假單胞菌的篩選及其發(fā)酵液控制赤潮甲藻的研究

鄭璐薇,林 洪，蘇玉萍,2，Balaji Prasath BARATHAN ，鄭 毅，鄭 怡

(1.福建師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院、碳中和現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院，福建 福州 350007；2.福建省河湖健康研究中心(福建師范大學(xué))，福建 福州 350007；3.福建省特色海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350117)

有害藻華(harmful algal blooms，HABs)是指水體中一些有毒有害的微藻、大型藻類等生物大量暴發(fā)，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成危害的現(xiàn)象[1]．在海洋環(huán)境中，常見的有害藻華主要有赤潮、褐潮、綠潮等，在赤潮生物暴發(fā)性增殖的過程中，會消耗大量的CO2，導(dǎo)致海水的pH值不斷上升，對海洋生物的生長和繁衍產(chǎn)生不利的影響[2]．Soto等[3]研究了幾乎每年都會出現(xiàn)在佛羅里達(dá)沿岸海灣的由短凱倫藻(Kareniabrevis)引起的赤潮，其在2017年持續(xù)了15個月，導(dǎo)致大面積缺氧事件，嚴(yán)重危害了當(dāng)?shù)厥返纳妫恍┏喑鄙锓置诘恼骋簳皆诤Ｑ髣游锏啮w上，使其無法呼吸，最后導(dǎo)致它們窒息死亡，造成漁業(yè)損失，如夜光藻(Noctilucascintillans)、血紅哈卡藻(Akashiwosanguinea)等[4]．部分有毒赤潮藻暴發(fā)時會產(chǎn)生毒素，引起魚類死亡，如鏈狀裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)、米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)、球形棕囊藻(PhaeocystisglobosaScherffel)等[5]．更為嚴(yán)重的是，藻毒素會通過食物鏈在海魚、牡蠣貝類等海產(chǎn)品的體內(nèi)富集，居民誤食了受污染的海產(chǎn)品會導(dǎo)致腹瀉、中毒，甚至死亡．有害赤潮消亡時，死魚的大量分解會釋放二氧化硫等有害物質(zhì)，改變水體的理化性質(zhì)，對海洋生態(tài)系統(tǒng)、漁業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)、旅游業(yè)以及人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[6]．我國每年4-6月頻發(fā)的米氏凱倫藻和鏈狀裸甲藻等有毒甲藻赤潮，嚴(yán)重影響居民健康和沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)展．在近年的海洋觀測中發(fā)現(xiàn)，福建沿海的米氏凱倫藻的藻密度居高不下[7-8]，鏈狀裸甲藻孢囊分布密集，為赤潮的暴發(fā)埋下了一定的隱患[9]．

迄今為止，控制有害赤潮的方法主要可分為物理、化學(xué)和生物3類方法[10]．生物法具有特異性較強(qiáng)、低成本、低毒、環(huán)境友好等特點(diǎn)，細(xì)菌在赤潮發(fā)生和消亡過程中起到了重要的作用，因此也是生物法控制HABs的研究熱點(diǎn)[11-12]，目前分離鑒定出了數(shù)百種能夠溶解藻細(xì)胞或抑制藻類生長的溶藻菌(Algicidal bacteria)，主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、短桿菌屬(Brevibacterium)等[13-15]．Skerratt等[16]發(fā)現(xiàn)交替假單胞菌對鏈狀裸甲藻有積極的殺藻作用，Zheng等[17]研究則發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬和交替假單胞菌屬的細(xì)菌培養(yǎng)濾液對米氏凱倫藻的溶藻效果明顯．以上研究說明了溶藻菌在控制赤潮領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力．

目前，國內(nèi)外對鏈狀裸甲藻的研究仍主要停留在底泥孢囊的監(jiān)測、藻類生長以及藻毒素處理，針對其采用溶藻菌進(jìn)行調(diào)控的研究較少[18-19]．本研究篩選出一株特異性溶藻菌Ps3，探究其發(fā)酵液不同組分的溶藻效果．由于一些溶藻菌可分泌多種特定的溶藻物質(zhì)，宿主范圍較廣[20]，而鏈狀裸甲藻、米氏凱倫藻均為福建沿海常見的有毒甲藻，具有廣溫廣鹽的特性，已成為我國近海海域典型的海洋生態(tài)災(zāi)害的原因種[8,21]．因此利用菌Ps3對米氏凱倫藻和鏈狀裸甲藻進(jìn)行溶藻效果探究，對海洋甲藻赤潮的控制具有現(xiàn)實(shí)意義．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種的培養(yǎng)

鏈狀裸甲藻、米氏凱倫藻均購自廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室．選用L1培養(yǎng)基[22]，培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度(20±1)℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光暗比12 h∶12 h．每日手動搖2次，防止赤潮藻貼壁生長，根據(jù)其生長狀態(tài)，取一定體積處于對數(shù)生長期狀態(tài)的赤潮藻接種到新鮮營養(yǎng)液中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)[23]．

