生物合成高性能蛋白及材料應(yīng)用

李敬敬，馬超，王帆，張洪杰，，劉凱，

（1中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130022；2清華大學(xué)化學(xué)系，北京 100084）

生物結(jié)構(gòu)蛋白如絲素蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白等是一類自然進(jìn)化產(chǎn)生的天然高分子材料，具有良好的力學(xué)性能、生物相容性和可降解性。同時(shí)，由于其特征性的模塊化序列而具備精確的結(jié)構(gòu)和功能的可調(diào)控性，這是許多合成高分子材料所缺乏的特性［1-2］。此外，高性能結(jié)構(gòu)蛋白的多級(jí)組裝特性使得它們可以組裝成更高層次的材料體系，包括纖維、膠束、納米載體、相分離微結(jié)構(gòu)、框架體系和生物活體材料等［3-7］。高性能結(jié)構(gòu)蛋白材料在可穿戴織物、生物醫(yī)學(xué)和軍事科技領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。例如，蛛絲蛋白纖維由于具有低密度、高延展性、高韌性等優(yōu)勢(shì)，能夠吸收巨大的能量，是制造防彈裝備的優(yōu)異材料?；谛Q絲蛋白的纖維材料和生物支架已被FDA批準(zhǔn)用于臨床［8］。膠原蛋白具有良好的親水性和生物相容性，已被成功應(yīng)用制備人工肌腱、血管、牙科或軟組織植入物等［9］。膠原水凝膠還可以用做細(xì)胞培養(yǎng)的三維基質(zhì)，是角膜移植、神經(jīng)、軟骨、皮膚和其他身體器官再生的良好材料。此外，利用絲素蛋白和類彈性蛋白等的自組裝結(jié)構(gòu)開(kāi)發(fā)新型的納米載體系統(tǒng)［10-11］，能夠用于小分子、核酸和蛋白藥物的體內(nèi)遞送和可控釋放。超分子肽組裝物可以通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)相互作用整合到功能性化療或光敏藥物中，有利于構(gòu)建用于聯(lián)合免疫治療的多功能納米藥物傳遞載體［12］。

隨著基因工程技術(shù)和蛋白工程技術(shù)的發(fā)展，利用結(jié)構(gòu)蛋白功能域模塊化和嵌段共聚物策略，使得合成具有可定制性能的人工蛋白材料體系成為可能。例如，研究人員通過(guò)對(duì)天然肌聯(lián)蛋白的功能模塊GB1和節(jié)肢彈性蛋白的保守重復(fù)基序進(jìn)行重組，成功開(kāi)發(fā)了能夠模擬天然肌肽分子結(jié)構(gòu)的人工彈性蛋白［13］。南京大學(xué)曹毅教授等［14］通過(guò)將類彈性蛋白和光響應(yīng)蛋白融合設(shè)計(jì)出一種光可切換系繩，利用光響應(yīng)蛋白在單體和二聚體狀態(tài)之間的切換來(lái)可逆調(diào)節(jié)類彈性蛋白鏈段的長(zhǎng)度，提供了一種通過(guò)光調(diào)節(jié)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞分化行為的方法。吉林大學(xué)劉俊秋教授課題組［15］基于SP1環(huán)狀蛋白自組裝開(kāi)發(fā)了體外人工捕光系統(tǒng)，用于模擬天然光合細(xì)菌的能量傳遞過(guò)程。同時(shí)通過(guò)開(kāi)發(fā)多樣性的生物合成系統(tǒng)如細(xì)菌、酵母和轉(zhuǎn)基因植物等［16-18］，能夠?qū)崿F(xiàn)人工蛋白在異源系統(tǒng)的表達(dá)，這為高性能人工蛋白及其材料體系的性能優(yōu)化和宏量制備奠定了基礎(chǔ)。

盡管高性能生物結(jié)構(gòu)蛋白在新材料設(shè)計(jì)中有廣闊的前景，但在蛋白的高效生物合成、多尺度體外組裝和理性功能設(shè)計(jì)等方面仍存在較多瓶頸問(wèn)題。在生物合成方面，高性能蛋白的超高分子量以及高度重復(fù)的序列特征降低了其在人工合成系統(tǒng)中的穩(wěn)定性。另外由于密碼子偏好性差異和翻譯后修飾等因素，導(dǎo)致天然結(jié)構(gòu)蛋白與人工合成系統(tǒng)（尤其是廣泛使用的原核微生物合成系統(tǒng)）的適配性較低。在高性能蛋白多尺度組裝方面，目前常用的蛋白裝配成型手段無(wú)法避免對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，難以實(shí)現(xiàn)蛋白折疊狀態(tài)下的有序組裝。在蛋白理性功能設(shè)計(jì)方面，目前對(duì)于高性能結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列、折疊結(jié)構(gòu)和功能特性三者之間的關(guān)系還需要深入了解。

隨著多組學(xué)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)高性能生物結(jié)構(gòu)蛋白的序列庫(kù)得到極大拓展，不同結(jié)構(gòu)蛋白功能序列的組合拓展了蛋白材料的可編程性。此外，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分子設(shè)計(jì)工具的發(fā)展為從頭創(chuàng)造具有獨(dú)特功能特性的新型蛋白分子提供了技術(shù)基礎(chǔ)。分子間相互作用的直接量化對(duì)于激發(fā)關(guān)鍵設(shè)計(jì)參數(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白仿生材料優(yōu)化設(shè)計(jì)具有重要意義［19］。通過(guò)對(duì)人工蛋白生物合成系統(tǒng)的基因工程改造，有望在人工合成系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高性能蛋白的規(guī)模化批量生產(chǎn)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)的定制化修飾以服務(wù)于后續(xù)的蛋白組裝材料的性能。

本文對(duì)生物結(jié)構(gòu)蛋白包括類彈性蛋白、絲素蛋白、貽貝足絲蛋白和肌聯(lián)蛋白等作為高性能蛋白材料的構(gòu)建模板在蛋白分子設(shè)計(jì)、生物合成、材料組裝和應(yīng)用中取得的代表性進(jìn)展做出了總結(jié)，并且對(duì)具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦偷鞍追肿雍图夹g(shù)平臺(tái)進(jìn)行了介紹，為實(shí)現(xiàn)高性能蛋白材料高效合成和功能理性設(shè)計(jì)提供可借鑒的思路。

1 人工結(jié)構(gòu)蛋白的設(shè)計(jì)與合成

結(jié)構(gòu)蛋白分子是創(chuàng)建多尺度組裝的蛋白生物材料的基本模塊。通過(guò)蛋白質(zhì)工程和基因編輯工具對(duì)蛋白分子進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化，從而提升蛋白材料的功能，已經(jīng)成為高性能蛋白材料合成發(fā)展的新趨勢(shì)。開(kāi)發(fā)具有功能優(yōu)勢(shì)的蛋白分子即蛋白材料基本單元的主要方法包括：①通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析從自然界的功能序列中尋找有意義的新序列；②通過(guò)基因工程方法改造現(xiàn)有蛋白功能序列，包括特殊位點(diǎn)突變或功能基序重組等，從而達(dá)到特定的目的。此外，研究者們通過(guò)基因工程改造大腸桿菌、酵母菌和谷氨酸棒桿菌等構(gòu)建蛋白表達(dá)的高效底盤細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)人工結(jié)構(gòu)蛋白的高效生物合成。

