高效液相色譜法檢測(cè)糖漿劑藥品中愛德萬甜不確定度評(píng)定

雷德卿 鐘菲菲 周金沙 劉 波 王子倩 周亞敏

(長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

人工合成甜味劑是一類應(yīng)用較廣泛的食品添加劑[1]，過量攝入可能損害身體健康[2-3]，尤其是肝腎發(fā)育不成熟的兒童，造成的損傷可能不可逆[4]。相對(duì)來源于天然產(chǎn)物的藥用級(jí)蔗糖，作為食品添加劑的人工合成甜味劑價(jià)格低廉，個(gè)別企業(yè)為了非法牟利，將食品甜味劑添加到藥品中減少藥用蔗糖量，嚴(yán)重?fù)p害患者尤其是兒童身體健康。

常用的食品甜味劑主要有糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜等[1]，檢測(cè)手段比較多，如毛細(xì)管電泳法、離子色譜法、氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等[5-9]。愛德萬甜是近年使用較廣泛的甜味劑新興品種，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局于2022年發(fā)布了食品中愛德萬甜補(bǔ)充檢驗(yàn)方法[10]。食品甜味劑用于食品的研究較多，而用于藥品的研究較少[11-12]，目前尚未見愛德萬甜非法添加到藥品糖漿劑的文獻(xiàn)或補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。研究擬在建立高效液相色譜法的基礎(chǔ)上，依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》等資料[13-16]，試圖對(duì)該法進(jìn)行測(cè)量不確定度分析，探討誤差來源及各分量大小，并提出相應(yīng)建議，以期為減少測(cè)量誤差、提高測(cè)量準(zhǔn)確度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純，美國(guó)默克公司；

其余試劑均為分析純；

超純水：自制；

愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：含量97.0%，美國(guó)Sigma公司；

小兒止咳糖漿樣品：來源于21家生產(chǎn)企業(yè)共45批次，市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters alliance e2695型，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器，美國(guó)沃特斯公司；

電子分析天平：METTLER XS205DU型，瑞士梅特勒—托利多公司；

純化水系統(tǒng)：Millipore Milli-Q Direct 8型，美國(guó)密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備 精密量取樣品5 mL至50 mL量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液10 mL，取續(xù)濾液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)25.21 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，用10 mL刻度吸管精密量取貯備液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL分別置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，每1 mL含愛德萬甜約2，5，10，20，50，100 μg。

1.2.3 液相色譜條件 Shiseido AQ-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) 色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.02 mol/L 磷酸二氫銨(用三乙胺調(diào)節(jié)pH至5.5±0.05)為流動(dòng)相B，梯度洗脫(洗脫程序見表1)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.4 數(shù)學(xué)模型建立

P=C×V1/V2，

(1)

式中:

P——樣品中愛德萬甜含量，μg/mL；

C——愛德萬甜在樣品溶液中的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V1——樣品定容體積，mL；

V2——樣品量取體積，mL。

1.2.5 不確定度來源分析 分析愛德萬甜檢測(cè)方法與含量計(jì)算數(shù)學(xué)模型，不確定度的主要影響因素有標(biāo)準(zhǔn)溶液制備(包括稱量和稀釋)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品溶液制備(包括量取、稀釋、包含隨機(jī)誤差的回收率)、樣品測(cè)量重復(fù)性等。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備不確定度

2.1.1 稱量不確定度 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量不確定度u(m)來源于稱量誤差u(m1)及稱量重復(fù)性u(píng)(m2) 2個(gè)分量。

合成上述2個(gè)分量，得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量不確定度：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量相對(duì)不確定度為u(m)/m=0.010/25=0.000 40。

2.1.2 稀釋不確定度 精密稱取愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為貯備液，再用10 mL 分刻度吸管精密量取不同體積貯備液分別至100 mL 量瓶中，制備系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，不確定度來源于10 mL刻度吸管誤差、25 mL容量瓶誤差、100 mL容量瓶誤差3個(gè)分量。

稀釋的相對(duì)不確定度由上述3個(gè)分量合成得到：

查閱標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，因未給出賦值的不確定度，故忽略不計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)溶液制備不確定度由稱量相對(duì)不確定度與稀釋相對(duì)不確定度合成得到：

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不確定度

取質(zhì)量濃度分別為1.956，4.891，9.781，19.56，48.91，97.81 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液(共6個(gè)濃度點(diǎn))進(jìn)樣，平行進(jìn)樣2針，用最小二乘法擬合線性方程y=a+bc及相關(guān)系數(shù)(r)[15]。樣品測(cè)定9次，樣品中愛德萬甜平均質(zhì)量濃度為73.98 μg/mL。按貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差：