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)使用的5株溶藻菌(Ps1-Ps5)是由項(xiàng)目組福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院合作團(tuán)隊從海洋蝦池中分離保存的菌種．將初代保存于4 ℃的菌Ps1-Ps5微生物斜面取出，在經(jīng)紫外滅菌的超凈臺上各挑取一滿環(huán)接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中30 ℃、130 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，即為復(fù)壯種子液．從復(fù)壯種子液中再重新取一滿環(huán)接種于50 mL培養(yǎng)基，在30 ℃、130 r·min-1培養(yǎng)24 h．同時對菌株種子液進(jìn)行平板劃線，檢驗(yàn)無染菌情況[24]．

1.3 菌-藻共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

將保存于-80 ℃的甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50.0%)待試菌置于4 ℃下解凍2 h．在紫外滅菌后的超凈臺中用接種針在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線．于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，檢查菌落的均一性．從平板中挑取一滿環(huán)菌株接種到含50 mL培養(yǎng)液的100 mL錐形瓶中，將錐形瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中，條件設(shè)置為30 ℃、180 r·min-1．將5株已復(fù)蘇的菌株培養(yǎng)48 h后的菌液按體積分?jǐn)?shù)1.0%分別加入處于指數(shù)生長期的鏈狀裸甲藻．以加入等體積的培養(yǎng)基為對照，分別于0、4、8、12、18、24、36、48、72 h取樣測定藻細(xì)胞密度，每組樣本設(shè)置3個平行，計算溶藻率，見公式(1).

(1)

式中R為溶藻率；ρ0為對照組藻細(xì)胞密度，L-1；ρ1為處理組藻細(xì)胞密度，L-1.

1.4 溶藻顯微觀察

每次取0.1 mL已固定的藻樣品于0.1 mL浮游植物計數(shù)框，置于江南生物顯微鏡BM2000上觀察藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化并拍照．根據(jù)Lovejoy等[25]設(shè)定的細(xì)胞死亡特征(MSE)方法，用顯微鏡觀察判斷藻細(xì)胞是否死亡．MSE主要為：運(yùn)動性喪失(細(xì)胞無運(yùn)動性)、崩解(細(xì)胞膜破裂，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂)、裂解(細(xì)胞迅速滲漏，細(xì)胞器破壞)或蛻皮(細(xì)胞膜脫落)．

1.5 分子生物學(xué)鑒定

將該菌株用液體牛肉膏培養(yǎng)基培養(yǎng)至生長期，在無菌條件下，移取2 mL至無菌離心管，冷藏寄送至北京奧維森基因有限公司進(jìn)行16S rDNA鑒定，包括DNA提取、PCR擴(kuò)增、序列測定等工作．

PCR擴(kuò)增的上游引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，下游引物：1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)．在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫中用局部相似性基本查詢工具(BLAST)進(jìn)行比較，初步確認(rèn)細(xì)菌種屬．在MEGA7.0軟件中使用鄰接法(Neighbor-Joining)，用極大似然估計模型(Maximum Composite Likelihood)，計算1 000次自展值，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．將測得的菌Ps3的16S rDNA序列信息提交到GenBank (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.6 發(fā)酵液組分分離

利用極性溶劑對細(xì)菌發(fā)酵液進(jìn)行粗分離，觀察不同組分的溶藻效果．以等量的培養(yǎng)基為對照，取100 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌Ps3發(fā)酵液，用0.22 μm孔徑玻璃纖維濾膜重復(fù)過濾3次，得到Ps3無菌發(fā)酵液．將Ps3無菌發(fā)酵液與乙酸乙酯等體積混合后在180 r·min-1振蕩20 min，在分液漏斗中靜置分層，收集有機(jī)相溶液，重復(fù)萃取3次．在80 ℃下將萃取相進(jìn)行減壓蒸餾蒸干，最后加入5 mL純乙酸乙酯溶解，定容至10 mL，為乙酸乙酯相提取溶液；剩余物質(zhì)進(jìn)行減壓蒸餾蒸干，用5 mL水溶解并定容至10 mL，獲得剩余相溶液，均在-4 ℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

1.7 不同組分溶藻效果實(shí)驗(yàn)

以純乙酸乙酯為對照，將乙酸乙酯相提取溶液、剩余相水溶液分別按體積分?jǐn)?shù)0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的投加量加入鏈狀裸甲藻和米氏凱倫藻中，培養(yǎng)溫度為(20±1) ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx、光暗比為12 h∶12 h．定時取樣，計算藻細(xì)胞數(shù)目，取3次平行樣，在48 h取樣并計算數(shù)量，觀察溶藻效果，測定相應(yīng)的溶藻率．

1.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2019、Origin2021軟件進(jìn)行作圖，SPSS24.0對溶藻數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(P<0.05為顯著性差異)，MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