1.1 結(jié)構(gòu)蛋白功能序列解析

確定高性能生物結(jié)構(gòu)蛋白如絲素蛋白、肌聯(lián)蛋白以及一些黏附蛋白（包括貽貝蛋白、藤壺蛋白）等的氨基酸序列面臨多重挑戰(zhàn)，一方面缺少對(duì)應(yīng)的生物基因組信息，另一方面天然蛋白往往較難溶解且序列重復(fù)度較高，因此增加了蛋白質(zhì)測(cè)序的難度。南洋理工大學(xué)Miserez團(tuán)隊(duì)［20］將蛋白質(zhì)組學(xué)工具與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合，完成了海螺卵囊、貽貝足絲和魷魚環(huán)齒等結(jié)構(gòu)中的多種蛋白的序列鑒定和結(jié)構(gòu)功能分析，這些信息可以進(jìn)一步與合成生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，以更好地對(duì)蛋白材料進(jìn)行仿生工程生物制造。Arakawa課題組［21］對(duì)蓑衣蟲Eumeta variegata的基因組序列解析發(fā)現(xiàn)了具有獨(dú)特重復(fù)基序的絲蛋白基因，它既包括蛛絲蛋白典型的多聚丙氨酸序列［（A）n］，同時(shí)含有蠶絲蛋白甘氨酸-丙氨酸交替的重復(fù)序列［（GA）n］。蓑衣蟲絲的拉伸斷裂強(qiáng)度可達(dá)2.0 GPa，韌性可達(dá)364 MJ/m3，超過(guò)已報(bào)道的絕大多數(shù)蛛絲纖維［22］，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)上述混合基序特征與蓑衣蟲絲優(yōu)異的力學(xué)性能密切相關(guān)［23］。

近年來(lái)，比較基因組學(xué)分析也被用于蛋白仿生材料研究中，對(duì)多個(gè)物種基因組或功能基因區(qū)域的比較分析有助于發(fā)現(xiàn)新的功能基因或與蛋白性能相關(guān)的標(biāo)志因素。如Arakawa團(tuán)隊(duì)［24］在進(jìn)一步的工作中鑒定出另外2個(gè)種屬的蓑衣蟲絲蛋白基因，通過(guò)與Eumeta variegata的絲蛋白基因序列對(duì)比分析，揭示蓑衣蟲絲蛋白基因高度重復(fù)區(qū)域具有保守的功能基序排布，同時(shí)比較分析發(fā)現(xiàn)Canephora pungelerii絲蛋白中（GA）n和（GAGAGS）n基序的數(shù)目顯著低于其他兩個(gè)屬，結(jié)合Canephora pungelerii蛋白纖維明顯高于其他種屬的力學(xué)性能，證明功能基序的重復(fù)度以及不同功能基序間的平衡對(duì)蛋白纖維性能有著重要影響。研究者采用類似的多組學(xué)方法對(duì)4種不同的絡(luò)新婦亞科（Nephilinae）蜘蛛的牽引絲蛋白成分和序列進(jìn)行分析［25］，除常規(guī)的蛛絲蛋白外還鑒定出一類低分子量蛋白SpiCE，拉伸測(cè)試表明含有SpiCE的復(fù)合蛛絲蛋白薄膜的拉伸強(qiáng)度增加了2倍，但復(fù)合蛛絲纖維卻顯示出斷裂伸長(zhǎng)率增加以及拉伸強(qiáng)度降低，根據(jù)這些力學(xué)性能的變化，研究者推測(cè)SpiCE蛋白可能與蛛絲蛋白MaSp的無(wú)定形結(jié)構(gòu)域之間存在相互作用，從而影響蛛絲蛋白組裝體系的力學(xué)性能，SpiCE有望成為修飾和調(diào)整蛛絲蛋白材料力學(xué)性能的有利分子工具。

1.2 結(jié)構(gòu)蛋白功能模塊修飾和重組

生物結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列與其結(jié)構(gòu)和性能密切相關(guān)，因此，通過(guò)位點(diǎn)特異性突變、序列插入/融合、多聚化等方式，有可能從天然功能基序中衍生出新的功能序列。非天然氨基酸對(duì)生物結(jié)構(gòu)蛋白特殊功能的形成及結(jié)構(gòu)組裝具有重要作用。以類彈性蛋白為例，其交聯(lián)組裝可以通過(guò)引入外部交聯(lián)劑誘導(dǎo)賴氨酸、半胱氨酸或酪氨酸之間形成共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)，但交聯(lián)劑的細(xì)胞毒性可能會(huì)限制蛋白組裝體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。耶魯大學(xué)Isaacs等［26］通過(guò)改造大腸桿菌基因組將終止密碼子“UAG”轉(zhuǎn)換為編碼新型非天然氨基酸的密碼子，并開(kāi)發(fā)了對(duì)非天然氨基酸具有高效特異性的氨酰tRNA合成酶，這項(xiàng)工作將基因組重構(gòu)的大腸桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)樾滦偷鞍椎暮铣晒S，為新型蛋白分子和聚合物的生物制造奠定了基礎(chǔ)。杜克大學(xué)Chilkoti團(tuán)隊(duì)［27］利用上述非天然氨基酸定點(diǎn)修飾技術(shù)，在蛋白編碼序列中定點(diǎn)插入特殊密碼子“UAG”，成功將具有光交聯(lián)反應(yīng)活性的非天然氨基酸即對(duì)疊氮苯丙氨酸（pAzF）引入到類彈性蛋白主鏈中，制備出具有光熱響應(yīng)的水凝膠納米顆粒。非天然氨基酸位點(diǎn)特異性整合的準(zhǔn)確率達(dá)到95%，可以通過(guò)調(diào)節(jié)其在主肽鏈的插入密度定向調(diào)控納米顆粒的尺寸。海洋貽貝的水下黏附特性主要來(lái)源于貽貝足絲蛋白中特殊的3，4-二羥苯丙氨酸即多巴結(jié)構(gòu)。Yang等［28］構(gòu)建了酪氨酸Tyr營(yíng)養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌工程菌株，在3，4-二羥苯丙氨酸添加的基本培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過(guò)內(nèi)源性酪氨酰-tRNA合成酶（TyrRS）可以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)特異性摻入非天然氨基酸。利用該策略獲得的重組貽貝黏附蛋白中多巴摻入效率＞90%，因此重組黏附蛋白表現(xiàn)出優(yōu)異的表面黏附性能，水下黏附性能甚至可以媲美天然蛋白。該體內(nèi)修飾合成策略的摻入效率遠(yuǎn)超體外反應(yīng)，有望進(jìn)一步拓展到其他翻譯后修飾殘基如4-羥基精氨酸和O-磷酸絲氨酸等。

利用單一或多生物來(lái)源的功能基序的重組進(jìn)行高性能蛋白設(shè)計(jì)近年來(lái)也獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展。Buehler和Kaplan教授團(tuán)隊(duì)［29］利用介觀耗散粒子動(dòng)力學(xué)（dissipative particle dynamics，DPD）模擬對(duì)重組蛛絲蛋白進(jìn)行模塊化設(shè)計(jì)并揭示形成蛋白組裝體的關(guān)鍵設(shè)計(jì)參數(shù)。DPD模擬表明，蛛絲蛋白β-sheets折疊/無(wú)定形模塊的比例和二者的聚合度即蛋白分子量是控制蛋白組裝和性能的兩個(gè)重要因素，這為在分子水平上捕獲蛋白組裝結(jié)構(gòu)和特征從而實(shí)現(xiàn)蛋白分子理性設(shè)計(jì)提供了方案。在人工蛛絲蛋白纖維研究中，蛛絲蛋白核心結(jié)構(gòu)域的重復(fù)單元，包括β-sheets折疊模塊和無(wú)定形模塊，通常是研究者的主要關(guān)注點(diǎn)。然而，Scheibel團(tuán)隊(duì)［30］在核心結(jié)構(gòu)域重復(fù)單元基礎(chǔ)上引入天然蛛絲蛋白末端結(jié)構(gòu)域，探索并證實(shí)了蛛絲蛋白末端結(jié)構(gòu)域尤其是羧基端結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍追肿幼越M裝及纖維性能的重要影響。

