細菌生物被膜的軟物質(zhì)特性及其工程化應(yīng)用

朱潤濤，鐘超，戴卓君

（中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所，廣東 深圳 518055）

1 細菌生物被膜的軟物質(zhì)特性、動態(tài)性以及異質(zhì)性

細菌生物被膜（bacterial biofilm），是指細菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，并將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物［1-2］。細菌生物被膜是細菌為適應(yīng)自然環(huán)境所產(chǎn)生的有利于生存的一種生命現(xiàn)象，由微生物及其分泌物積聚而形成，其形成過程主要包括黏附、增殖、聚集、成熟和分離幾個主要階段。在自然界中，生物被膜可出現(xiàn)在包括自然、人工及宿主體內(nèi)環(huán)境的任何生態(tài)系統(tǒng)。生物被膜的形成對于微生物在惡劣環(huán)境下存活具有諸多優(yōu)勢。首先，生物被膜胞外基質(zhì)覆蓋在菌落表面形成保護屏障，使生物被膜細胞免受外界環(huán)境（例如抗生素）的攻擊；其次，細菌可通過生物被膜的群落間隙獲得營養(yǎng)及排除廢物；同時，生物被膜內(nèi)部可以富集多種酶，實現(xiàn)對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝以及有害物質(zhì)的降解［2-3］。

自21世紀(jì)初，生物被膜逐步被視為一種潛在的生物材料。這種認知部分來源于生物被膜的軟物質(zhì)特性［4-5］。從軟物質(zhì)物理的角度，生物被膜可被視為一種嵌入了膠體顆粒的交聯(lián)高分子凝膠復(fù)合體：交聯(lián)高分子凝膠復(fù)合體主要對應(yīng)于胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM），而生物被膜中的細菌則充當(dāng)了具有著球形、棒狀等具有明確形狀特性的剛性顆粒［6-7］。胞外基質(zhì)由細菌分泌，主要由多糖及蛋白組成。其中，多糖扮演胞外基質(zhì)的主體：當(dāng)大分子量、負電荷的多糖（105～106g/mol）在足夠高的濃度下時，分子鏈發(fā)生纏結(jié)；同時，多糖鏈間也形成二級結(jié)構(gòu)，例如局部的結(jié)晶域等；同時，負電荷的多糖鏈也可被環(huán)境中的正電荷離子交聯(lián)；蛋白也可作為交聯(lián)劑進一步交聯(lián)多糖大分子。這些纏結(jié)、氫鍵及正負電荷等相互作用構(gòu)成并促成了生物被膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

