水稻咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的原核表達(dá)、抗體制備和應(yīng)用

索青青 吳楠 楊慧 李莉 王錫鋒

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

木質(zhì)素是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的次生代謝產(chǎn)物，也是合成其它疏水聚合物（如角質(zhì)、木栓素和孢粉素）以及一系列可溶性特殊代謝物（包括類黃酮、羥基肉桂酸酯、木脂素、單寧和二苯乙烯）所必需的［1］。木質(zhì)素具有極其重要的生物學(xué)功能。首先，它是植物細(xì)胞壁的重要組分［2］，幾乎所有的陸地植物和一些藻類都能合成木質(zhì)素；其次，它在保護(hù)植物抵御機(jī)械損傷、外來(lái)病原物入侵、脅迫響應(yīng)（如紫外線輻射），水分和養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)确矫姘l(fā)揮著重要作用［3］。木質(zhì)素的生物合成主要是通過(guò)苯丙氨酸/酪氨酸代謝途徑［4］，首先苯丙氨酸或酪氨酸脫氨形成肉桂酸，經(jīng)過(guò)羥基化、甲基化和還原等一系列步驟后，形成3種主要單體（對(duì)香豆醇、松柏醇和芥子醇）［5］，最終由3種單體脫氫聚合形成一種復(fù)雜的酚類聚合物［6］。

咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoylcoenzyme A-O-methyltransferase，CCoAOMT）是木質(zhì)素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，它是一類S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，在木質(zhì)素合成途徑中以咖啡酰輔酶A為底物，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物苯環(huán)上，形成阿魏酰輔酶A［7］?？Х弱］o酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶與木質(zhì)素合成過(guò)程中的其他酶相比發(fā)現(xiàn)較晚。Pakusch等［8］于1989年首次發(fā)現(xiàn)并提出可能存在一種催化咖啡酰輔酶A甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶，且該酶的活性受真菌激活誘導(dǎo)。后在擬南芥、水稻、棉花、煙草等多種植物中都相繼成功克隆到CCoAOMT基因［7］。有研究表明，在煙草中表達(dá)CCoAOMT基因序列的反義拷貝導(dǎo)致總木質(zhì)素含量減少，并伴隨著矮化表型以及葉片和花的形態(tài)改變［9］。小麥TaCCoAOMT1基因在莖和根中高表達(dá)，它對(duì)木質(zhì)素的生物合成很重要，與莖的成熟度有關(guān)［3］。在CCoAOMT基因表達(dá)被抑制的轉(zhuǎn)基因煙草與楊樹(shù)中，木質(zhì)素含量顯著降低［10-11］。由于木質(zhì)素具有支撐細(xì)胞壁的功能，也被認(rèn)為與植物的抗逆或抗病性有關(guān)［12］。甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因的過(guò)量表達(dá)能夠提高煙草對(duì)干旱、高鹽脅迫的抗性［13］。最新研究表明擬南芥CCoAOMT1基因可通過(guò)調(diào)節(jié) H2O2積累和脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)在響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮積極作用［14］。該酶對(duì)于水稻生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆抗病性等方面中的功能研究少見(jiàn)報(bào)道，目前僅有研究證明水稻中3個(gè)OsCCoAOMT基因（OsCCoAOMT1、OsCCoAOMT20、OsCCoAOMT26）可能與植物中木質(zhì)化進(jìn)程有關(guān)［15］。

為進(jìn)一步了解OsCCoAOMT1基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)利用和抗病中的重要作用，急需制備該基因所編碼蛋白的抗體。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆得到OsCCoAOMT1基因，并將其構(gòu)建在原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)重組蛋白，蛋白經(jīng)純化后，注射新西蘭公兔，成功獲得了多克隆抗體。對(duì)該抗體進(jìn)行純化后檢測(cè)其特異性與有效性，并通過(guò)免疫熒光手段將抗體標(biāo)記水稻原生質(zhì)體觀察該蛋白在水稻細(xì)胞中的定位情況，為后續(xù)對(duì)水稻咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的功能研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試水稻品種為鎮(zhèn)稻99，由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存，置于光期14 h，溫度為30℃；暗期10 h，溫度為28℃的光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。

