠成本比P-凝膠下降了30余倍，而蛋白質(zhì)產(chǎn)量比CFE的SPS提高22.7倍，除此之外，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的離心回收后，PEGDA/DNA混合水凝膠還可以在CFE中重復(fù)使用10次。與此同時(shí)，研究人員還開(kāi)發(fā)出了黏土與基因混合的水凝膠——Yang等首先證明了黏土水溶液可以在離子溶液中瞬間形成水凝膠［99］，接著通過(guò)其水凝膠中盤(pán)狀結(jié)構(gòu)（納米盤(pán)）具有的帶電性來(lái)自發(fā)地結(jié)合表達(dá)質(zhì)粒（兩者結(jié)合后甚至可以在室溫下儲(chǔ)存半年），最后將其用于CFE體系。結(jié)果表明，該水凝膠除了能提高CFE系統(tǒng)的蛋白產(chǎn)量外，還可以通過(guò)添加磁性納米顆粒（MNP）實(shí)現(xiàn)水凝膠的回收與再利用［100］。

除了制作與DNA結(jié)合的混合水凝膠外，Lee等［101］嘗試直接向無(wú)細(xì)胞反應(yīng)中增添家蠶Bombyx mori的絲素蛋白以增加大分子擁擠效應(yīng)，并成功將CFE系統(tǒng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了42%。不僅如此，研究人員還嘗試了其他將CFE系統(tǒng)與材料相結(jié)合的方法，例如：Pardee等［102］開(kāi)創(chuàng)性地提出將CFE系統(tǒng)冷凍干燥到材料上，使基于合成生物學(xué)的技術(shù)能夠以廉價(jià)、無(wú)菌和非生物的方式用于全球應(yīng)用。在上述研究報(bào)道之后，研究人員對(duì)將冷凍干燥的無(wú)細(xì)胞（FD-CF）反應(yīng)保存在多孔材料中有了極大的興趣，因?yàn)樵摷夹g(shù)可以避免使用冷鏈并在室溫下進(jìn)行全球分配和儲(chǔ)存［103］。例如近期，Blum等［104］探索了數(shù)十種多孔基質(zhì)材料，并展示出水凝膠基質(zhì)材料具有增強(qiáng)CFE系統(tǒng)蛋白表達(dá)的能力，他們預(yù)期未來(lái)可以設(shè)計(jì)新的生物材料基質(zhì)以控制CFE系統(tǒng)的反應(yīng)速度、產(chǎn)量、穩(wěn)定性等屬性。

借助材料不僅可以提升CFE系統(tǒng)的合成能力以及長(zhǎng)期室溫儲(chǔ)存的能力，還有其他重要的應(yīng)用方向［52］。“從頭開(kāi)始”構(gòu)建細(xì)胞一直是令許多合成生物學(xué)研究人員興奮的一個(gè)領(lǐng)域。人們通常將具有多種功能的細(xì)胞模擬物稱為“人造細(xì)胞”（AC）。在人造細(xì)胞中，除了內(nèi)部的CFE系統(tǒng)外，細(xì)胞內(nèi)邊界材料和分隔方法也起到關(guān)鍵性作用，例如如何用脂質(zhì)提供與生物膜相似環(huán)境的天然膜；如何用水凝膠來(lái)高效分隔CFE系統(tǒng)創(chuàng)造以及延長(zhǎng)系統(tǒng)壽命等等。所有人都在期待CFE系統(tǒng)與材料更好地結(jié)合，從而共同加速人造細(xì)胞這一先進(jìn)領(lǐng)域的發(fā)展［105］。

在這里本文展示了材料與CFE系統(tǒng)結(jié)合后各種令人驚嘆的創(chuàng)新型設(shè)計(jì)（圖3）。相信未來(lái)隨著各種材料與CFE系統(tǒng)巧妙結(jié)合，更多新穎的應(yīng)用形式將不斷涌現(xiàn)。

圖3 基于材料的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)性能提升Fig.3 Performance improvement of cell-free expression system aided by materials