大部分生物被膜中的細菌缺乏鞭毛或菌毛，且在低于細胞分裂周期的時間段里保持數(shù)量的穩(wěn)定。但是，細菌直接參與了生物被膜性質(zhì)的調(diào)控。例如，其在特殊環(huán)境下可分泌大量的胞外基質(zhì)，進而實現(xiàn)對生物被膜通透性、力學(xué)性能等的調(diào)控，另一方面，細菌又可分泌信號分子、表面活性劑等，使其與其他細菌進行通信等，對生物被膜的性質(zhì)（例如被膜大小、結(jié)構(gòu)異質(zhì)性等）進行進一步調(diào)控。在細菌與胞外基質(zhì)的綜合作用下，生物被膜表現(xiàn)出兼具固體彈性和流體黏滯性的綜合流變性質(zhì)的軟物質(zhì)特性［4，8］（表1）。也就是說，對于外界加載或移除的應(yīng)力，其產(chǎn)生的應(yīng)變具有時間變化過程。其中，有兩個重要的參數(shù)可以作為黏彈性的重要表征值，一個是彈性模量，它對應(yīng)于材料的彈性部分，可以衡量在一定外力下產(chǎn)生的形變；另一個則是松弛時間，反映材料黏性及彈性部分的共同特性，衡量特定形變下物體內(nèi)部應(yīng)力松弛的特征時間。目前使用的大多數(shù)材料都是具有黏彈性的特征，例如橡膠及水凝膠等［24-25］。生物被膜的黏彈性賦予其在材料學(xué)方面潛在應(yīng)用前景，卻又與聚合物材料有著明顯區(qū)別。如前所述，生物被膜的細菌可分泌包括群體感應(yīng)小分子等在內(nèi)的多種物質(zhì)。在細菌、高分子、交聯(lián)劑和小分子等多種物質(zhì)的協(xié)同作用下，生物被膜被賦予了獨特的動態(tài)性以及異質(zhì)性［26-27］。例如，生物被膜的邊緣與中心區(qū)域，表面與底層表現(xiàn)出截然不同的生物組成、含水量以及機械強度。而作為一種活的黏彈性材料，生物被膜的流變性能也受到活體微生物的調(diào)控。例如Shaw等［21］研究了44種不同的生物被膜。盡管不同生物被膜的剪切模量和黏度差別很大，但卻具有相似的彈性松弛時間（約18 min）。這一松弛時間被認為與生物被膜生長過程中細菌的倍增時間相關(guān)。從軟物質(zhì)特性來說，松弛時間越慢越有利于維持生物被膜整體的穩(wěn)定性，然而從生物生長及進化的意義（例如抵御突然的環(huán)境變化）來說，這一時間又要快于細胞分裂時間，而這18 min的彈性松弛時間恰巧是兩者間的平衡。由此，即使具有良好的軟物質(zhì)特性，但由于生物被膜成分復(fù)雜、各向異質(zhì)以及難于調(diào)控等問題，使其難以成為理想的工程化材料。

表1 不同生物被膜在室溫條件下的彈性模量、黏度Tab.1 Viscoelasticity of different biological and synthetic materials at room temperature

2 curli形成的機制與調(diào)控

在生物被膜的繁雜組分中，curli是一種具代表性的淀粉樣蛋白纖維［28］。關(guān)于諸多腸桿菌科生物被膜curli形成機制及調(diào)控研究，從20世紀(jì)末起始至21世紀(jì)初已呈現(xiàn)出清晰的脈絡(luò)。一方面，curli的分泌和組裝是生物被膜表面黏附和細菌集聚等過程的重要步驟［29］，因此，分析生物被膜curli的分泌與組裝機制是解碼細菌被膜致病性的關(guān)鍵；另一方面，curli在結(jié)構(gòu)及生物化學(xué)的層面上被歸類于淀粉樣蛋白纖維。因此，針對其組裝機制的研究對如阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病，具有重大的借鑒價值［30-31］。當(dāng)然，10年后，這些研究成果在與合成生物學(xué)技術(shù)結(jié)合后，也在工程化生物被膜的系列研究中大放異彩。

在curli的生產(chǎn)與組裝中，至少7個蛋白參與這一過程（圖1），這7個蛋白分布在2個反相轉(zhuǎn)錄的操縱子上［35］。在大腸桿菌中，它們分別是csgBAC及csgDEFG［36］。而在沙門氏菌中也發(fā)現(xiàn)了同源的基因（agfBA及agfDEFG，沙門氏菌中的淀粉樣蛋白被稱為Tafi，一些文獻也統(tǒng)一稱其為curli）［26］。csgBAC操縱子表達形成curli的主要單體CsgA和成核蛋白CsgB［37］，以及可以抑制CsgA在胞內(nèi)提前形成淀粉樣蛋白的CsgC［30］。CsgA及CsgB蛋白具有相似的分子量并存在著30%的序列同源性［30］。在CsgB無表達時，被分泌到胞外的CsgA無法進行組裝［38］。有趣的是，在大腸桿菌中，CsgA和CsgB不需要由同一個細胞表達，缺乏CsgB表達細菌可分泌CsgA（供體），而CsgA可在只表達CsgB的細菌（受體）表面組裝curli，供體細菌與受體細菌的距離在厘米尺度依然有效［37，39］。