蛋白分子的折疊結(jié)構(gòu)是決定蛋白組裝體內(nèi)部超分子相互作用以及組裝體性能的關(guān)鍵因素。蛋白分子的折疊結(jié)構(gòu)比它們的序列和功能更加保守，將具有特定折疊結(jié)構(gòu)的、不同生物功能的基序進(jìn)行重組，融合蛋白或可超越天然蛋白范疇兼具多種優(yōu)勢(shì)。鐘超等［31］設(shè)計(jì)了基于大腸桿菌生物膜主要成分（CsgA蛋白）和貽貝足絲蛋白Mfps融合的雜化蛋白分子，該雜化蛋白分子能夠進(jìn)行多級(jí)自組裝形成超級(jí)納米纖維結(jié)構(gòu)，分子動(dòng)態(tài)模擬分析表明CsgA自組裝形成淀粉樣蛋白纖維核心結(jié)構(gòu)域，而貽貝足絲蛋白暴露在纖維表面。組裝結(jié)構(gòu)的水下黏合性能可以達(dá)到20.9 mJ/m2，遠(yuǎn)超單獨(dú)的貽貝足絲蛋白和大腸桿菌生物膜蛋白。在進(jìn)一步的工作中，該團(tuán)隊(duì)［32］將哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA結(jié)合蛋白TDP43的低復(fù)雜結(jié)構(gòu)域LC與貽貝黏附蛋白Mfp5融合制備重組蛋白TLC-M，TLC-M融合蛋白在低溫下通過(guò)LC結(jié)構(gòu)域的液-液相分離性質(zhì)形成蛋白濃度很高的凝結(jié)體，該液態(tài)凝結(jié)體很容易吸附在基底表面，并且層層吸附，最后TLC-M液態(tài)凝結(jié)體能進(jìn)一步脫水組裝成致密的淀粉樣蛋白纖維涂層，表現(xiàn)出很強(qiáng)的水下黏附性能，這為構(gòu)建液-固相轉(zhuǎn)變和自組裝驅(qū)動(dòng)的可控功能蛋白材料提供了新方向。

在本課題組前期工作中，通過(guò)不同生物來(lái)源的結(jié)構(gòu)蛋白模塊重組，突破了傳統(tǒng)絲素蛋白的范疇［33］，開(kāi)發(fā)出具有高力學(xué)性能的重組結(jié)構(gòu)蛋白［圖1（a）］?；趯?duì)自然界多種具有優(yōu)異力學(xué)性能的結(jié)構(gòu)蛋白功能基序的篩選，本團(tuán)隊(duì)［34］將魷魚環(huán)齒蛋白SRT高度折疊的晶體結(jié)構(gòu)域（PAATAVSHTTHHAP）與超電荷類彈性蛋白［VPGVG（VPGKG）n］進(jìn)行重組，兩者可分別形成β-sheets折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白分子中力學(xué)剛性和延展性的結(jié)合。另一方面，重組蛋白嵌合體中超電荷類彈性蛋白模塊具有高度親水性，能夠有效幫助重組蛋白正確折疊并維持構(gòu)象穩(wěn)定，更容易在表達(dá)宿主中實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)。該工作突破了絲素蛋白范疇，實(shí)現(xiàn)了高力學(xué)性能的重組結(jié)構(gòu)蛋白的開(kāi)發(fā)，相應(yīng)的蛋白設(shè)計(jì)和生物合成策略可以拓展到其他非絲素蛋白中［圖1（a）、（b）］。

圖1 基于多生物融合的人工結(jié)構(gòu)蛋白的設(shè)計(jì)（a）、模塊重組（b）與生物合成（c）Fig.1 Schematic diagram of design(a),recombination(b)and biosynthesis(c)of the man-made structural proteins

圣路易斯華盛頓大學(xué)Li等［35］通過(guò)引入淀粉樣蛋白序列設(shè)計(jì)合成了新型重組蛛絲蛋白，他們將3種不同的淀粉樣多肽序列分別與蛛絲蛋白中富含甘氨酸的柔性結(jié)構(gòu)域（GGX）n進(jìn)行重組，合成了具有不同分子量的蛋白聚合體。含有淀粉樣多肽FGAILSS的重組序列的128聚體制備的纖維拉伸強(qiáng)度達(dá)到0.98 GPa，平均韌性為161 MJ/m3，該性能超過(guò)了大多數(shù)重組蛋白纖維以及一些天然蛛絲纖維。這項(xiàng)工作巧妙利用了淀粉樣多肽傾向于形成β-納米晶的特點(diǎn)，該策略或可應(yīng)用于其他含有β-折疊結(jié)構(gòu)域的蛋白序列中。

借助蛋白3D結(jié)構(gòu)解析、計(jì)算模擬以及機(jī)器學(xué)習(xí)等技術(shù)，蛋白分子的從頭設(shè)計(jì)已經(jīng)成為可能［36］，且具有合理的成功率。例如，蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)領(lǐng)域的巨擘David Baker團(tuán)隊(duì)［37-42］利用Rosetta方法設(shè)計(jì)了蛋白納米籠、蛋白晶格、熒光蛋白類似物、人工酶和白介素類似物等。該團(tuán)隊(duì)［43］首次描述了從頭設(shè)計(jì)單體蛋白自組裝為螺旋狀蛋白絲，將有助于更好地了解天然蛋白動(dòng)態(tài)、多尺度組裝的結(jié)構(gòu)和力學(xué)，為創(chuàng)造全新的、多尺度組裝的功能蛋白材料提供了可能性。最近AlphaFold在蛋白結(jié)構(gòu)高精度預(yù)測(cè)方面的成功［44-45］，也將直接促進(jìn)蛋白反向折疊問(wèn)題的突破和蛋白分子設(shè)計(jì)的發(fā)展，預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)，將會(huì)催生出一系列基于深度學(xué)習(xí)的蛋白設(shè)計(jì)新方法。

1.3 結(jié)構(gòu)蛋白微生物合成系統(tǒng)優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)高性能生物結(jié)構(gòu)蛋白往往具有特殊氨基酸或序列高度重復(fù)的特點(diǎn)，一些蛋白如蛛絲蛋白、蓑衣蟲絲蛋白、肌聯(lián)蛋白和彈性蛋白等分子量較高，可以達(dá)到100～500 kDa，這無(wú)疑增加了高性能蛋白在異源系統(tǒng)中合成的難度。因此，為了滿足高性能材料制備對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)和功能的需求，研究者們通過(guò)開(kāi)發(fā)適配的表達(dá)元件、表達(dá)系統(tǒng)來(lái)提升高性能蛋白在異源合成系統(tǒng)中的表達(dá)量，降低后續(xù)純化難度。在本課題組的前期工作中，我們通過(guò)對(duì)酵母表達(dá)系統(tǒng)的分泌元件進(jìn)行優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)了超正電荷重組類彈性蛋白的分泌表達(dá)（圖1）。此外，通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了該蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)的宏量制備（圖1），產(chǎn)量可達(dá)200～500 mg/L［46］。

針對(duì)蛛絲蛋白序列甘氨酸含量高的特點(diǎn)，Xia等［47］對(duì)大腸桿菌表達(dá)宿主的代謝途徑進(jìn)行了改造，通過(guò)tRNAGly基因和glyA基因的協(xié)同高效表達(dá)，提升大腸桿菌宿主中甘氨酸的供給以及甘氨酰-tRNA的含量，以滿足蛛絲蛋白翻譯過(guò)程需求。作者構(gòu)建了不同聚合度的重組蛛絲蛋白，經(jīng)代謝工程改造的大腸桿菌宿主中各蛋白的表達(dá)量提升了10～35倍，成功合成了分子量接近天然蛛絲蛋白的重組蛋白（284.9 kDa），利用此高分子量蛋白制備的纖維，其綜合力學(xué)性能可以媲美天然蛛絲，纖維楊氏模量甚至達(dá)到了天然蛛絲的2倍。

生物結(jié)構(gòu)蛋白的分泌表達(dá)不僅可以規(guī)避蛋白胞內(nèi)降解問(wèn)題，同時(shí)可以提升純化回收得率，對(duì)于蛋白材料的綠色可持續(xù)合成具有重要意義。上海交通大學(xué)錢志剛團(tuán)隊(duì)［48］首次建立了以谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）為宿主的蛛絲蛋白高效分泌生產(chǎn)平臺(tái)。研究發(fā)現(xiàn)重組蛛絲蛋白可以在特定信號(hào)肽的引導(dǎo)下經(jīng)Sec分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，進(jìn)一步通過(guò)在轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌過(guò)程進(jìn)行多水平的宿主代謝工程改造以及高密度發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)了重組蛛絲蛋白在胞外培養(yǎng)基中的高豐度富集。通過(guò)簡(jiǎn)單的酸沉淀和硫酸銨沉淀即可獲得高純度蛋白，純化得率遠(yuǎn)超色譜純化方法，達(dá)到2.2 g/L。此外，分泌表達(dá)的重組蛛絲蛋白具有超越天然蛋白的水溶性，可以在水相緩沖條件下制備高濃度紡絲原液，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)生物仿生紡絲具有重要意義。

