蓯歸益腎膠囊對DKD大鼠血管內(nèi)皮損傷的保護作用及VCAM-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響

劉俊峰，孫曉娟，吳 迪，朱夢燕，方朝暉＊

（安徽中醫(yī)藥大學1研究生院，2第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,合肥 230012）

糖尿病（DM）是常見的慢性非傳染性疾病，目前認為是由胰島素功能障礙引起的代謝紊亂綜合征,具有病程長，難治愈的特點,臨床上以T2DM多見,占DM的90%左右［1］。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學認為T2DM屬于“消渴”病，其病變機理主要是陰虛燥熱。病程日久，遷延不愈，陰損及陽，腎陽衰微，加之機體陰虛燥熱，耗液傷津，逐漸發(fā)展為脈絡瘀阻。西醫(yī)則認為，持久的高血糖可導致血管斑塊、動脈粥樣硬化及血管壁點狀鈣化等血管病變。有研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者的死亡約50%是血管并發(fā)癥引起的，作為T2DM常見的血管并發(fā)癥之一的糖尿病腎?。―KD）是由糖尿病引起的腎臟微血管病變[2-3]。糖代謝紊亂與內(nèi)環(huán)境高糖狀態(tài)是DKD發(fā)病的主要病因，細胞凋亡參與了DKD發(fā)生的整個過程。蓯歸益腎膠囊是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院研制的具有溫陽益腎、活血調(diào)脂之功效的中藥復方制劑,前期研究發(fā)現(xiàn)蓯歸益腎膠囊能改善血糖血脂、改善腎功能及胰島素抵抗，減輕機體凋亡反應［4-5］。本研究從氧化應激和細胞凋亡角度闡述蓯歸益腎膠囊對DKD大鼠血管內(nèi)皮損傷、腎組織結構的保護作用及VCAM-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物50只8周齡健康的SPF級雄性Wistar大鼠，體重(220.7±3.5)g，購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK-(皖)2018-002。動物房飼養(yǎng)，保持溫度22~25℃，相對濕度45%~60%，黑暗和光照交替，各12 h。本實驗經(jīng)過安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準[AHUCM(rals)2018009]。

1.2 藥物和儀器蓯歸益腎膠囊組成藥物為(肉蓯蓉15 g、當歸12 g、山茱萸12 g、淫羊藿9 g、澤瀉9 g、丹皮12 g)，安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（安徽省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號20130925）。鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司），鹽酸吡格列酮片（天津武田藥品有限公司），NO、MDA、T-AOC、SOD、GSH-Px試劑盒（南京建成生物工程研究所），ET、VCAM-1、MCP-I、OxLDL、AGEs ELISA試劑盒（武漢博士德生物有限公司），轉(zhuǎn)膜儀（美國Biorad公司），凝膠成像分析儀（美國Biorad公司），透射電子顯微鏡（日本日立公司H-7500）。

1.3 飼料標準飼料以及高糖高脂飼料（0.25%膽酸鈉、1.5%膽固醇、10%豬油、5%蔗糖、普通大鼠飼料83.25%）由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心配制。

1.4 方法

1.4.1 造模 隨機選取健康雄性SPF級Wistar大鼠40只予以高糖高脂飼料喂食，適應性喂養(yǎng)1月后，按大鼠體重，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，注射72 h后尾靜脈取血，并收集大鼠24 h內(nèi)的尿液，檢測各組大鼠空腹血糖及24 h尿蛋白定量，以連續(xù)3次血糖達到并超過16.7 mmol/L，24 h尿蛋白定量>30 mg為建模成功[6]。

1.4.2 分組及給藥方法 將40只建模成功的DKD大鼠分為模型組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組，每組各10只，繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng)；10只正常大鼠作為對照組，予以普通動物飼料喂養(yǎng)。予以蓯歸低劑量組0.54 g·kg-1·d-1和高劑量組大鼠1.08 g·kg-1·d-1蓯歸粉末溶液灌胃，對照組和模型組大鼠則給予等容量的生理鹽水灌胃，吡格列酮組大鼠給予吡格列酮片10 mg·kg-1·d-1灌胃治療，喂養(yǎng)8周。

1.4.3 取材 第8周末，各組大鼠灌胃后禁食12 h，全部予以腹腔注射10%濃度的水合氯醛溶液麻醉，劑量為3 mg/kg。固定后迅速取出腔靜脈血，離心血清，－20℃保存。置于液氮保存大鼠腎臟組織，用以制備檢測細胞間黏附因子-1（VCAM-1）、bcl-2相關的X基因(Bax)、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、半胱天冬酶（Caspase-3）蛋白的表達。浸于4%甲醛溶液中固定大鼠腎臟組織，室溫下保存，以備HE染色法觀察。