圖1 curli形成的分子機制［Sec通路可將尚未折疊的CsgA轉(zhuǎn)運到細胞周質(zhì)，同樣也可轉(zhuǎn)運CsgB-C和CsgE-F跨越細菌內(nèi)膜（a）［31］。當(dāng)CsgA被封閉在CsgG-CsgE腔中時，由于墑增效應(yīng)使得CsgA由密閉籠子擴散至外膜（b）［32］。CsgB可引發(fā)外膜表面CsgA單體成核和聚合形成curli系統(tǒng)（c）［33］。組成curli系統(tǒng)的成熟CsgA單體是典型的β折疊結(jié)構(gòu)（d）［34］］Fig.1 The molecular mechanism for curli formation[An unfolded CsgA monomer enters the periplasm via the Sec translocon,and CsgB-C and CsgE-F are transported cross the inner membrane(a);A subunit CsgA encapsulated by a chamber of the CsgG:CsgE complex is secreted over outer membrane,which is driven by entropy increase(b);CsgB nucleated polymerization of a soluble subunit CsgA can assemble into a curli system(c);As the major subunit of the curli fiber,the mature CsgA protein is with a β-sheet-turn-β-sheet conformation(d)]

csgDEFG操縱子上的4個基因，同樣在curli形成機制中起到關(guān)鍵作用［40］。CsgD參與CsgA及CsgB的 表達 調(diào) 控［41-42］；CsgE［32］、CsgF［43］以 及CsgG［43-46］是分泌通道復(fù)合物的組成成分，負責(zé)特異性識別和分泌CsgA與CsgB。其中CsgG是一種外膜磷脂蛋白，其作用是保證CsgA和CsgB的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及協(xié)助其跨膜分泌［47］，純化的CsgG可自組裝成與其他通道蛋白類似的外膜環(huán)狀的寡聚體［44］。CsgE與CsgF都是 細胞 周質(zhì) 蛋白，且 與CsgG蛋白形成復(fù)合體［44］。2020年，科研人員通過冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)的方法解析了復(fù)合物CsgFG以及底物結(jié)合的通道復(fù)合物CsgFGCsgAN22的高分辨率結(jié)構(gòu)。實驗分析顯示CsgF與CsgG形成9∶9結(jié)合的雙孔道復(fù)合物，CsgF的N端插入CsgG的β桶內(nèi)部，并與CsgG相互作用。體外蛋白結(jié)合實驗驗證了兩者相互作用，CsgF的C端與CsgB相互作用。進一步的體外蛋白結(jié)合實驗顯示CsgB結(jié)合CsgA，CsgF不結(jié)合CsgA。綜合電鏡結(jié)構(gòu)和體外蛋白結(jié)合實驗結(jié)果，課題組提出了CsgG-CsgF（N端）-CsgF（C端）-CsgB-CsgA的組裝方式，闡明curli纖維與細菌表面的結(jié)合機制［48］。這一系列對curli形成分子機制的解析工作，不僅對調(diào)控微生物黏附、研究淀粉樣蛋白聚集起到積極作用，更對未來的合成生物學(xué)工程化curli系統(tǒng)，提供生物模塊以及系統(tǒng)調(diào)試提供了知識儲備。