隨著基因組編輯工具CRISPR/Cas敲低技術(shù)（CRISPRi）在細(xì)菌高通量功能篩選中的應(yīng)用，可以一次性研究細(xì)菌中數(shù)千個(gè)基因和特定表型的關(guān)系［49-50］。相較于傳統(tǒng)的利用單基因缺失或過(guò)表達(dá)來(lái)鑒定菌株表型的方法，該技術(shù)提供了一種精確、高通量定位菌株代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有力工具，在蛋白高效表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與篩選中具有重要應(yīng)用價(jià)值。此外，噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化（phageassisted continuous evolution，PACE）技術(shù)可以在人工合成系統(tǒng)定向進(jìn)化蛋白分子。該技術(shù)通過(guò)將目標(biāo)蛋白的所需活性與攜帶該蛋白相應(yīng)基因的傳染性噬菌體的適應(yīng)性聯(lián)系起來(lái)，具有更高期望活性的蛋白對(duì)其載體噬菌體具有更大的感染性，因此可以更有效地繁殖，從而富集有利的突變，實(shí)現(xiàn)蛋白分子特定功能的定向進(jìn)化［51-56］，如哈佛大學(xué)Liu課題組［52］開(kāi)發(fā)了可溶性表達(dá)噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化技術(shù)（soluble expression phage-assisted continuous evolution，SE-PACE），可以快速進(jìn)化出大腸桿菌中可溶性表達(dá)增強(qiáng)的單鏈抗體蛋白。未來(lái)有望通過(guò)開(kāi)發(fā)新的篩選工具，擴(kuò)大特征譜，在噬菌體細(xì)胞工廠中實(shí)現(xiàn)蛋白特定結(jié)構(gòu)或功能的自動(dòng)化選擇。

2 人工結(jié)構(gòu)蛋白組裝與性能優(yōu)化

2.1 動(dòng)態(tài)共價(jià)相互作用介導(dǎo)的人工結(jié)構(gòu)蛋白組裝

雖然蛋白材料尤其是纖維材料的力學(xué)性能通常與蛋白分子量呈正相關(guān)，但是在異源宿主中合成高分子量蛋白仍然是一個(gè)較大的挑戰(zhàn)，并且隨著蛋白分子量的增加，其異源合成效率明顯降低［47］。因此，蛋白“共價(jià)”相互作用被引入人工合成系統(tǒng)用來(lái)發(fā)展高分子量甚至超高分子量的結(jié)構(gòu)蛋白［57］。中科院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所的王強(qiáng)斌研究員等［58］通過(guò)在煙草花葉病毒衣殼蛋白中引入點(diǎn)突變，包括在橫向或軸向上選取特定氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，連接相鄰亞基構(gòu)成二聚體，通過(guò)該策略成功在蛋白中引入二硫鍵共價(jià)作用網(wǎng)絡(luò)，制備了超長(zhǎng)、超穩(wěn)定的組裝納米結(jié)構(gòu)。該工作對(duì)蛋白質(zhì)自組裝調(diào)控及其應(yīng)用拓展具有很好的啟發(fā)作用。圣路易斯華盛頓大學(xué)Zhang研究團(tuán)隊(duì)［59］通過(guò)內(nèi)含肽自剪接實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)重組蛛絲蛋白的共價(jià)連接，制備了分子量達(dá)到556 kDa的超高分子量重組蛛絲蛋白。利用該重組蛋白制備的纖維拉伸強(qiáng)度、模量、延展性和韌性均達(dá)到天然蛛絲水平。內(nèi)含肽剪接需要的兩段序列IntN和IntC完全由天然氨基酸組成，可以作為一種普適性的連接工具插入到任意結(jié)構(gòu)蛋白的編碼序列中。在Zhang團(tuán)隊(duì)［60］進(jìn)一步的工作中，將IntN和IntC同時(shí)連接到“單體”肌聯(lián)蛋白4Ig的兩個(gè)末端得到重組蛋白IntN-4Ig-IntC，重組蛋白可以在大腸桿菌系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高穩(wěn)定性、高通量的合成，更重要的是，在內(nèi)含肽剪接作用下重組蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行多輪聚合反應(yīng)形成超高分子量的肌連蛋白聚合體，平均分子量可到2.4 MDa。超高分子量蛋白聚合體包含更多的重復(fù)單元，有利于增加蛋白分子鏈間和鏈內(nèi)的相互作用。

本團(tuán)隊(duì)前期工作中，通過(guò)發(fā)展雙通道微流控紡絲技術(shù)，成功利用蛋白游離氨基和戊二醛，形成動(dòng)態(tài)亞胺鍵誘導(dǎo)蛋白有序組裝結(jié)構(gòu)［圖2（a）］，在水相條件下實(shí)現(xiàn)了交聯(lián)誘導(dǎo)的蛋白原位組裝。該策略具有很好的普適性，已成功應(yīng)用于牛血清白蛋白［64］、重組類彈性蛋白、重組魷魚環(huán)齒蛋白［34］和重組節(jié)肢彈性蛋白［61］等。我們通過(guò)遞歸同源重組等方式實(shí)現(xiàn)了不同聚合度的重組蛋白的構(gòu)建，實(shí)驗(yàn)表明蛋白纖維的力學(xué)性能與蛋白分子的聚合度呈正相關(guān)［圖2（a）］。進(jìn)一步通過(guò)在重組蛋白末端引入半胱氨酸殘基，利用二硫鍵增強(qiáng)蛋白分子末端交聯(lián)可以進(jìn)一步提升纖維性能［34］。重組魷魚環(huán)齒蛋白36聚體-Cys蛋白纖維的斷裂強(qiáng)度高達(dá)650 MPa，韌性達(dá)到120 MJ/m3，優(yōu)于許多高分子量（＞250 kDa）的人工蛛絲蛋白［34］。

通過(guò)共價(jià)相互作用介導(dǎo)蛋白與其他有機(jī)/無(wú)機(jī)分子復(fù)合也是實(shí)現(xiàn)人工蛋白功能拓展的重要技術(shù)手段。杜克大學(xué)Chilkoti團(tuán)隊(duì)［65］報(bào)道了在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中直接合成烷基鏈修飾的重組類彈性蛋白，在人工合成系統(tǒng)中進(jìn)行類彈性蛋白底物與酵母來(lái)源的N-肉豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶（NMT）的共表達(dá)。后者催化酰胺鍵的形成將C14烷基鏈修飾到蛋白底物的N′端，脂質(zhì)化多肽能夠通過(guò)溫度調(diào)控實(shí)現(xiàn)分級(jí)自組裝，利用蛋白組裝體內(nèi)部的脂質(zhì)核結(jié)構(gòu)可以負(fù)載疏水小分子藥物，并且能夠有效提升藥物分子的體內(nèi)半衰期［66］。

本文作者團(tuán)隊(duì)［62］開(kāi)發(fā)了高性能人工蛋白復(fù)合策略，利用共價(jià)鍵誘導(dǎo)多重分子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)以提升蛋白組裝體系的力學(xué)性能。首先，我們通過(guò)基因工程的手段設(shè)計(jì)基本重復(fù)單元為VPGKG的重組類彈性蛋白Kn（n代表賴氨酸數(shù)量），重組類彈性蛋白與帶有負(fù)電的納米纖維素（CNF）之間通過(guò)靜電相互作用交聯(lián)后，進(jìn)一步利用戊二醛或EDC/NHS對(duì)復(fù)合纖維進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。通過(guò)共價(jià)交聯(lián)后，重組蛋白-納米纖維素復(fù)合纖維的整體力學(xué)性能得到明顯的提升［圖2（b）］。在另一項(xiàng)工作中，利用人工蛋白游離氨基與與海藻酸鹽羧基之間所形成的共價(jià)酰胺鍵和靜電相互作用以及Ca2+與海藻酸鹽的配位作用構(gòu)建了多重超分子網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)了高力學(xué)性能的人工蛋白-海藻酸鈉復(fù)合纖維的制備［圖2（c）］［63］。纖維內(nèi)部超分子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)有效限制了分子滑動(dòng)，對(duì)提高復(fù)合纖維的力學(xué)性能起著至關(guān)重要的作用。與傳統(tǒng)多糖或復(fù)合纖維相比，生物合成蛋白誘導(dǎo)的多重交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)復(fù)合纖維具有優(yōu)異的力學(xué)性能，復(fù)合纖維的最高斷裂強(qiáng)度可達(dá)768 MPa，楊氏模量可達(dá)24 GPa，韌性可達(dá)69 MJ/m3。該方法為制造高性能復(fù)合蛋白材料提供了技術(shù)參考。