2.3 無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)賦予材料新功能及應(yīng)用

智能材料是一種能響應(yīng)外部特定刺激而改變其一種或多種特性的新型功能材料［106］，也是現(xiàn)代高技術(shù)材料發(fā)展的重要方向之一。智能材料的已有應(yīng)用包括：智能玻璃（通過(guò)快速的光響應(yīng)而改變顏色的油墨）［107］，可以檢測(cè)外部刺激的織物傳感器［108］和水凝膠藥物遞送系統(tǒng)［109］等。目前研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的智能水凝膠可根據(jù)pH、光照或溫度等變化來(lái)改變其自身物理以及其他特性［110］，例如我們實(shí)驗(yàn)室先前報(bào)道的具有雙重?zé)崦籼匦缘模谥┲霠恳z的保守C端域組裝的蛋白質(zhì)水凝膠［111］；進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的可按需調(diào)節(jié)的，雙熱敏蛋白水凝膠［112］；以及通過(guò)賦予導(dǎo)電性而開(kāi)發(fā)出，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人類活動(dòng)的穿戴式傳感器的混合水凝膠［113］。然而，與生物領(lǐng)域內(nèi)觀察到的多響應(yīng)、多功能的材料相比，人類設(shè)計(jì)和構(gòu)建材料的能力仍然有限，仍然有很多需要從生命系統(tǒng)中學(xué)習(xí)的東西，而仿生學(xué)領(lǐng)域?qū)橹匦麻_(kāi)發(fā)新型智能材料提供重要啟示［114］。秉承此想法，Whitfield等［115］建議通過(guò)無(wú)細(xì)胞策略，將活細(xì)胞中的生命現(xiàn)象重新展現(xiàn)到水凝膠中，從而賦予水凝膠材料智能化。他們使用該系統(tǒng)設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一種無(wú)細(xì)胞水凝膠材料，該材料可以響應(yīng)外源刺激并改變其底盤(pán)材料的結(jié)構(gòu)特性。類似地，有研究人員合成了一種化學(xué)交聯(lián)的透明的水凝膠：1，4-丁二醇二縮水甘油醚（HA：BDDE）［116］，通過(guò)無(wú)細(xì)胞合成裂解酶并對(duì)HA：BDDE進(jìn)行消化來(lái)改變材料結(jié)構(gòu)特性。有趣的是，在此過(guò)程中水凝膠大小和顏色的變化可以通過(guò)肉眼直接觀察到。目前有3種在水凝膠中大規(guī)模引入CFE系統(tǒng)的常用方法：①CFE系統(tǒng)和水凝膠聚合物直接結(jié)合；②先將水凝膠凍干，再使用含水的CFE系統(tǒng)重構(gòu)水凝膠；③先將CFE系統(tǒng)冷凍干燥，再使用含水（液體）的水凝膠重構(gòu)。Whitfield等［115］通過(guò)以上3種方法測(cè)試了12種具有不同結(jié)構(gòu)和化學(xué)特征的水凝膠與CFE系統(tǒng)結(jié)合的能力，結(jié)果表明CFE系統(tǒng)與大部分水凝膠材料都是可以結(jié)合的，并且在某些情況下，作為基質(zhì)的水凝膠借助分子擁擠效用，反而可以增加CFE系統(tǒng)表達(dá)。更重要的是，這些結(jié)果啟發(fā)了人們通過(guò)CFE系統(tǒng)表達(dá)功能性的酶來(lái)激活材料性質(zhì)變化，從而開(kāi)發(fā)出基于CFE系統(tǒng)和水凝膠結(jié)合的智能材料的思路。

隨著研究的深入，以生物材料為基質(zhì)，結(jié)合CFE系統(tǒng)的生物傳感器的開(kāi)發(fā)也成為了可能。研究人員將編碼基因電路的CFE系統(tǒng)凍干并嵌入紙或其他潛在材料中，制成了無(wú)細(xì)胞紙基生物傳感器。這些生物傳感器可以在室溫下保存幾個(gè)月之久［102-103，117］，并在加入水或其他液體樣品激活后，可以通過(guò)預(yù)先編程好的程序產(chǎn)生可監(jiān)測(cè)的信號(hào)輸出，以此來(lái)檢測(cè)相關(guān)分子（例如汞）或某些疾病的生物標(biāo)志物［43，118］。除此之外，無(wú)細(xì)胞生物傳感器還可以用來(lái)檢測(cè)病毒RNA，如工程化的基于無(wú)細(xì)胞的生物傳感器可以區(qū)分不同的埃博拉病毒［102］和寨卡病毒株［119］，并且可以用來(lái)檢測(cè)冠狀病毒，例如SARS-CoV和2019 n-CoV［120］。針對(duì)2020年爆發(fā)的新型冠狀病毒（COVID-19）肺炎疫情，Liu等［121］將基于CFE系統(tǒng)的紙基生物傳感器評(píng)述為新開(kāi)發(fā)的檢測(cè)SARS-CoV-2的有效方法。CFE系統(tǒng)與材料結(jié)合的這項(xiàng)應(yīng)用具有十分深遠(yuǎn)的意義——通常情況下，傳染性疾病對(duì)于世界上較貧困地區(qū)人的健康威脅更大，而使用基于CFE系統(tǒng)的生物傳感器這一更廉價(jià)和便攜的測(cè)試工具，可以徹底改變檢測(cè)和處理這些致命疾病的方式，以此減少它們對(duì)人類健康的威脅，從而挽救更多的生命［18］。