3 curli為代表的工程化生物被膜：合成生物學(xué)技術(shù)參與的活體材料

2000年，Gardner等［49］構(gòu)建的基因撥動開關(guān)，以及同期在Nature發(fā)表的Elowitz和Leibler［50］設(shè)計的振蕩器：利用3個基因模塊彼此間的抑制和解抑制作用，實現(xiàn)規(guī)律振蕩信號輸出的工作正式宣告合成生物學(xué)這一學(xué)科的誕生。通過在細胞中植入合成基因線路并給予外界信號輸入，工程細胞可以識別、處理和整合輸入的信號，并給予信號輸出從而實現(xiàn)特定的生物功能［51-53］。之后的15年里，合成生物學(xué)快速發(fā)展，積累了包括細胞編輯和底盤細胞改造等方法與手段，產(chǎn)生了大量的元器件、基因線路以及特定性能的工程細胞［54-59］。時間撥到2014年，Lu實驗室［60］通過敲除大腸桿菌自身的csgA基因，引入可控誘導(dǎo)表達的csgA線路，首次實現(xiàn)了大腸桿菌表面蛋白纖維curli的可控組裝。該工作進一步編輯csgA基因，將其融合親和多肽（His-tag）。組裝后的curli外展示出親和多肽，使纖維與納米金顆粒特異性結(jié)合，賦予了工程化大腸桿菌導(dǎo)電性。值得一提的是，作者構(gòu)建了aTc-CsgA-His和AHL-CsgA的正交誘導(dǎo)體系工程菌群，并利用前文提到curli的特性——即供體細菌可以分泌CsgA，而這些CsgA在表達CsgB的受體細菌（非同一菌株）表面組裝curli。在菌群共培養(yǎng)的過程中，通過改變兩種菌初始濃度的比例以及誘導(dǎo)物的濃度，使得CsgA-His或者CsgA單體在具有CsgB的表面組裝嵌段共聚物，巧妙地把curli生物學(xué)特性與合成生物學(xué)工具結(jié)合，展現(xiàn)了活體功能材料可編程的特性。

這篇文章的發(fā)表正式拉開了合成生物學(xué)活體功能材料領(lǐng)域的序幕，并迅速涌現(xiàn)了一大批圍繞著工程化curli體系組裝活體材料或生物材料的佳作。這些工作可以分為以下3個方面：①與CsgA融合各種蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)對curli的功能修飾；②利用大腸桿菌生產(chǎn)curli并剝離curli作為生物材料；③構(gòu)建操縱系統(tǒng)實現(xiàn)對curli組裝的多層級調(diào)控。下文將具體介紹這幾個方面的代表性工作。

3.1 curli的功能修飾

通過將蛋白功能域與CsgA融合表達，讓功能域隨CsgA組裝與分泌，完成對curli功能化，是實現(xiàn)curli系統(tǒng)修飾的主流方法（表2）。2014年，Lu課題組［35］進一步將貽貝足蛋白（mussel foot proteins，Mfps）與CsgA進行融合，組裝兼具水下黏合性的高強度活體功能材料。同年，Joshi課題組［68］將含有6～59個氨基酸的多個功能域分別與CsgA構(gòu)成融合蛋白，對curli系統(tǒng)的外展示能力進行測試［圖2（a）］。這些功能域包括親和標(biāo)簽（His、FLAG）、蛋白展示標(biāo)簽（SpyTag）、底物親和標(biāo)簽［MBD（結(jié)合不銹鋼表面）、GBP（結(jié)合石墨烯表面）等］。結(jié)果顯示：curli系統(tǒng)可成功展示含有59個氨基酸的蛋白功能域，并產(chǎn)生與功能域相關(guān)的特定功能，如針對金屬表面的貼合curli材料。2018年，Joshi課題組［69］將CsgA融合鑭系元素結(jié)合標(biāo)簽（LBT），構(gòu)建出curli-LBT回收過濾裝置，實現(xiàn)對鑭系元素特異性吸附，完成稀土元素高效回收。將活體材料引入到稀有金屬生產(chǎn)回收領(lǐng)域，發(fā)展出具備高速、高特異性和可擴展的回收貴金屬方法。同年底，該課題組［77］通過將可治療炎癥性腸病（inflammatory bowel disease）的三葉肽（trefoil factors，TFFs）與csgA基因融合表達，使大腸桿菌益生菌Nissle 1917表面融合表達TFFs的curli［圖2（b）］。試驗結(jié)果表明，將工程益生菌灌胃給老鼠后，工程益生菌形成的治療性材料會貼附在腸道的黏膜上，有效抑制由葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的腸炎［77］。在這一系列工作中，通過替換蛋白功能域，將具有親和特性、黏合特性以及治療特性的短肽與CsgA單體進行融合表達，便可組裝具有特定功能的curli材料，充分體現(xiàn)活體材料的可編程性。