圖2 動(dòng)態(tài)共價(jià)相互作用介導(dǎo)的人工結(jié)構(gòu)蛋白組裝Fig.2 Dynamic covalent interactions-mediated assembly of the recombinant structural proteins

拓?fù)渥鳛殚L(zhǎng)度和序列這兩個(gè)參數(shù)之外的一個(gè)新維度，也被加入到蛋白的人工組裝工程中。拓?fù)鋮?shù)將蛋白分子從線性的、一維多肽鏈轉(zhuǎn)化為多鏈、多維的可設(shè)計(jì)元素。通過(guò)引入共價(jià)的蛋白-蛋白相互作用可以實(shí)現(xiàn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)蛋白組裝體的合成。比如，利用“肽-蛋白對(duì)”SpyTag/SpyCather可以重組并形成異肽鍵的性質(zhì)［67］，研究者開(kāi)發(fā)出大量的具有支鏈結(jié)構(gòu)或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的蛋白分子并發(fā)展為相應(yīng)的響應(yīng)型或功能增強(qiáng)型蛋白材料［68-69］。國(guó)家納米科學(xué)中心王浩研究員團(tuán)隊(duì)［70］通過(guò)發(fā)展“活體自組裝”技術(shù)，在細(xì)胞內(nèi)成功構(gòu)建了不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的蛋白材料。作者提出了全新的細(xì)胞內(nèi)原位聚合和組裝策略，設(shè)計(jì)的多肽單體通過(guò)自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞，并在胞內(nèi)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的催化下發(fā)生共價(jià)聚合，通過(guò)設(shè)計(jì)不同氨基酸序列的多肽聚合單體，實(shí)現(xiàn)了在胞內(nèi)聚合過(guò)程中對(duì)蛋白組裝體的分子量、溫敏性質(zhì)以及組裝后的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控。作者進(jìn)一步評(píng)價(jià)了不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)蛋白組裝體的生物功能，該工作為研究蛋白組裝體結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系提供了有效手段，為功能化蛋白材料設(shè)計(jì)提供了參考。

2.2 非共價(jià)相互作用介導(dǎo)的人工結(jié)構(gòu)蛋白組裝

蛛絲蛋白β-sheets折疊結(jié)構(gòu)內(nèi)部豐富的氫鍵作用等對(duì)于促進(jìn)蛋白分子自組裝和穩(wěn)定組裝結(jié)構(gòu)具有重要作用。Scheibel團(tuán)隊(duì)［71］報(bào)道了兩種重組蛛絲蛋白NTD-eADF3-CTD和NTD-eADF4-CTD共表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)蛛絲蛋白CTD結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基氧化形成二硫鍵，兩個(gè)共表達(dá)蛋白可以在菌體內(nèi)組裝為同源二聚體或異源二聚體。研究發(fā)現(xiàn)eADF3同源二聚體或eADF3/eADF4異源二聚體能夠進(jìn)一步組裝形成納米原纖維結(jié)構(gòu)［圖3（a）］，有助于達(dá)到更高的機(jī)械強(qiáng)度。值得注意的是，異源二聚體纖維的綜合力學(xué)性能優(yōu)于同源二聚體，拉伸強(qiáng)度可以達(dá)到834 MPa，超過(guò)了絕大多數(shù)的重組蛛絲纖維甚至是傳統(tǒng)化學(xué)纖維。該發(fā)現(xiàn)提示可以通過(guò)人工合成系統(tǒng)控制蛋白組合及其含量，進(jìn)而影響蛋白的裝配特性并激發(fā)蛋白組裝體新的有利性質(zhì)。

圖3 非共價(jià)相互作用介導(dǎo)的人工結(jié)構(gòu)蛋白組裝（a）蛋白末端結(jié)構(gòu)域及折疊結(jié)構(gòu)內(nèi)部作用誘導(dǎo)的蛋白有序自組裝［71］；（b）人工蛋白與長(zhǎng)鏈DNA分子的復(fù)合組裝［61］；（c～d）超電荷重組類彈性蛋白與表面活性劑分子的復(fù)合組裝［72-73］Fig.3 Non-covalent interactions-mediated assembly of the recombinant structural proteins(a)Protein self-assembly induced by both C-terminal domain and internal actions among secondary structural elements[71];(b)Composite assembly of recombinant structural proteins and DNA molecules[61];(c～d)Composite assembly of supercharged recombinant structural proteins and surfactant molecules[72-73]

將多肽或蛋白模塊與其他生物/非生物組分通過(guò)非共價(jià)相互作用進(jìn)行結(jié)合，制備復(fù)合組裝超分子體系是實(shí)現(xiàn)功能集成的有效策略。中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所李峻柏教授團(tuán)隊(duì)［74］通過(guò)陽(yáng)離子二肽與多金屬氧酸鹽（POMs）間的靜電相互作用共組裝形成雜化超分子結(jié)構(gòu)。上海交通大學(xué)周永豐教授團(tuán)隊(duì)［75］通過(guò)藻藍(lán)蛋白與四臂卟啉星形聚合物的靜電自組裝，制備了類膠束雜化天然人工捕光納米系統(tǒng)。復(fù)旦大學(xué)陳國(guó)頌教授團(tuán)隊(duì)［76］通過(guò)蛋白和多糖分子間的相互作用以及π-π堆積作用，成功利用大豆凝集素蛋白四聚體制備了精確組裝的蛋白微管結(jié)構(gòu)，具有增強(qiáng)免疫反應(yīng)的能力。本團(tuán)隊(duì)［61］前期工作中，通過(guò)長(zhǎng)鏈鮭魚精DNA（2000 bp）與不同聚合度的重組節(jié)肢彈性蛋白（RS蛋白）的靜電相互作用構(gòu)建RS-DNA復(fù)合纖維，RS蛋白和DNA以賴氨酸與磷酸鹽比例為1∶1或2∶1的比例混合在水溶液中，形成“液-液”相分離的凝聚復(fù)合物，進(jìn)一步通過(guò)復(fù)合物拉伸可制備復(fù)合纖維［圖3（b）］。由于RS蛋白與DNA骨架之間的靜電絡(luò)合作用，當(dāng)纖維被拉伸時(shí)，RS蛋白的彈性區(qū)域沿著堅(jiān)硬的DNA骨架滑行，因此該復(fù)合纖維具有極強(qiáng)的延展性和韌性，其中RS24-DNA纖維的韌性高達(dá)250 MJ/m3，超過(guò)許多聚合物纖維，甚至可媲美天然蛛絲纖維。

此外，本文作者團(tuán)隊(duì)利用超負(fù)電荷類彈性蛋白與陽(yáng)離子型表面活性劑的靜電絡(luò)合成功開(kāi)發(fā)機(jī)械響應(yīng)型蛋白液晶材料，實(shí)現(xiàn)了剪切力誘導(dǎo)的蛋白流體無(wú)序-有序的相轉(zhuǎn)變，通過(guò)蛋白液晶雙折射紋理讀出機(jī)械感應(yīng)的圖案可以用于記錄指紋信息［77］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，超負(fù)電荷類彈性蛋白與長(zhǎng)烷基鏈陽(yáng)離子型表面活性劑復(fù)合可形成長(zhǎng)程有序的層狀結(jié)構(gòu)，并以此發(fā)展了新型的蛋白液晶材料［78］。進(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)重組類彈性蛋白的電荷密度，能夠有效調(diào)節(jié)所負(fù)載的表面活性劑分子的結(jié)合量和超分子作用力（靜電力，疏水相互作用，范德華力，氫鍵等），可用于制備蛋白液晶凝膠纖維［79］。研究發(fā)現(xiàn)電荷密度加倍后凝膠纖維的機(jī)械強(qiáng)度、楊氏模量和韌性顯著提升。該研究通過(guò)改造人工蛋白氨基酸序列改變材料的力學(xué)性能，為發(fā)展具有可編程特性的機(jī)械生物材料提供了一種簡(jiǎn)便方法。