在一些創(chuàng)新性的工作中，CFE系統(tǒng)還被用于制造自組裝蛋白質(zhì)微陣列，并將其作為核酸可編程蛋白質(zhì)陣列（NAPPA）技術(shù)［122］，蛋白質(zhì)原位陣列（PISA）技術(shù)［123］和其他基于蛋白質(zhì)陣列的方法［124-126］——此概念通過(guò)使用His標(biāo)簽進(jìn)一步擴(kuò)展到蛋白質(zhì)合成和選擇性固定［127-129］。目前這些系統(tǒng)已成功應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)和蛋白質(zhì)工程［128，130］。例如Benítez-Mateos等［131］最近描述了一種便攜式工具包，只需將DNA、固定材料和CFE系統(tǒng)混合，即可將CFE系統(tǒng)和蛋白質(zhì)固定化集成在一起（in one pot），具體地說(shuō)，它們通過(guò)開(kāi)發(fā)一組可與CFE系統(tǒng)和固體材料一起使用的質(zhì)粒，從而協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)合成和固定，并按需制造基于蛋白質(zhì)的生物材料。這項(xiàng)技術(shù)完全便攜，因?yàn)樗恍枰獙ｉT的設(shè)備或基礎(chǔ)設(shè)施，所以可以擴(kuò)展到通過(guò)合成和固定相應(yīng)酶和抗體的結(jié)合蛋白來(lái)制造功能性生物材料。目前，該合成生物平臺(tái)已成為按需制造治療、診斷和傳感生物材料的多功能工具。

總而言之，CFE系統(tǒng)為材料的智能化和功能化提供了一條全新的路徑（圖4）。可以想象，當(dāng)CFE系統(tǒng)拓展到更多生物材料的設(shè)計(jì)中后，將賦予生物材料愈加豐富的特性從而滿足市場(chǎng)不斷增長(zhǎng)的新需求。

圖4 無(wú)細(xì)胞策略賦予材料新功能及應(yīng)用Fig.4 Cell-free strategy endows materials with new functions for various applications

2.4 無(wú)細(xì)胞策略加速新型生物材料的開(kāi)發(fā)

合成生物學(xué)的研究思路是使用工程上常用的迭代設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試（DBT）循環(huán)，盡可能節(jié)約生物設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和應(yīng)用的時(shí)間［132］。然而，盡管人們開(kāi)發(fā)了許多合成生物學(xué)工具，例如基因拷貝數(shù)調(diào)整［133］和組合轉(zhuǎn)錄調(diào)控［134］來(lái)加速DBT循環(huán)，由于細(xì)胞本身的復(fù)雜性，該研究思路仍面臨眾多挑戰(zhàn)。相比之下，憑借可以直接使用線性DNA（即PCR產(chǎn)物）作為轉(zhuǎn)錄模板，進(jìn)而繞過(guò)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的基因克隆和細(xì)胞轉(zhuǎn)化步驟；沒(méi)有細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的邊界從而有利于監(jiān)測(cè)和控制轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程的開(kāi)放系統(tǒng)等優(yōu)勢(shì)［135］，無(wú)細(xì)胞原型設(shè)計(jì)策略可以更輕松地集成到設(shè)計(jì)周期中［52］。除此之外，無(wú)細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的流程也非常適合自動(dòng)化，已有研究成功地利用聲學(xué)液體處理機(jī)器人，快速地建立了大規(guī)模、小體積（≤10 μL）的原型無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系，并將其用于表征非模型微生物宿主基因表達(dá)的調(diào)控元件（啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子）［136］，以此建立代替?zhèn)鹘y(tǒng)組織培養(yǎng)和流式細(xì)胞的檢測(cè)方法［137］。同時(shí)，微流體技術(shù)［138］、液滴陣列技術(shù)［139］也已應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)基于無(wú)細(xì)胞策略的高通量篩選。通過(guò)以上方法還可以大批量測(cè)試調(diào)控元件或代謝酶，并為生物材料的合成提供更優(yōu)化的路徑［52］。除此之外，CFE系統(tǒng)還可以用來(lái)高通量篩選生物分子，研究表明CFE系統(tǒng)在篩選有毒或不溶性蛋白質(zhì)［140］、減少所需時(shí)間［141］和反應(yīng)體積［142］等方面，有著顯著的優(yōu)勢(shì)。使用體外無(wú)細(xì)胞策略以高通量形式篩選和進(jìn)化生物分子的技術(shù)可分為體外展示和芯片技術(shù)兩大類，這些技術(shù)都拓寬了CFE系統(tǒng)對(duì)生物分子高通量篩選方面的應(yīng)用［143］。同時(shí)將這些數(shù)據(jù)輸入到生物數(shù)據(jù)庫(kù)中，用于機(jī)器學(xué)習(xí)，可加速新材料的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)從而篩選、設(shè)計(jì)出具有更優(yōu)性能的生物材料［144］。