表2 CsgA融合結(jié)構(gòu)域單元實現(xiàn)curli功能修飾Tab.2 Domains-fused CsgA functionalizes curli

然而，受制于curli系統(tǒng)分泌的局限性，大尺寸標(biāo)簽蛋白或功能域會影響蛋白單體的分泌與組裝。對此，研究人員進行多種嘗試，通過curli系統(tǒng)展示蛋白短肽，再利用非共價或共價作用將外源大蛋白與curli進行連接，最終豐富了curli功能，并突破curli系統(tǒng)的分泌尺寸限制。例如，鐘超課題組［80］將SpyTag融合到curli系統(tǒng)，同時將海藻糖合成酶編輯到胞內(nèi)。首先將外源表達SpyCatcher-β-淀粉酶，利用SpyTag-SpyCatcher共價作用的特性，將β-淀粉酶修飾到curli表面，并進一步將大腸桿菌無法利用的淀粉降解成可利用的麥芽糖，最后利用胞內(nèi)表達的海藻糖合成酶實現(xiàn)海藻糖合成［圖2（c）］。該工作巧妙地通過SpyTag-SpyCatcher系統(tǒng)將大分子量蛋白裝飾在curli系統(tǒng)，并通過胞外胞內(nèi)的協(xié)同作用，使大腸桿菌利用淀粉實現(xiàn)了生物制造。

圖2 與CsgA融合表達實現(xiàn)功能化curli系統(tǒng)（a）將可誘導(dǎo)CsgA-功能肽的蛋白基因線路導(dǎo)入csgA基因缺失型的宿主，可在細菌外膜自組裝形成展示多種功能肽段的工程化curli［68］；（b）通過將trefoil factors（TFFs）與CsgA進行融合，可以組裝表面展示TFFs的curli，這種改造后的益生菌可直接用來治療腸炎［77］；（c）表面展示SpyTag的curli系統(tǒng)與標(biāo)記SpyCatcher的淀粉水解酶結(jié)合，將胞外淀粉降解成麥芽糖，運輸?shù)桨麅?nèi)后由胞內(nèi)的海藻糖合酶催化，實現(xiàn)淀粉的高效生物轉(zhuǎn)化及海藻糖的合成［80］Fig.2 Functionalization of curli via fusion with CsgA(a)Gene circuit containing inducible expression of CsgA(with subunits engineered to display various peptide tags)was transformed into a host strain with the endogenous csgA gene deleted;(b)Fusing CsgA with trefoil factors(TFFs)led to the formation of curli nanofibers displaying TTFs.The resultant material was proven to promote intestinal barrier function and epithelial restitution;(c)SpyTag displaying curli was fused with SpyCatcher decorated β-amylase.β-amylase converted the starch into maltose.The maltose was then transported intracellularly and further catalyzed into trehalose through the intracellularly expressed trehalase

3.2 利用大腸桿菌生產(chǎn)curli并剝離curli作為生物材料

以大腸桿菌作為細胞工廠，將curli或CsgA蛋白直接剝離或純化作為材料前體，是另一種生產(chǎn)工程化生物被膜材料的思路。2017年Joshi課題組［81］使用真空過濾的方法，首次實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)curli。由于curli具備對熱、洗滌劑、溶劑和變性劑的耐受性，因此在整個加工過程中，curli依舊維持良好的功能。作者以大腸桿菌為底盤細胞，創(chuàng)新地利用真空過濾的方法，最終達到curli材料宏觀化和規(guī)?；a(chǎn)的目的［圖3（a）］。在2021年，該課題組［82］同樣利用該體系組裝Aqualgel材料，使其可以進行二維以及三維塑型，不僅能夠耐受酸堿和有機溶劑的侵蝕，而且具有良好的生物降解性。與此同時，還兼具生物活性材料的水下自愈合能力［圖3（c）］。