類似地，超正電荷蛋白與陰離子表面活性劑之間的超分子相互作用也可用于拓展蛋白組裝體系的性能。本團(tuán)隊(duì)馬超、孫靜等［72-73］利用超正電荷重組類彈性蛋白和帶有苯磺酸、多巴或偶氮苯結(jié)構(gòu)的陰離子表面活性劑的靜電絡(luò)合制備了具有超強(qiáng)界面黏附性能的蛋白材料，體系中的多種超分子相互作用尤其是陽(yáng)離子-π、π-π和金屬配位相互作用，對(duì)蛋白組裝體的強(qiáng)黏附行為作出了重要貢獻(xiàn)［圖3（c）、（d）］。孫靜等［80］進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了一種新型的蛋白-表面活性劑復(fù)合蛋白纖維，通過(guò)金屬離子配位作用能夠顯著提升纖維的力學(xué)性能，更重要的是，稀土離子配位賦予纖維穩(wěn)定的熒光性能，該研究為人工蛋白材料的合成、力學(xué)性能調(diào)控以及與無(wú)機(jī)材料的功能整合提供了新策略。

此外，在本課題組前期工作中，成功發(fā)展了人工結(jié)構(gòu)蛋白與聚乙二醇羧酸鹽、硫酸軟骨素等復(fù)合的蛋白納米組裝體系。我們利用設(shè)計(jì)合成的超正電荷類彈性蛋白與聚乙二醇羧酸鹽的靜電復(fù)合成功制備出蛋白聚集體納米顆粒，蛋白納米顆粒的形成源于聚乙二醇羧酸鹽屏蔽重組類彈性蛋白電荷后后者發(fā)生“親水態(tài)”-“疏水態(tài)”相轉(zhuǎn)變［81］。利用此類蛋白聚集體納米顆粒，成功發(fā)展近紅外熒光蛋白納米探針和多種長(zhǎng)效藥物載體［81-85］，其中近紅外熒光蛋白納米探針可以通過(guò)尾靜脈注射直接實(shí)現(xiàn)實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移瘤的成像監(jiān)測(cè)，突破了熒光蛋白依靠基因轉(zhuǎn)染才能發(fā)揮作用的瓶頸；長(zhǎng)效藥物載體可將蛋白藥物IL1-Ra的體內(nèi)半衰期提升約5倍，生物利用度提升約7倍，顯著提升對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)等骨關(guān)節(jié)疾病的治療效果，給藥周期可延長(zhǎng)14倍［82，85］。

3 高性能蛋白纖維及黏合劑材料應(yīng)用

合成生物學(xué)為創(chuàng)造具有定制形態(tài)和功能的蛋白材料提供了可能性。高性能蛋白應(yīng)用的核心問(wèn)題在于如何利用蛋白分子構(gòu)筑更高級(jí)次的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，使人工蛋白分子組裝成為功能性的宏觀體系。中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所閆學(xué)海教授等［86］、鹽城工學(xué)院邵榮教授等［87］對(duì)通過(guò)蛋白自組裝、酶催化等手段制備肽基水凝膠的工作進(jìn)行了詳細(xì)綜述。在此，我們將對(duì)通過(guò)蛋白的多級(jí)有序組裝制備具有高力學(xué)性能或高黏附性能的纖維與黏合劑材料的代表性研究進(jìn)行總結(jié)（表1）。目前，已有的人工高性能蛋白組裝方法有著一些難以規(guī)避的缺點(diǎn)，包括組裝過(guò)程蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致對(duì)超分子作用網(wǎng)絡(luò)的損害、偏重于蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)而忽略了α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)力學(xué)功能的貢獻(xiàn)、難以實(shí)現(xiàn)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)控等。因此，如何對(duì)組裝過(guò)程進(jìn)行控制，實(shí)現(xiàn)精細(xì)動(dòng)態(tài)調(diào)控和多尺度組裝，仍然是高性能蛋白材料體系整體性能提升及應(yīng)用面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。

表1 高性能蛋白纖維和黏合劑材料性能匯總Tab.1 Properties of high-performance protein fibers and adhesives

3.1 高性能蛋白纖維材料開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

絲蛋白纖維如蛛絲、蠶絲具有低密度、高強(qiáng)度、高延展性和生物相容性等特點(diǎn)，在過(guò)去數(shù)十年間，絲素蛋白一直是開(kāi)發(fā)蛋白纖維材料的首選［87，89-90］。人工絲蛋白纖維已被成功應(yīng)用于紡織、軍工和生物醫(yī)學(xué)材料等領(lǐng)域［91-92］。近年來(lái)，組學(xué)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展拓展了高性能生物結(jié)構(gòu)蛋白的序列信息［93］，為利用新型結(jié)構(gòu)蛋白制備高性能、多功能的纖維材料提供了支持。Gaddes等［94］利用魷魚環(huán)齒蛋白SRT溫度響應(yīng)的相轉(zhuǎn)變和自組裝特性，通過(guò)SRT涂層修飾制備了具有自修復(fù)能力的纖維及織物。南洋理工大學(xué)Fu等［95］利用盲鰻黏液蛋白制備人工纖維材料，盲鰻黏液蛋白的兩個(gè)亞基EsTkα和EsTkγ可以組裝為中間絲結(jié)構(gòu)，外力拉伸能夠誘導(dǎo)中間絲延展并生成β-sheets鏈段，因此盲鰻黏液蛋白人工纖維具有良好的延展性，同時(shí)通過(guò)蛋白賴氨酸殘基之間的共價(jià)交聯(lián)能夠顯著提升纖維材料的拉伸模量。

微流控技術(shù)能夠?qū)徑z條件如離子強(qiáng)度、pH以及剪切力等進(jìn)行梯度控制，這為在紡絲過(guò)程中實(shí)現(xiàn)蛋白分子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)精細(xì)調(diào)控，誘導(dǎo)蛋白多級(jí)結(jié)構(gòu)形成，減少蛋白分子間缺陷，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蛋白分子從“分子-納米-宏觀”跨尺度協(xié)同組裝提供了可能［96］。本團(tuán)隊(duì)［97］進(jìn)一步將該紡絲策略應(yīng)用于膠原蛋白和各類卵白，發(fā)展了高強(qiáng)度、可生物降解的纖維縫合線材料，并成功應(yīng)用于動(dòng)物模型中皮膚和器官傷口的穩(wěn)定縫合［圖4（a）］。

圖4 高性能蛋白纖維材料在生物體內(nèi)的應(yīng)用Fig.4 Applications of high-performance protein fibers in vivo

此外，結(jié)構(gòu)蛋白分子與其他有機(jī)/無(wú)機(jī)分子的復(fù)合或雜化也是蛋白纖維性能優(yōu)化的重要途徑。Mohammadi等［98］報(bào)道了利用三嵌段的重組蛛絲蛋白和納米纖維素制備高強(qiáng)高韌的復(fù)合蛋白纖維。三嵌段蛋白末端的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM）可以通過(guò)芳香殘基介導(dǎo)的疏水相互作用結(jié)合長(zhǎng)鏈納米纖維素，三嵌段蛋白中間的蛛絲蛋白結(jié)構(gòu)域具有較強(qiáng)的分子間相互作用，因此能夠自組裝成凝聚體從而增強(qiáng)納米纖維素長(zhǎng)鏈間的橋接，此外凝聚體的低黏度和表面張力也促進(jìn)了蛋白分子對(duì)納米纖維素的滲透與黏附，復(fù)合蛋白纖維材料與原纖維相比力學(xué)性能得到明顯提升。