1.1.2 菌株和載體 原核表達(dá)載體pET30a（+）購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)），原核表達(dá)菌株大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）購(gòu)自全式金公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent，2 × Phanta Max Master Mix（Dye Plus），2× Universal Ligation Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司（GenStar）；IPTG、NC膜購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）；DNA回收試劑盒購(gòu)自艾德科技（北京）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Axygen公司（美國(guó)）；Dylight 568購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及目的基因的克隆 根據(jù)OsCCoAOMT1基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)NdeI和Hind III的引物OsCCoAOMT1-F1：5'-CATATGATGGCCGAGGCGGCGTCG-3'（引入酶切位點(diǎn)NdeI）；OsCCoAOMT1-R1：5'-AAGCTTTCACTTGACGCGGCGGCAGAG-3'（引入酶切位點(diǎn)Hind III）。

利用Trizol法提取水稻總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，利用帶有酶切位點(diǎn)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到同樣帶有酶切位點(diǎn)的目的基因片段。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III雙酶切純化后的目的基因片段和pET30a（+）載體，將酶切后的目的基因片段和pET30a（+）載體用2 × Universal Ligation Mix連接，得到原核表達(dá)載體pET30a（+）-OsCCoAOMT1。

1.2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑選3個(gè)生長(zhǎng)良好的陽(yáng)性克隆，分別接種到含有50 μg/mL卡那霉素的4 mL 液體LB培養(yǎng)基中。置于37℃的搖床中，以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖動(dòng)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，在其中兩個(gè)離心管中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，分別在15℃下誘導(dǎo)16 h和37℃下誘導(dǎo)4 h，最后一個(gè)離心管作為陰性對(duì)照不加入IPTG。后將菌液離心，收集沉淀，加入300 μL裂解緩沖液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，5%甘油pH = 8.0）在超聲破碎儀中超聲破碎1 min。將50 μL 5×Loading buffer與100 μL細(xì)胞裂解液混合，作為全細(xì)胞裂解液樣品。100℃沸水中加熱樣品10 min，并在15 000 r/min下離心5 min。將剩余的200 μL細(xì)胞裂解液在15 000 r/min下離心10 min，收集細(xì)胞裂解液上清液和沉淀，分別將90 μL 5×Loading buffer與180 μL上清液混合，作為細(xì)胞裂解液上清液樣品。用150 μL 5×Loading buffer重懸沉淀，作為細(xì)胞裂解液沉淀樣品。將樣品在100℃沸水中加熱10 min，15 000 r/min下 離 心5 min，利 用SDSPAGE電泳對(duì)所得上清和沉淀樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 抗體制備和Western blot檢測(cè) 為了進(jìn)一步得到OsCCoAOMT1可溶性蛋白，將其按照最優(yōu)條件誘導(dǎo)，菌體經(jīng)超聲破碎后離心，收集上清，Ni2+-NTA抗原親和柱純化蛋白，純化后的蛋白注射于新西蘭公兔，經(jīng)3次加強(qiáng)免疫后收集相應(yīng)的抗血清。提取水稻莖和葉總蛋白，通過(guò)Western blot對(duì)抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.2.5 免疫熒光法標(biāo)記原生質(zhì)體 原生質(zhì)體來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室前期創(chuàng)制的超表達(dá)帶有GFP熒光標(biāo)記OsCCoAOMT1的轉(zhuǎn)基因水稻（轉(zhuǎn)錄倍數(shù)提高21倍）及其野生型水稻品種鎮(zhèn)稻99，利用酶解法提取水稻莖部原生質(zhì)體，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入500 μL 原生質(zhì)體懸液，再用滴管小心的滴入4%多聚甲醛，室溫固定1 h；300 r/min離心5 min，用寬口槍頭小心吸除固定液，8%甘露醇洗3次，每次5 min；向培養(yǎng)皿中加入300 μL 制備的OsCCoAOMT1蛋白抗體稀釋液（抗體用3% BSA按1∶100稀釋），于室溫孵育1-2 h；300 r/min離心5 min，用寬口槍頭小心吸去抗體稀釋液，8%甘露醇洗3次，每次5 min；考慮到轉(zhuǎn)基因水稻帶有GFP熒光標(biāo)記，采用Dylight 568標(biāo)記的二抗，37℃孵育1-2 h；8%甘露醇洗去殘留的二抗，制片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察該蛋白在原生質(zhì)體中的定位。