目前，各種基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)都需要將非天然氨基酸（UNAA）引入蛋白質(zhì)［145］。在前沿應(yīng)用中，引入U(xiǎn)NAA會(huì)產(chǎn)生具有新的功能和結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)，這是傳統(tǒng)的20種天然氨基酸無(wú)法實(shí)現(xiàn)的［146］。由于具有克服傳統(tǒng)方法中UNAA難以跨越細(xì)胞膜運(yùn)輸、非天然生物成分的細(xì)胞毒性和低效率等問(wèn)題，CFE系統(tǒng)已被公認(rèn)為是高效整合UNAA的強(qiáng)大測(cè)試和生物制造平臺(tái)［130］。除此之外，如上文所述，CFE系統(tǒng)還擁有作為良好的高通量篩選平臺(tái)并加快非天然蛋白質(zhì)工程的設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試循環(huán)的能力［147］。所有的這些優(yōu)勢(shì)都會(huì)將CFE系統(tǒng)發(fā)展為強(qiáng)大的、簡(jiǎn)單的、靈活的合成非天然蛋白質(zhì)的平臺(tái)。例如Albayrak等［148］設(shè)計(jì)的基于無(wú)細(xì)胞平臺(tái)的UNAA引入技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)和小分子聚合物的合成，進(jìn)而制造一類新的支架或生物材料?？偟膩?lái)說(shuō)，無(wú)細(xì)胞策略已為生物材料的高通量篩選提供了一個(gè)強(qiáng)大的生物平臺(tái)，該平臺(tái)在生物材料設(shè)計(jì)周期方面的優(yōu)勢(shì)，極有可能加速一系列新型生物材料的篩選、設(shè)計(jì)與合成（圖5）。

圖5 無(wú)細(xì)胞策略用于加速生物材料的DBT循環(huán)Fig.5 Cell-free strategy is used to accelerate the DBT cycle of biomaterials

3 總結(jié)與展望

人類對(duì)于材料需求的迅速增加直接導(dǎo)致了森林的過(guò)度砍伐、對(duì)化石燃料的過(guò)分依賴，以及遺留大量自然難以降解的材料垃圾［145］。因此，迫切需要一種綠色、低成本、可持續(xù)的材料合成策略［52］，而無(wú)細(xì)胞合成生物材料的策略則有望成為以上難題的重要解決方案。于此，本文首先介紹了CFE系統(tǒng)以本地食物垃圾為原料生產(chǎn)生物塑料以及乳酸的例子，并總結(jié)了CFE系統(tǒng)在能源高效利用和適應(yīng)更苛刻反應(yīng)條件方面的優(yōu)勢(shì)，以凸顯CFE系統(tǒng)用于可持續(xù)生物材料制造的巨大潛力。接著，本文展示了基于材料的CFE系統(tǒng)性能提升，例如多種增加CFE系統(tǒng)蛋白質(zhì)產(chǎn)量的DNA凝膠、保存在多孔材料上的冷凍干燥的CFE系統(tǒng)以及類似人造生命的“人造細(xì)胞”，并相信這些借助材料的CFE系統(tǒng)設(shè)計(jì)在未來(lái)可能大大提升CFE系統(tǒng)的合成效率［131］、降低成本并展現(xiàn)新的應(yīng)用前景。隨后，本文列舉了CFE系統(tǒng)賦予各種材料智能化和功能化的策略，通過(guò)與水凝膠等材料結(jié)合，可以制造出具有外界刺激響應(yīng)性的智能水凝膠以及可以在室溫下存儲(chǔ)的生物傳感器，從而大大拓展了材料的應(yīng)用范圍［29］。最后，本文展示了CFE系統(tǒng)對(duì)于加快生物材料設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的DBT循環(huán)以及幫助非天然氨基酸引入方面所具有的顯著優(yōu)勢(shì)，并期待其為新型生物材料的開(kāi)發(fā)提供一個(gè)快速、高效的平臺(tái)。