在我們團(tuán)隊(duì)［99］的工作中，利用非共價(jià)/動(dòng)態(tài)共價(jià)相互作用構(gòu)建復(fù)合蛋白纖維，不僅能夠提升纖維的機(jī)械強(qiáng)度和韌性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)纖維材料的組織順應(yīng)性，拓展了高性能蛋白纖維的應(yīng)用領(lǐng)域。通過(guò)開(kāi)發(fā)超電荷重組類彈性蛋白并利用蛋白與帶相反電荷的表面活性劑分子的超分子組裝誘導(dǎo)二者的向列型排布，成功制備有機(jī)膠蛋白纖維，利用有機(jī)膠蛋白纖維各向異性的力學(xué)特性及其生物相容性，實(shí)現(xiàn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在纖維上的原位增殖和細(xì)胞分化［圖4（b）］。該項(xiàng)研究首次證明了蛋白各向異性組裝結(jié)構(gòu)在細(xì)胞力學(xué)生物學(xué)中應(yīng)用的可行性。利用超正電荷類彈性蛋白和偶氮苯基表面活性劑之間的靜電相互作用制備了蛋白纖維，并進(jìn)一步通過(guò)表面活性劑分子偶氮部分的光異構(gòu)化實(shí)現(xiàn)了光誘導(dǎo)纖維材料內(nèi)陽(yáng)離子-π相互作用增強(qiáng)，可逆地觸發(fā)了蛋白纖維的抗拉強(qiáng)度、剛度和韌性的調(diào)制。該研究為開(kāi)發(fā)刺激響應(yīng)的機(jī)械生物材料提供了新策略［100］。前述我們利用重組節(jié)肢彈性蛋白和濕法紡絲技術(shù)通過(guò)戊二醛與蛋白嵌合體賴氨酸殘基形成動(dòng)態(tài)亞胺鍵網(wǎng)絡(luò)制備了高拉伸強(qiáng)度的蛋白纖維及纖維補(bǔ)片，該纖維材料成功應(yīng)用于大鼠腹腔疝氣手術(shù)創(chuàng)口的修復(fù)，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗粘連和促進(jìn)修復(fù)的效果［61］［圖4（c）］。

本文作者團(tuán)隊(duì)［62］還利用重組類彈性蛋白-納米纖維素復(fù)合纖維（拉伸強(qiáng)度及韌性分別為551.2 MPa和40.6 MJ/m3）制備抗沖擊網(wǎng)并探究其抗沖擊性能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)合纖維抗沖擊網(wǎng)能夠承受3.0 g的鋼球從20 cm高處墜下引起的重力勢(shì)能，作為對(duì)照的納米纖維素抗沖擊網(wǎng)在高度為15 cm時(shí)即被擊穿。另外，當(dāng)質(zhì)量為13.9 g的鋼球從15 cm的高處墜下，復(fù)合纖維抗沖擊網(wǎng)能夠保護(hù)其下方的蓋玻片完整［圖5（a）］。復(fù)合纖維抗沖擊網(wǎng)可以承受比納米纖維素抗沖擊網(wǎng)高1.4倍的重力勢(shì)能，在抗沖擊材料領(lǐng)域具備良好的應(yīng)用前景。

我們的前期工作中，在超電荷類彈性蛋白與魷魚環(huán)齒蛋白嵌合體的基礎(chǔ)上［34］，進(jìn)一步通過(guò)調(diào)控嵌合體折疊域與非折疊域的比例實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白組裝體系結(jié)構(gòu)及性能的編程調(diào)控，實(shí)現(xiàn)蛋白材料的形貌與力學(xué)性能的可控調(diào)節(jié)，制備出具有優(yōu)異柔韌性和斷裂強(qiáng)度的宏觀蛋白組裝體［46］，進(jìn)一步將信息編碼多肽整合到蛋白組裝體系中，實(shí)現(xiàn)了蛋白組裝材料在信息存儲(chǔ)領(lǐng)域中的新應(yīng)用［圖5（b）］。

圖5 高性能蛋白纖維材料在抗沖擊（a）［62］和信息存儲(chǔ)領(lǐng)域（b）［46］的應(yīng)用Fig.5 Applications of high-performance protein fibers for impact resistance(a)[62]and information storage(b)[46]

3.2 高性能蛋白黏合材料開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

蛋白分子具有不同功能基團(tuán)的氨基酸側(cè)鏈決定了黏附材料的各種內(nèi)在性質(zhì)，并使其與不同表面發(fā)生特定的相互作用。此外，結(jié)構(gòu)蛋白分子通過(guò)特殊的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)形成相應(yīng)的氨基酸側(cè)鏈的空間排列從而影響蛋白與不同底片的黏附性能［101-102］。英國(guó)曼徹斯特大學(xué)Roberts等［103］報(bào)道了非共價(jià)交聯(lián)牛血清白蛋白和低分子量的重組蜘蛛絲蛋白（NTD-R7-CTD）在玻璃等透明基質(zhì)上具有較強(qiáng)黏附性能，分別為8.53 MPa和6.28 MPa，其黏附性能主要來(lái)源于脫水誘導(dǎo)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)重組，形成β-折疊的超分子結(jié)合和密集的氫鍵作用網(wǎng)絡(luò)。此外，兩類蛋白黏合劑均具有很好的可見(jiàn)透明度和環(huán)境穩(wěn)定性，有望替代傳統(tǒng)化學(xué)黏合劑用于透明底片黏合。

近年來(lái)基于貽貝足絲蛋白的仿生黏合劑受到廣泛研究。貽貝足絲蛋白中含有鄰苯二酚即多巴結(jié)構(gòu)，多巴羥基可以通過(guò)氫鍵在極性表面進(jìn)行化學(xué)吸附，在氧化或堿性條件下，通過(guò)將鄰苯二酚羥基氧化為鄰苯醌能夠有效促進(jìn)蛋白的交聯(lián)反應(yīng)，這對(duì)于蛋白黏合劑的內(nèi)聚力和力學(xué)黏附性能至關(guān)重要。此外，多巴可以與金屬離子發(fā)生配位螯合反應(yīng)，并能與半胱氨酸、賴氨酸、酪氨酸等氨基酸側(cè)鏈形成陽(yáng)離子-π、π-π相互作用。因此，該類蛋白分子在干燥和潮濕環(huán)境中均展示出良好的力學(xué)黏附性能。許多研究通過(guò)在重組蛋白或合成多肽中模仿多巴功能化開(kāi)發(fā)具有高通用性和良好生物相容性的蛋白黏合材料［104-106］。

除貽貝外，沙堡蠕蟲和藤壺的分泌蛋白也具有良好的黏附性能。與貽貝足絲蛋白的黏附機(jī)制不同，沙堡蠕蟲蛋白除利用多巴結(jié)構(gòu)外，其黏附作用還依賴于另一類重要的氨基酸，即磷酸絲氨酸，磷酸絲氨酸可以通過(guò)二價(jià)陽(yáng)離子（如Ca2+）介導(dǎo)的靜電相互作用結(jié)合在一起促進(jìn)蛋白黏合體系的形成［107-109］。藤壺黏附蛋白的黏附性能則被認(rèn)為與蛋白自組裝過(guò)程以及蛋白內(nèi)部或分子間的疏水相互作用相關(guān)［110-112］。塔夫斯大學(xué)Omenetto團(tuán)隊(duì)［113］聯(lián)合貽貝足絲和藤壺蛋白的黏附機(jī)制開(kāi)發(fā)了由絲素蛋白、聚多巴胺和Fe3+組成的復(fù)合黏合劑，絲素蛋白用來(lái)仿生藤壺黏附蛋白的成鍵特性和βsheets組裝能力，聚多巴胺和Fe3+可以發(fā)揮交聯(lián)和固化的效果，該復(fù)合黏合劑的水下黏合強(qiáng)度高達(dá)2.4 MPa，甚至超過(guò)了大多數(shù)商用黏合材料。