2019年，鐘超課題組［83］利用剝離curli以及體內(nèi)誘導(dǎo)胞內(nèi)表達CsgA的兩種方式，通過后處理分離出活性CsgA單體，完成在體外的材料組裝。課題組利用CsgA單體作為生物墨水，并使用體外溶劑進行后處理，最終打印出穩(wěn)定蛛絲狀的結(jié)構(gòu)［圖3（b）］。CsgA-功能域構(gòu)成的纖維結(jié)構(gòu)可操控性強于胞外curli系統(tǒng)。例如將蛋白多肽修飾的CsgA進行定制化的空間排布，并與量子點或熒光蛋白偶聯(lián)即可形成熒光點陣［83］，這種陣列的制造技術(shù)在生物芯片、高通量生物傳感器等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力［84］。2020年，鐘超課題組［64］進一步利用CsgA蛋白作為涂層材料，并探索其在導(dǎo)電器件和酶固定等方面的應(yīng)用。

圖3 利用大腸桿菌生產(chǎn)curli并剝離curli作為生物材料（a）利用大腸桿菌生產(chǎn)curli，隨后通過過濾的方法實現(xiàn)體外剝離，再通過溶解以及重復(fù)的形式可以進行材料的進一步加工處理［81］；（b）將大腸桿菌體表面的curli以及體內(nèi)表達的CsgA蛋白單體混合物，通過溶解與固化可將其塑型為多種圖案［83］；（c）通過剝離curli并進一步加工成為水塑材料，其不但可以耐受多種有機溶劑及強酸強堿，還可以接合成多種三維形狀［82］Fig.3 Purified curli as the materials precursors(a)Curli fiber produced by E.coli were purified using a fast and easily accessible vacuum filtration procedure.The fibers were then disassembled,reassembled into thin films,and recycled for further materials processing[81];(b)Generation of diverse patterns with a generic amyloid monomer inks(consisting of genetically engineered biofilm proteins dissolved in hexafluoroisopropanol),along with methanol-assisted curing[83];(c)Aqua plastic was produced by casting and drying purified curli under ambient conditions[82].The resultant aqua plastic could withstand strong acid/base and organic solvents.In addition,aqua plastic could be healed and welded to form three-dimensional architectures using water

3.3 構(gòu)建操縱系統(tǒng)實現(xiàn)對curli組裝的多層級調(diào)控

以csgA作為報告基因，將其偶聯(lián)到其他基因線路，如圖案構(gòu)成、光操縱系統(tǒng)里，催生了更多有趣的工作。2017年游凌沖實驗室［85］通過基因線路編輯細菌自組裝形成核殼結(jié)構(gòu)，并在基因線路下游引入csgA-His基因［63］，使得大腸桿菌菌落形成半球狀結(jié)構(gòu)時，蛋白纖維curli大量分布在半球的殼表面。通過Anti-His抗體與標(biāo)記納米金的二抗結(jié)合，形成有機-無機雜化核殼結(jié)構(gòu)。這種核殼結(jié)構(gòu)可以靈敏地感應(yīng)微小壓力，使三維自組裝材料實現(xiàn)壓力傳感器的功能。此工作巧妙地利用基因線路編輯細菌，使其自發(fā)地形成（selforganization）功能器件基礎(chǔ)的三維結(jié)構(gòu)，在利用基因線路編輯細菌，實現(xiàn)自組裝形成活體功能材料方面的突破。

2017年Voigt實驗室［86］設(shè)計了由18個基因組成的基因回路：其中3個是編碼光敏蛋白的基因，可分別感應(yīng)紅（波長705 nm）、綠（波長535 nm）、藍（波長470 nm）3種波長的光（RGB系統(tǒng)）。不同波長光可以啟動細菌合成不同色素。在此基礎(chǔ)上，2019年，該課題組［61］將光響應(yīng)的下游基因替換成3種不同修飾的csgA，從而利用不同波長光，誘導(dǎo)多功能特性的curli表達。通過調(diào)節(jié)不同波長的光組合，實現(xiàn)多功能curli的逐層可控組裝。該工作成功利用光控手段實現(xiàn)活體功能材料構(gòu)建，充分體現(xiàn)活體功能材料針對多環(huán)境因素的響應(yīng)能力。