1.5 檢測指標

1.5.1 血管內(nèi)皮功能、氧化應激及炎癥等指標檢測 硝酸鹽還原酶法測定血清一氧化氮(NO)含量,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清內(nèi)皮素(ET)、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、血管內(nèi)皮細胞黏附分子－1(VCAM－1)、MCP－1含量,硫代巴比妥酸分光光度法測定丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAOC)水平,黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性,紫外分光光度法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)活性。

1.5.2 腎臟組織蛋白表達的檢測 應用Western-blot法，提取腎臟組織VCAM-1、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白進行檢測，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，一抗并5℃冰箱內(nèi)過夜，二抗孵育1h后顯色曝光，圖像分析。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 23.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，滿足正態(tài)分布與方差齊性采用獨立樣本t檢驗，多重比較采用單因素LDS檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，不滿足正態(tài)分布則應用非參數(shù)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血管內(nèi)皮功能變化與模型組比較，對照組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組血清NO均升高（P＜0.05）、ET均降低（P＜0.05）;與對照組比較，模型組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組NO、ET差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與蓯歸高劑量組比較，模型組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組NO、ET差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清NO、ET水平比較/（±s ）

表1 各組大鼠血清NO、ET水平比較/（±s ）

注：與模型組比較，*P＜0.05;與蓯歸高劑量組比較，#P＜0.05；與對照組比較，▲P＜0.05。

分組對照組模型組吡格列酮組蓯歸低劑量組蓯歸高劑量組F P n 10 10 10 10 10 NO/（μmol/L）82.1±10.31*28.25±11.11#▲52.94±12.04*#▲45.52±9.60*#▲63.10±10.90*▲31.36＜0.01 ET/(ng/L）104.78±20.51*220.77±20.86#▲145.85±22.93*#▲148.23±20.77*#▲115.57±16.90*▲42.30＜0.01

2.2 各組大鼠腎臟組織病理的形態(tài)學改變對照組腎組織結構正常，基底膜無增生、纖維化，毛細血管腔清晰。模型組腎基底膜增厚，腎小管上皮細胞腫脹甚至壞死。細胞質(zhì)內(nèi)可見紅色顆粒、空泡改變、輕度間質(zhì)纖維化和炎性細胞浸潤。與模型組比較，蓯歸低、高劑量組大鼠腎小管上皮細胞變性、模糊、腫脹，毛細血管輕度狹窄，但炎性細胞浸潤明顯減少。見圖1。

圖1 光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織病理改變(×200)

2.3各組大鼠血清氧化應激指標變化與模型組大鼠比較，對照組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組MDA、oxLDL、AGEs水平降低（P＜0.05），T-AOC、SOD、CSH-Px水平升高（P＜0.05）；與對照組比較，模型組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組MDA、oxLDL、AGEs、T-AOC、SOD、CSH-Px差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與蓯歸高劑量組比較，吡格列酮組、蓯歸低劑量組、模型組MDA、oxLDL、AGEs、TAOC、SOD、CSH-Px差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠氧化應激指標水平比較/（±s ）

表2 各組大鼠氧化應激指標水平比較/（±s ）

注：與模型組比較，*P＜0.01;與蓯歸高劑量組比較，#P＜0.05;與對照組比較，▲P＜0.05。

分組對照組模型組吡格列酮組蓯歸低劑量組蓯歸高劑量組F P n 10 10 10 10 10 MDA/(mmol/L)13.16±4.98*33.07±9.02#▲22.47±8.05*#▲22.82±9.02*#▲15.51±5.11*▲9.81＜0.01 T-AOC/(mmol/L)2.28±0.31*0.70±0.24#▲1.40±0.30*#▲1.36±0.26*#▲1.81±0.23*▲42.55＜0.01 SOD/(U/mL)362.74±58.70*119.60±22.64#▲246.23±40.58*#▲264.05±26.24*#▲343.78±23.07*▲58.18＜0.01 CSH-Px/(U/mL)2602.85±325.60*1211.05±240.33#▲1892.16±224.82*#▲2095.28±236.86*#▲2348.46±194.89*▲37.44＜0.01 oxLDL/(ng/L)16.93±3.71*39.35±4.23#▲31.61±3.64*#▲33.77±3.25*#▲24.48±5.53*▲40.93＜0.01 AGEs/(ng/L)2.22±0.39*4.82±0.27#▲3.80±0.22*#▲3.85±0.28*#▲3.07±0.30*▲96.51＜0.01

2.4 各組大鼠血清VCAM-1、MCP-1變化與模型組比較，對照組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組血清VCAM-1、MCP-1均顯著降低（P＜0.05）；與對照組比較，模型組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組VCAM-1、MCP-1差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與蓯歸高劑量組比較，對照組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、模型組血清VCAM-1、MCP-1差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清VCAM-1、MCP-1水平比較/（ng/L，±s ）

