兩種巨噬細(xì)胞外泌體制備方法的對比研究

楊 毅，劉文濤，馮興超，王新月，廖禮彬＊

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，烏魯木齊 830054；新疆醫(yī)科大學(xué) 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830017）

外泌體（exosomes，EXOs）是活細(xì)胞分泌的30～150 nm的囊泡，它們廣泛存在于唾液、血液、尿液中，被視為特異性分泌的膜泡，其內(nèi)部包括DNA、RNA、脂質(zhì)、代謝產(chǎn)物等，參與細(xì)胞間通訊[1-3]。近年來，外泌體相關(guān)研究主要集中在間充質(zhì)干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及臨床診斷性研究。巨噬細(xì)胞作為抗原呈遞家族細(xì)胞之一，其在腫瘤和炎癥等的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的調(diào)控通路呈網(wǎng)絡(luò)狀調(diào)控，巨噬細(xì)胞的外泌體在此過程中具有重要意義[4]。目前外泌體的提取方法主要有超速離心法[5]、密度梯度離心法[6]、超濾法[7]等，但這些方法是否適合巨噬細(xì)胞外泌體的提取有待進(jìn)一步研究，巨噬細(xì)胞外泌體提取的純度及濃度決定了相關(guān)實驗研究的深入性以及精確性。本研究主要以聚合物沉淀法和超速離心法提取的巨噬細(xì)胞外泌體進(jìn)行對比，探索適用于巨噬細(xì)胞外泌體的制備方法，為后續(xù)外泌體的進(jìn)一步研究提供方法和參考，提高相關(guān)實驗的精確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 材料與試劑RAW264.7專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽）；試劑包括外泌體提取試劑盒（華盈生物）、Phosphate Buffered Saline（HyClone）、蛋 白 定 量 試 劑 盒（Thermo）等。

1.1.3 耗材設(shè)備 冷凍離心機(jī)（4K15 SIGMA）；4℃冰箱；恒溫培養(yǎng)箱；透射電子顯微鏡（JEM-1230日本電子）；超速離心機(jī)（Optima XPN）；EP管（Biofil）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞用專用培養(yǎng)基于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d按照1∶3比例傳代1次，待其在T25培養(yǎng)皿中融合度達(dá)到90%以上，數(shù)量約105～106個，收集細(xì)胞上清液。

1.2.2 Western blot向200μL的外泌體樣本中加入200μL冷的蛋白提取液，吹打混勻，4℃震蕩30 min，結(jié)束后4℃12 000 g離心15 min，上清即為外泌體總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗CD63、TSG101、Alix，4℃孵育過夜，洗膜后，加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.3 聚合物沉淀法 收集細(xì)胞上清液，4℃3 000 g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清于新的離心管中，將離心后的細(xì)胞上清與外泌體提取試劑按2∶1的比例混合，翻轉(zhuǎn)混勻50次，4℃冰箱靜置過夜約14 h，將上述混合液，4℃3 500 g離心50 min，離心后棄上清，用1 mL的PBS重懸，4℃10 000 g離心10 min，棄上清，再用200μL的PBS重懸，4℃10 000 g離心10 min，取上清。

1.2.4 超速離心法 收集細(xì)胞上清液，4℃300 g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清于新的離心管中，4℃2 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清于新的離心管中，4℃10 000 g離心30 min，用0.22μm濾器過濾上清于新的離心管中，4℃100 000 g離心120 min，用200μL的PBS重懸沉淀。

1.2.5 樣品制備及觀察 提取的外泌體中取10μL滴加到碳覆膜銅網(wǎng)上，滴加時呈水滴樣，樣品吸附3 min，用濾紙吸去多余液體后晾干，向銅網(wǎng)上滴加磷鎢酸染色液10μL，避光染色2 min，用濾紙吸去多余液體，晾干后透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 電鏡下外泌體形態(tài)學(xué)結(jié)果（A：50 000×B：50 000×C：100 000×D：100 000×）