本文作者團(tuán)隊(duì)的前期工作中，通過(guò)重組類彈性蛋白與其他分子復(fù)合，從而形成強(qiáng)內(nèi)聚性交聯(lián)分子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)展了系列多功能的蛋白基黏合材料。通過(guò)超正電荷類彈性蛋白與表面活性劑分子的靜電絡(luò)合形成復(fù)雜凝聚態(tài)膠水SUP-SDBS，SUP-SDBS黏合劑在多種底片（玻璃、金屬、PVC或PE）的黏附性能與商用氰基丙烯酸酯膠相當(dāng)。此外，對(duì)于動(dòng)物模型軟組織傷口具有良好的黏合效果，同時(shí)表現(xiàn)出積極的促進(jìn)止血和加速愈合的作用［圖6（a）］［72］。在上述工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了類彈性蛋白與多巴表面活性劑或偶氮苯表面活性劑（NDP和NAT）復(fù)合的黏合劑體系［73］。在多種超分子相互作用特別是靜電力、陽(yáng)離子-π相互作用和金屬配位的作用下，這種蛋白黏合劑在各種基質(zhì)、軟組織和內(nèi)部器官上表現(xiàn)出超高的黏附性能［圖6（b）］。此外，根據(jù)類彈性蛋白的可逆相變特性，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于熱響應(yīng)多肽的可逆溫度調(diào)控的動(dòng)態(tài)黏合材料［114］。與縫合線和商用化學(xué)黏合劑相比，蛋白黏合劑具有可生物降解的性質(zhì)和超分子結(jié)合特性，可能很好地適應(yīng)基質(zhì)和組織的動(dòng)力學(xué)，具有快速止血、避免炎癥反應(yīng)和加速愈合的作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。我們?cè)O(shè)計(jì)了重組類彈性蛋白-聚乙二醇羧酸鹽-硫酸軟骨素靜電復(fù)合組裝體系，雙靜電作用網(wǎng)絡(luò)顯著增強(qiáng)了組織黏附力，同時(shí)黏合劑體系的多重非共價(jià)作用提供了良好的形態(tài)學(xué)順應(yīng)性，并且能夠?qū)崿F(xiàn)硫酸軟骨素的緩釋，維持較高的生物活性，因此，該蛋白黏合劑為軟骨形成和軟骨相關(guān)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生提供了理想的生物相容性環(huán)境，拓展了在軟骨修復(fù)中的橫向整合作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物模型中骨關(guān)節(jié)損傷的高效修復(fù)［圖6（c）］［115］。

圖6 高性能蛋白黏合材料在生物體內(nèi)的應(yīng)用（a～b）超電荷重組類彈性蛋白-表面活性劑分子蛋白黏合劑在止血和傷口黏合中的應(yīng)用［72-73］；（c）重組類彈性蛋白雙網(wǎng)絡(luò)靜電復(fù)合蛋白黏合體系及軟骨修復(fù)應(yīng)用［115］；（d）近紅外光響應(yīng)的蛋白納米黏合體系及腫瘤光熱治療［88］Fig.6 Applications of high-performance protein adhesives in vivo(a～b)Supercharged ELPs-based adhesive and the applications in hemostasis and wound repair[72-73];(c)Fabrication of the engineered protein adhesive as a conjoined network and applications in cartilage repair[115];(d)Fabrication of protein photothermal bioplaster(protein-SDBS-GNRs)and non-invasive skin tumor therapy[88]

在我們團(tuán)隊(duì)最近的工作中，進(jìn)一步利用蛋白分子與有機(jī)/無(wú)機(jī)分子反應(yīng)的靈活性和多樣性，開(kāi)發(fā)了具有動(dòng)態(tài)響應(yīng)特性的、多功能的人工蛋白黏合材料［88］。我們通過(guò)基因工程的手段合成了超正電荷類彈性蛋白并在其兩端引入半胱氨酸殘基。金納米棒可以通過(guò)與半胱氨酸的巰基形成金硫鍵從而與蛋白共價(jià)絡(luò)合［88］。利用正電荷類彈性蛋白、金納米棒和十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）之間的共價(jià)絡(luò)合以及靜電作用制備了近紅外光響應(yīng)的蛋白納米黏合體系PPTB［圖6（d）］?；谝阂合喾蛛x得到的PPTB展現(xiàn)出了強(qiáng)大的黏附性能，其在鐵、鋁、玻璃等高能表面均展現(xiàn)出了超強(qiáng)的黏合強(qiáng)度（13.0～20.0 MPa），其性能表現(xiàn)甚至超過(guò)了商用的氰基丙烯酸鹽黏合劑。研究認(rèn)為，這一高性能表現(xiàn)可能來(lái)源于PPTB與表面的化學(xué)相互作用和機(jī)械互鎖行為。更為重要的是PPTB在離體豬皮上體現(xiàn)出近紅外光照增強(qiáng)的黏附性能，相較于不照射的豬皮，經(jīng)過(guò)照射之后的豬皮的黏合強(qiáng)度最高可提高17.5倍。黏合強(qiáng)度的增加源于PPTB在近紅外激光照射下產(chǎn)生的光熱效應(yīng)。其產(chǎn)生的熱量可以促進(jìn)水分子的蒸發(fā)，從而增強(qiáng)了PPTB體系中的陽(yáng)離子-π相互作用和氫鍵作用。同時(shí)光熱實(shí)驗(yàn)表明，PPTB具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能，其光熱轉(zhuǎn)換效率可達(dá)22%。強(qiáng)大的界面黏附力允許PPTB和皮膚表面之間進(jìn)行高效的熱傳遞，從而在808 nm激光照射下實(shí)現(xiàn)小鼠皮膚瘤的完全清除。該項(xiàng)工作為開(kāi)發(fā)蛋白-無(wú)機(jī)分子復(fù)合材料，推進(jìn)蛋白力學(xué)性能和光、電、磁功能融合提供了重要參考。

4 結(jié)論與展望

高性能結(jié)構(gòu)蛋白及其組裝材料在生物醫(yī)療器械、組織工程、生物基包裝產(chǎn)品、化妝品等高技術(shù)領(lǐng)域顯示出越來(lái)越重要的研究?jī)r(jià)值。隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于高性能蛋白材料體系的研究已經(jīng)突破了單一蛋白的限制，逐步發(fā)展了結(jié)構(gòu)蛋白功能模塊修飾、重組策略，人工合成系統(tǒng)和多尺度組裝方法，高性能蛋白材料體系的功能范圍也將不斷擴(kuò)展。此外，通過(guò)對(duì)蛋白及多尺度組裝體系的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，逐步強(qiáng)化了“蛋白序列-結(jié)構(gòu)組裝-材料性能”的理論框架。然而，由于缺乏適配的理論預(yù)測(cè)模型，蛋白材料的定向設(shè)計(jì)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。未來(lái)研究中亟需創(chuàng)建結(jié)構(gòu)蛋白序列庫(kù)和高通量的材料性能評(píng)估方法，進(jìn)而為深度學(xué)習(xí)算法提供大數(shù)據(jù)，反饋指導(dǎo)蛋白材料的理性、定向設(shè)計(jì)，這也進(jìn)一步凸顯出開(kāi)發(fā)新理論和新的計(jì)算工具的緊迫性。此外，高性能結(jié)構(gòu)蛋白生物合成的效率、規(guī)模和成本也是制約材料應(yīng)用的關(guān)鍵因素。結(jié)構(gòu)蛋白分泌表達(dá)的人工合成系統(tǒng)對(duì)于降低后續(xù)純化成本具有重要意義，我們預(yù)計(jì)基因組規(guī)模的基因編輯優(yōu)化和定向進(jìn)化技術(shù)或?qū)⒊蔀殚_(kāi)發(fā)高效合成宿主的有力工具。在蛋白材料的應(yīng)用方面，雖然蛋白分子具有生物相容性和可降解性的固有優(yōu)勢(shì)，但其環(huán)境耐受性和體內(nèi)穩(wěn)定性仍需全面考量，因此，通過(guò)與生物/非生物材料的功能集成開(kāi)發(fā)新的蛋白材料形式，突破穩(wěn)定性維持也將是實(shí)現(xiàn)蛋白材料應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。另外，自然界中許多蛋白材料具有自修復(fù)和自我再生的功能，如何通過(guò)自主設(shè)計(jì)使蛋白材料向自修復(fù)、自感知和自增殖的活體功能材料方向演進(jìn)是未來(lái)合成蛋白材料技術(shù)發(fā)展方向之一。