雖然CFE系統(tǒng)已經(jīng)在不同場(chǎng)景中獲得了引人注目的成就［43］，研究人員也已證明CFE系統(tǒng)是克服傳統(tǒng)細(xì)胞固有局限性的有效工具，但是挑戰(zhàn)依然存在。其一是成本［32］，因?yàn)闊o(wú)細(xì)胞本身作為無(wú)法自我復(fù)制的系統(tǒng)，并且需要額外補(bǔ)充酶、能源物質(zhì)和輔因子等，而這種較為昂貴的生產(chǎn)成本成為限制其發(fā)展的首要原因［40］。其二，CFE系統(tǒng)的壽命即反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短［32］，并且作為一個(gè)年輕的系統(tǒng)，人們對(duì)其基本特征和工作原理還缺乏深刻的理解，在非常依賴實(shí)際操作數(shù)據(jù)支持的工程生產(chǎn)中，CFE系統(tǒng)的使用仍然缺乏經(jīng)驗(yàn)。其三，在與材料相結(jié)合的應(yīng)用中，CFE系統(tǒng)的生物材料制造能力尚未得到充分評(píng)估和理解，并且用于進(jìn)行無(wú)細(xì)胞反應(yīng)的材料也未能得到充分利用［29］。反映在更具體的實(shí)例中，無(wú)細(xì)胞與材料相結(jié)合的挑戰(zhàn)仍有很多，例如在已有研究中，Lee等［101］雖然向CFE系統(tǒng)中添加絲素蛋白并提高了CFE系統(tǒng)的產(chǎn)量，但是卻并沒(méi)有達(dá)到改善無(wú)細(xì)胞反應(yīng)其他性能的預(yù)期目標(biāo)。而基于材料的冷凍干燥的CFE系統(tǒng)，除了耐用性和穩(wěn)定性存在挑戰(zhàn)外，還存在現(xiàn)有制取細(xì)胞裂解物方法昂貴且屬于勞動(dòng)密集型、不利于全球性推廣的問(wèn)題［103］。其四，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在很多基于蛋白質(zhì)的生物材料中非常重要，這些修飾包括糖基化、磷酸化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙?；鹊龋鳦FE系統(tǒng)本身翻譯后修飾的能力較弱，所以仍需要更多的方法來(lái)進(jìn)一步改善其在此方面的能力［32］。其五，還存在非天然氨基酸多樣性帶來(lái)的生物不相容性以及嵌入效率低等問(wèn)題［145］。所以，雖然CFE系統(tǒng)在生物材料研究中已獲得較為廣泛的應(yīng)用，但如果想讓該領(lǐng)域在實(shí)際生產(chǎn)中獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，人們?nèi)杂泻荛L(zhǎng)的路要走。幸運(yùn)的是，研究人員已經(jīng)開(kāi)始著手制定各種方案來(lái)解決以上挑戰(zhàn)，例如制定CFE系統(tǒng)的定量評(píng)價(jià)機(jī)制以及用于定性評(píng)價(jià)的基本屬性特征、開(kāi)發(fā)通用的無(wú)細(xì)胞模型、設(shè)計(jì)更穩(wěn)定的能源供給及輔因子回收系統(tǒng)等等［29-30］。

CFE系統(tǒng)作為一個(gè)新興的研究方向，盡管有著眾多不成熟的地方以及有待進(jìn)一步解決的問(wèn)題，但相信其具備的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)一定會(huì)為生物材料的創(chuàng)新設(shè)計(jì)及應(yīng)用提供強(qiáng)大的支撐。隨著相關(guān)研究的進(jìn)一步深入，可以基于CFE系統(tǒng)更快速地開(kāi)發(fā)新型生物材料，并且以更低的成本、環(huán)境友好的方式生產(chǎn)出來(lái)，從而保護(hù)人們賴以生存的地球環(huán)境；同時(shí)，不斷開(kāi)發(fā)出的與無(wú)細(xì)胞結(jié)合的智能材料，例如病毒檢測(cè)生物傳感器等，將在極大程度上保障人類的健康?？偠灾?，無(wú)細(xì)胞策略在生物材料研究中的應(yīng)用，作為一個(gè)有前景、有意義的新興方向，非常值得研究人員進(jìn)一步地探索與挖掘，不僅為了闡述更多存在于細(xì)胞中的生命機(jī)理，更為了保護(hù)我們深愛(ài)的地球家園以及家園里生活的每一個(gè)值得珍惜的生命。