2.1 外泌體形態(tài)學(xué)觀察依據(jù)聚合物沉淀法提取的外泌體，濃度較高（圖1 A），超速離心法提取的外泌體濃度較低（圖1 B），透射電鏡下觀察到，銅網(wǎng)上的外泌體膜結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，直徑在150 nm左右，能清晰地觀察到圓盤狀的結(jié)構(gòu)（圖1 C、1 D）。

2.2 外泌體標(biāo)志蛋白檢測外泌體Western blot結(jié)果驗證了2種方法均提取到了EXOs(圖2)，標(biāo)志蛋白Alix、TSG101以及CD63表達(dá)均無差異均有表達(dá)。

2.3 兩種外泌體提取方法的比較與超速離心法相比，聚合物沉淀法提取的外泌體直徑更大，結(jié)構(gòu)完整程度更高，外泌體濃度更高，提取時間更短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。設(shè)備成本方面，超速離心法對儀器設(shè)備平臺要求高，聚合物沉淀法更具經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢（表1）。

圖2 外泌體標(biāo)志蛋白CD63、TSG101、Alix的表達(dá)（U-EXOs：超速離心法外泌體；P-EXOs：聚合物沉淀法外泌體）

表1 聚合物沉淀法與超速離心法提取外泌體比較

3 討論

多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，其主要來源于細(xì)胞內(nèi)內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中[8]，1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，1987年Johnstone將其命名為“exosome”[9]。隨著大量對其生物來源、其物質(zhì)構(gòu)成及運輸、細(xì)胞間信號的傳導(dǎo)以及在體液中分布的研究發(fā)現(xiàn)外泌體具有多種多樣的功能。外泌體的功能取決于其所來源的細(xì)胞類型，其可參與到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等[10]。大量臨床研究證實，外泌體在腫瘤、血管、免疫、內(nèi)分泌及疾病診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。然而，外泌體的提取和純化是外泌體研究的前提，而外泌體提取技術(shù)的可靠性及穩(wěn)定性是外泌體實驗研究精確性的重要前提。由于細(xì)胞外基質(zhì)中外泌體的體積小，數(shù)量少，因此，外泌體的提取和純化是目前實驗研究面臨的巨大挑戰(zhàn)，而有關(guān)成體細(xì)胞外泌體的研究甚少，本研究在對巨噬細(xì)胞外泌體的實驗研究中，將常用外泌體提取方法中超速離心法和聚合物沉淀法對外泌體的提取進(jìn)行對比，進(jìn)一步為外泌體的實驗研究提供方法和參考。通過實驗研究，兩種外泌體的提取方法均提取出較為完整的盤狀外泌體納米囊泡，直徑在94.5～129.9 nm，符合文獻(xiàn)報道的30～150 nm之間。通過透射電鏡對提取外泌體的形態(tài)及大小分布狀況檢測，聚合物沉淀法提取的外泌體，在溶液中分散性較好，與超速離心法提取的外泌體相比，鏡下觀察雜質(zhì)較少，并且相同倍鏡下所觀察到的外泌體數(shù)量更多，完整性更好。Weng等[11]通過基于聚合物沉淀法成功地從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離出外泌體，并揭示了基本機(jī)制。他們用高分辨率電子顯微鏡清楚地觀察了外泌體的大小和形狀，該分離方法具有成本低、簡單、高效的特點。在設(shè)備要求上，超速離心法較聚合物沉淀法對設(shè)備、實驗平臺的要求更高，經(jīng)濟(jì)成本高。每一種提取和分離的方法都有各自的優(yōu)缺點，雖然超速離心法作為目前最常用的外泌體提取方法，其一次能提取大量樣本且成本較低，但該方法存在處理時間長、設(shè)備昂貴、回收率低、純度低等缺點[12]。

綜上，本研究僅從實驗過程中對比了針對巨噬細(xì)胞來源的兩種外泌體提取和純化的方法，該研究存在未對提取的外泌體進(jìn)行純度及濃度的進(jìn)一步驗證。后續(xù)，本研究組將結(jié)合最新的分析技術(shù)如納米示蹤技術(shù)、核酸信息依賴性鑒定等對外泌體的提取方法、質(zhì)和量進(jìn)行更深入的研究。