2 結(jié)果

2.1 目的基因OsCCoAOMT1的克隆

以水稻幼苗總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用PCR擴(kuò)增方法得到目的基因OsCCoAOMT1全長(zhǎng)782 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。將目的基因片段切膠回收，并用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III進(jìn)行雙酶切。

圖1 OsCCoAOMT1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplifying product of OsCCoAOMT1 gene

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pET30a（+）載體用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III進(jìn)行雙酶切，與酶切后的目的片段相連接，并轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有卡那霉素抗性的平板上，篩選陽(yáng)性克隆后提取重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1，將陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序并以NdeI和HindIII雙酶切驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果顯示克隆片段序列與目的序列相似性為100%，酶切陽(yáng)性質(zhì)?？傻玫絻蓷l帶，分別為5 422 bp和782 bp（圖2），表明該載體已成功構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1的酶切鑒定Fig.2 Restriction identification of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

挑取陽(yáng)性單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，分別在15℃條件下誘導(dǎo)16 h和37℃條件下誘導(dǎo)4 h后，加入細(xì)胞裂解液得到全細(xì)胞裂解液、上清和沉淀樣品，經(jīng)SDSPAGE電泳（圖3）與Western blot（圖4）對(duì)所得樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該蛋白最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度為0.5 mmol/L下37℃下誘導(dǎo)4 h，并且該蛋白在上清中有較高的含量。在該誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組蛋白大量表達(dá)，菌體經(jīng)超聲破碎后離心，收集上清，Ni2+-NTA抗原親和柱純化蛋白，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖5）可知其蛋白條帶單一，并通過(guò)BCA法測(cè)定純化后的蛋白濃度達(dá)到0.83 mg/mL。

圖3 重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1不同誘導(dǎo)條件下的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1 under the different inducing condition

圖4 重組質(zhì)粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1不同誘導(dǎo)條件下的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1 under the different inducing condition

圖5 OsCCoAOMT1蛋白的純化Fig.5 Purification of OsCCoAOMT1 protein

2.4 OsCCoAOMT1抗體制備和Western blot

將純化后的OsCCoAOMT1蛋白注射于新西蘭公兔，經(jīng)3次加強(qiáng)免疫后收集相應(yīng)的抗血清。為了檢測(cè) OsCCoAOMT1抗體的特異性，分別提取水稻莖、葉總蛋白，以同樣的OsCCoAOMT1抗體濃度（1∶1 000）進(jìn)行Western blot，結(jié)果表明，不同組織的水稻總蛋白均顯示目的大小的條帶（圖6），且由條帶強(qiáng)弱可知該蛋白在水稻不同部位的表達(dá)量不同，莖中的表達(dá)量要高于葉。同時(shí)將水稻幼苗總蛋白（3.8 mg/mL）分別稀釋2倍、4倍、8倍、16倍，在相同抗體濃度（1∶1 000）下孵育，均可得到單一目的條帶，并且條帶逐漸變?nèi)酰▓D7）。以上結(jié)果表明該抗體可以廣泛應(yīng)用于水稻的不同組織和部位，并且具有較高的靈敏度和良好的特異性。

圖6 水稻莖、葉中OsCCoAOMT1的Western blot 檢測(cè)Fig.6 Western blot analysis of OsCCoAOMT1 in rice stem and leaf

圖7 水稻不同蛋白濃度Western blot檢測(cè)Fig.7 Western blot analysis of different protein concentrations in rice

2.5 原生質(zhì)體標(biāo)記

參考本實(shí)驗(yàn)室已有的方法［16］，對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因水稻莖原生質(zhì)體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，野生型和轉(zhuǎn)基因水稻在激光共聚焦顯微鏡下均可檢測(cè)到抗體信號(hào)（圖8），且轉(zhuǎn)基因水稻的GFP信號(hào)可以與抗體的信號(hào)共定位。同時(shí)對(duì)水稻莖的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白進(jìn)行分離，而后分別對(duì)細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白進(jìn)行Western blot，結(jié)果（圖9）表明，同等樣品下胞質(zhì)中OsCCoAOMT1蛋白含量遠(yuǎn)高于其在細(xì)胞核中的含量，說(shuō)明OsCCoAOMT1蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。因此可以充分說(shuō)明該抗體特異性良好，且可特異性的用于免疫熒光分析。