4 總結(jié)與展望

在細菌與胞外基質(zhì)的綜合作用下，生物被膜表現(xiàn)出具有黏彈性的軟物質(zhì)特性，具備了類似于水凝膠的材料特性，也成為其可被加工成為材料的基礎(chǔ)。然而，生物被膜的組分復(fù)雜性以及各向異質(zhì)性，又與傳統(tǒng)材料具有顯著區(qū)別。在缺乏生物學(xué)改造的工具時，天然的生物被膜難以被打磨、調(diào)整以及根據(jù)應(yīng)用進行定制化設(shè)計。當(dāng)以傳統(tǒng)的生物被膜作為材料這條道路似乎困難重重的時候，工程化生物被膜的思路一舉破解了其中諸多困擾。而這一步的核心是從生物被膜的諸多組分中剝離出curli這一核心成分，進行工程細菌的編輯和改造。這一選擇與一直以來積累的有關(guān)curli調(diào)控的生物學(xué)機制研究密不可分。curli作為模塊化工具被成功驗證，成為工程生物被膜的有效載體，并與合成生物學(xué)的功能模塊、調(diào)控元件、基因線路工具，包括功能肽、光控啟動子庫、圖案編輯線路構(gòu)建等融合，這些組合賦予curli系統(tǒng)多樣化的功能。將工程生物被膜引入黏合材料、生物醫(yī)藥以及電子器件領(lǐng)域，帶動活體功能材料領(lǐng)域的快速發(fā)生與發(fā)展，并相繼涌現(xiàn)出各式各樣的活體功能材料佳作?；铙w功能材料領(lǐng)域也進一步拓展到工程化纖維素、工程生物與其他材料（高分子或彈性體）的復(fù)合物乃至人工光合體系［87-89］。生物的可編程性賦予了活體材料多樣化功能，生物分裂生長的特性也賦予材料自我生長及自修復(fù)的能力，而這些優(yōu)良特性卻為傳統(tǒng)材料所不具備［90-92］。在一系列場景：包括生物制劑的靈活制備、材料的自修復(fù)、活體構(gòu)筑材料的組裝，活體功能材料均可發(fā)揮其獨特優(yōu)勢［93-94］。

而另一方面，隨著活體功能材料這一領(lǐng)域的快速發(fā)展，也面臨越來越多的挑戰(zhàn)。例如，以生物為主體的材料在力學(xué)性能方面具有劣勢，活細胞在貧瘠或干燥環(huán)境中難以存活及生長。針對這些問題，學(xué)界做出了相應(yīng)的探索。例如通過合成高分子與活體生物進行耦合提高活體材料的機械性能和穩(wěn)定性：用高分子網(wǎng)絡(luò)與工程生物進行耦合［95］，或通過形成特定結(jié)構(gòu)（例如互穿聚合物等）提高材料的動態(tài)模量以及抗擾動能力［96］；針對養(yǎng)分匱乏環(huán)境中的活體材料會失去其功能，未來可通過引入光能自養(yǎng)生物構(gòu)建功能菌群實現(xiàn)自養(yǎng)的活體材料組裝；另一方面，通過誘導(dǎo)生物在體內(nèi)表達保濕劑（如海藻糖），可幫助微生物在極度干燥的環(huán)境下生存［97］。

回顧這一系列工作，整個活體功能材料領(lǐng)域的關(guān)鍵步驟是從天然生物被膜中由繁至簡，提取出curli這一核心體系；而在后續(xù)發(fā)展中，由簡至繁，根據(jù)場景及需求融合生物模塊、基因線路以及在多種底盤細胞上組裝活體材料。而這一科研思路也在其他類型的工程生物被膜（枯草芽孢桿菌的TasA系統(tǒng)）以及生物被膜中多糖類組分的編輯發(fā)展中得到類似印證。我們期待過去7年里有關(guān)工程化生物被膜的研究歷程可以帶來更多啟示，在未來的研究中開發(fā)出活體材料組裝的新方法、新系統(tǒng)以及新范式。