因此標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 樣品溶液制備不確定度

用5 mL單刻度移液管精密量取樣品溶液至50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋定容，取續(xù)濾液即為樣品溶液，故不確定度包含3個(gè)分量：5 mL移液管不確定度、50 mL量瓶不確定度、包含人員操作等隨機(jī)誤差的回收率不確定度。

(3) 回收率不確定度:分析人員熟練程度、過濾時(shí)棄去初濾液的量、過濾時(shí)溶劑揮發(fā)等引起的不確定度，通過加標(biāo)回收試驗(yàn)評(píng)價(jià)[15]。按愛德萬甜在樣品中含量的80%，100%，120%分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定樣品加標(biāo)回收率，每個(gè)梯度測(cè)定3份，共9份，回收率分別為102.4%，102.4%，98.8%，103.6%，104.8%，101.7%，102.1%，101.5%，102.6%，平均為102.2%，RSD為1.7，回收最大值與平均值偏差b+=104.8%-102.2%=2.6%，平均值與最小值偏差b-=102.2%-98.8%=3.4%。則回收不確定度為：

合成上述3個(gè)分量，即得到樣品溶液制備不確定度：

2.4 樣品重復(fù)測(cè)定不確定度

樣品重復(fù)測(cè)定9次，愛德萬甜含量分別為76.5，77.2，74.3，74.1，72.4，70.4，73.6，74.2，73.1 μg/mL，平均含量為74.0 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=2.1。樣品重復(fù)測(cè)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不定度為

2.5 合成不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)溶液制備不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不確定度、樣品溶液制備不確定度、樣品重復(fù)測(cè)定不確定度4個(gè)分量，即得到該法測(cè)定糖漿劑藥品中愛德萬甜含量的不確定度

U(v)=74.0×0.018=1.3 μg/mL。

以95%為置信限，包含因子k=2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度U=k×U(v)=2×1.3=2.6 μg/mL。則該批次小兒止咳糖漿樣品中愛德萬甜含量為(74.0±2.6) μg/mL。

2.6 不確定度影響因素分析

綜上，愛德萬甜測(cè)量不確定度來源見圖1，各影響因素按大小依次為樣品溶液制備(0.014)、樣品測(cè)量重復(fù)性(0.009 5)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合(0.004 9)、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備(0.004 3)。標(biāo)準(zhǔn)溶液制備操作步驟簡(jiǎn)單，僅包含了容量?jī)x器帶入的系統(tǒng)誤差，不確定分量較小。而樣品溶液制備、樣品測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不僅包含儀器設(shè)備帶入的系統(tǒng)誤差，也包括偶然誤差，因此相對(duì)較大。試驗(yàn)時(shí)，為確保測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)通過控制實(shí)驗(yàn)室溫濕度恒定、使用檢定合格并清潔的器具、調(diào)試儀器設(shè)備達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)、多次重復(fù)測(cè)定、提高技術(shù)人員分析水平等方面減少偶然誤差。

圖1 不確定度來源分析Figure 1 Analysis for source of uncertainty

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明,樣品溶液制備引入的不確定度(0.014)最大。高效液相色譜法測(cè)定小兒止咳糖漿中愛德萬甜含量的不確定度來源主要有：① 玻璃容器、量器不準(zhǔn)確帶入的誤差，為了減少誤差，應(yīng)使用經(jīng)校準(zhǔn)符合要求的玻璃容器、量器，移液管使用前用待量取的溶液潤(rùn)洗3次以上；② 環(huán)境影響，試驗(yàn)過程中，盡量保持環(huán)境溫濕度恒定，試驗(yàn)用的樣品、溶劑、玻璃器皿等放入實(shí)驗(yàn)室一定時(shí)間與室溫保持一致，可以有效降低試驗(yàn)環(huán)境帶入的誤差；③ 試驗(yàn)人員讀數(shù)誤差，可以通過不斷提高分析人員水平降低誤差；④ 樣品過濾帶入的誤差，微孔濾膜、定量濾紙對(duì)待測(cè)成分都有一定程度的吸附作用，樣品過濾時(shí)，棄去初濾液，使濾膜或?yàn)V紙吸附達(dá)到飽和后，再接取續(xù)濾液用于試驗(yàn)，可以有效消除或降低過濾帶入的誤差。