表3 各組大鼠血清VCAM-1、MCP-1水平比較/（ng/L，±s ）

注：與模型組比較，*P＜0.05;與蓯歸高劑量組比較，#P＜0.05;與對照組比較，▲P＜0.05。。

分組對照組模型組吡格列酮組蓯歸低劑量組蓯歸高劑量組F P n 10 10 10 10 10 VCAM-1 53.32±6.08*#85.38±4.14#▲73.43±4.27*#▲69.70±2.91*#▲65.14±6.21*▲51.20＜0.01 MCP-1 43.12±4.76*#68.38±5.50#▲58.75±4.03*#▲57.87±2.02*#▲53.55±5.04*▲39.72＜0.01

2.5 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達情況與模型組比較，對照組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，模型組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與蓯歸高劑量組比較，對照組、模型組、吡格列酮組、蓯歸低劑量組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達情況比較

圖2 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達

3 討論

DKD是糖尿病常見的并發(fā)癥，其本質(zhì)是一種糖尿病微血管病變，DKD患者往往伴有血清cys-c、ACR及血脂TC、TG、LDL-C等指標異常，大約40%的DKD患者在漫長的糖尿病病程中可能發(fā)展成為腎衰竭[7]。蓯歸益腎膠囊選用當歸、肉蓯蓉、山茱萸、桂枝、牡丹皮和澤瀉，是根據(jù)中醫(yī)基礎理論及現(xiàn)代藥理學理論研制出來的成果。此方中以當歸、肉蓯蓉共同為君藥，其意在肉蓯蓉可以補腎溫陽、助氣行血，當歸補血活血。桂枝、山茱萸為臣藥，意在桂枝溫通補腎陽，助氣行血化瘀，山茱萸性溫，具有補肝益腎的功效，同時又可助當歸、肉蓯蓉益氣活血升陽。丹皮、澤瀉為方中佐藥，意在二者皆性寒涼，可制約君藥及臣藥的溫熱之性。

DKD患者最終多死于大血管病變。NO和ET是反映血管內(nèi)皮功能的重要指標，ET是一種強烈的縮血管肽，可促進細胞外基質(zhì)合成及細胞增殖，參與機體因缺血、缺氧等導致的血管內(nèi)皮細胞損傷過程，NO有舒張血管的作用，NO和ET是血管內(nèi)皮損傷的重要標志物，一般情況下兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦二者之間失去平衡，必然會導致血管內(nèi)皮損傷[8-9]。本研究顯示，與模型組比較，蓯歸低劑量組、蓯歸高劑量組血清NO均升高、ET均降低。提示蓯歸益腎膠囊能夠減輕血管內(nèi)皮損傷。

氧化應激是內(nèi)皮細胞損傷的重要機制，也是DM的重要致病因素［10］。氧化應激的發(fā)生與多種因素有關，高糖、高脂、低氧、oxLDL因子等直接或間接的作用于內(nèi)皮細胞，導致SOD活性下降，抗氧化能力損傷，過氧化物生成增多[11-12]］。本研究發(fā)現(xiàn)，蓯歸高劑量組大鼠腎臟組織相較于模型組大鼠，腎臟損傷程度較輕，腎臟炎癥因子表達也明顯降低。提示，蓯歸益腎膠囊可以加強DKD大鼠體內(nèi)的抗氧化能力，調(diào)節(jié)DKD大鼠體內(nèi)氧化應激反應，達到保護DKD早期大血管內(nèi)皮損傷、減輕高血糖帶來的腎臟損傷。

已有研究表明，DKD的發(fā)生發(fā)展及修復過程都伴隨著細胞凋亡[13]。凋亡是是受基因調(diào)控的一種細胞死亡。DKD早期，機體通過細胞凋亡清除多余增生細胞，對糖尿病腎臟有修復的作用；后期隨細胞凋亡數(shù)增多，機體無法清除更多的增生細胞時會造成腎臟損傷。Bax是拮抗Bcl-2的促凋亡因子，Bax的上調(diào)會加速細胞死亡，Bcl-2上調(diào)有助于細胞存活[14]。Caspase-3高糖情況下被激活，Caspase-3最后執(zhí)行凋亡，起著十分關鍵的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，蓯歸高、低劑量組DKD大鼠Bax和caspase-3表達降低，Bcl-2表達升高。提示，蓯歸益腎膠囊可通過抑制DKD大鼠腎臟組織細胞凋亡，下調(diào)促凋亡的Bax、Caspase-3蛋白水平，上調(diào)抑制凋亡的Bcl-2蛋白水平，減少了腎臟細胞凋亡，減輕腎臟損傷，達到保護腎臟的效果。

綜上，蓯歸益腎膠囊對DKD血管內(nèi)皮損傷具有保護作用，其作用機制可能與抑制VCAM-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達有關。本研究因研究時間及場地設施的限制，研究的動物模型數(shù)量較少，且沒有開展相關臨床試驗，沒有深入研究電鏡下DKD大鼠模型的腎臟組織細胞病理超微結構的改變；此外，未對蓯歸益腎膠囊的藥物的各有效成分進一步分析，這些不足有望后期研究進一步完善。