圖8 OsCCoAOMT1蛋白在野生型（A）和轉(zhuǎn)基因（B）水稻莖原生質(zhì)體中的定位分析Fig.8 Location analysis of OsCCoAOMT1 protein in the wild-type（A）and transgenic（B）rice stem protoplasts

圖9 OsCCoAOMT1蛋白在水稻細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)量分析Fig. 9 Expression level analysis the OsCCoAOMT1 protein in rice cytoplasm and nucleus

3 討論

利用原核表達(dá)重組蛋白免疫動(dòng)物來(lái)制備抗體是研究蛋白質(zhì)功能的重要手段之一［17］。通過(guò)原核表達(dá)獲得大量的抗原蛋白，可用于蛋白性質(zhì)、功能、蛋白間相互作用及多種生化功能的研究［18］。本文首先構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a（+）-OsCCoAOMT1，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。誘導(dǎo)條件是原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的重要因素［19］，因此我們選擇了在IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，在不同的溫度，不同時(shí)間下誘導(dǎo)，優(yōu)化獲得了該蛋白高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件：37℃條件下誘導(dǎo)4 h。當(dāng)制備多克隆抗體時(shí)，作為抗原的蛋白質(zhì)純度越高，獲得的抗體特異性越好［20］。由于OsCCoAOMT1蛋白在上清中的表達(dá)量更高，因此我們選擇Ni2+-NTA親和柱純化，獲得高純度的蛋白后將其免疫新西蘭公兔，成功制備了多克隆抗體。

關(guān)于OsCCoAOMT1蛋白的具體功能及其在水稻生長(zhǎng)發(fā)育以及抗病防御機(jī)制中的研究較少。最近有研究表明，編碼玉米咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因ZmCCoAOMT2對(duì)多種病原菌具有數(shù)量抗性，且在擬南芥Col-0中，CCoAOMT1基因也在病原體或激發(fā)子處理后被誘導(dǎo)，推測(cè)其可能在抗性功能中起重要作用［21］。OsCCoAOMT1基因作為水稻木質(zhì)素合成過(guò)程中的重要酶，僅有研究表明其可能參與調(diào)控水稻的木質(zhì)化進(jìn)程［15］。本研究用制備的抗體對(duì)水稻不同組織和部位進(jìn)行Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OsCCoAOMT1蛋白在水稻莖部和葉部均有表達(dá)，且莖中表達(dá)量高于葉中表達(dá)量，由此推測(cè)其可能在水稻莖的伸長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸?shù)确矫姘l(fā)揮重要作用。通過(guò)免疫熒光法對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型水稻莖原生質(zhì)體進(jìn)行標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡可觀察到轉(zhuǎn)基因水稻的GFP信號(hào)可以與抗體的信號(hào)共定位，說(shuō)明該抗體特異性好，可后續(xù)用于免疫熒光分析，同時(shí)將水稻莖核質(zhì)蛋白分離，經(jīng)Western blot檢測(cè)可知該蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，推測(cè)其可能參與細(xì)胞質(zhì)相關(guān)代謝過(guò)程。但也有相關(guān)研究表明甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT蛋白可定位于細(xì)胞核、質(zhì)膜上［22］，因此關(guān)于該蛋白的定位情況還有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究利用重組DNA技術(shù)成功構(gòu)建了pET30a（+）-OsCCoAOMT1原核表達(dá)載體，確定了該蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度0.5 mmol/L，37℃下誘導(dǎo)4 h，在該條件下大量表達(dá)和純化該蛋白，成功制備了OsCCoAOMT1蛋白的多克隆抗體。OsCCoAOMT1蛋白在水稻莖部表達(dá)量更高，推測(cè)其可能參與水稻莖部生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，且該抗體可特異性的用于免疫熒光分析，為后續(xù)研究其在水稻生長(zhǎng)發(fā)育以及抵抗病原侵染等功能奠定了基礎(chǔ)。