2 結(jié)果與討論

2.1 溶藻細(xì)菌基本形貌特征

從海洋養(yǎng)蝦池中分離得到5株菌，編號分別為Ps1-Ps5．在培養(yǎng)管中各菌株特征如圖1所示，Ps1、Ps2的菌落表面較透明，邊緣光滑整齊，可能為具有莢膜類的菌種；Ps3的菌落邊緣不規(guī)則；Ps4的菌落表面干燥皺褶；Ps5單菌落為鮮明的黃色．各菌落在顏色、光澤及形狀方面差異較為明顯．

圖1 菌Ps1-Ps5的基本形貌Fig.1 Basic morphology of bacteria Ps1-Ps5

2.2 共培養(yǎng)下5株細(xì)菌對鏈狀裸甲藻生長的影響

經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，在48 h內(nèi)對照組鏈狀裸甲藻細(xì)胞密度從9.5×104L-1增長到1.7×105L-1，表現(xiàn)出良好的生長活性．而在與細(xì)菌共同培養(yǎng)的過程中，各組表現(xiàn)出了不同的抑藻效果(圖2)．從圖2a、2e可看出，0～18 h鏈狀裸甲藻生長滯緩，18 h之后藻細(xì)胞密度穩(wěn)步增長．這表明鏈狀裸甲藻對菌Ps1、Ps5具有一定抵抗能力，能夠適應(yīng)菌Ps1、Ps5帶來的藻際環(huán)境的變化．圖2b中，前24 h鏈狀裸甲藻的生長受到菌Ps2的抑制，但在24～72 h內(nèi)藻密度變化并不明顯，可能是菌與藻形成了拮抗作用．從圖2c、2d可看出，菌Ps3、Ps4均表現(xiàn)出較好的溶藻能力．將5株細(xì)菌48 h的溶藻率進(jìn)行對比，從高到低分別為Ps3>Ps4>Ps2>Ps1>Ps5(圖2f)．溶藻效果最好的是菌Ps3，48 h溶藻率達(dá)到87.4%；其次是Ps4，48 h的溶藻率為78.0%.

圖2 共培養(yǎng)下菌Ps1-Ps5對鏈狀裸甲藻的抑藻能力Fig.2 The algicidal activity of bacterial Ps1- Ps5 on Gymnodinium catenatum under co-culture

鏈狀裸甲藻個體較大，可以在低倍的光學(xué)顯微鏡中觀察到藻體形態(tài)變化．菌藻共培養(yǎng)后，從圖3可觀察到各實(shí)驗(yàn)組剩余可辨識藻體的主要形貌．在與菌Ps1、Ps5分別共同培養(yǎng)后的藻細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)保持較好，橫溝清晰，具有活動性(圖3a及圖3e)．與菌Ps2共培養(yǎng)的藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)較模糊(圖3b)；而菌Ps3作用后，可以看到藻體內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，橫溝消失，細(xì)胞膨脹(圖3c)；圖3d則觀察到與菌Ps4共同培養(yǎng)的藻細(xì)胞膜稍有變形，無細(xì)胞質(zhì)滲漏．

根據(jù)菌-藻共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和鏡檢結(jié)果綜合判斷，菌Ps3的溶藻能力明顯高于其它菌株，因此選擇菌Ps3做進(jìn)一步研究．

2.3 菌Ps3的菌落及菌體形態(tài)

從圖4a可觀察到Ps3的單菌落呈圓形顆粒狀，稍有隆起，菌落直徑在1～3 mm之間，表面光滑濕潤，乳白色不透明．Ps3的革蘭氏染色情況如圖4b所示，染色結(jié)果為藍(lán)色，判斷為革蘭氏陰性菌．使用掃描電鏡進(jìn)一步觀察，單個Ps3菌體形態(tài)如圖4c所示，為短桿狀，大小為(1.5～1.7) μm×(1.1～ 1.3) μm，多個頭尾相連，無鞭毛，未觀察到芽孢存在．

2.4 菌Ps3的分子生物學(xué)鑒定

對菌Ps3的16S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)鑒定結(jié)果可知，該菌有堿基對1 437 bp．在NCBI上(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上傳菌種的基本情況和基因序列，登錄號為OK103600.1．將菌Ps3的基因序列進(jìn)行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，與菌Ps3的高相似菌種均為假單胞菌屬(Pseudomonas)，相似度皆達(dá)到99.0%以上(表1)．

表1 菌Ps3在BLAST庫比對結(jié)果Tab.1 Results of strain Ps3 in BLAST database comparison

a-e分別表示與菌Ps1-Ps5共培養(yǎng)后的藻細(xì)胞圖3 菌藻共培養(yǎng)48 h后可辨識的藻體主要形貌Fig.3 Identifiable algal cells after 48 h of co-culture

圖4 Ps3菌落的基本形態(tài)Fig.4 Basic morphology of bacterial Ps3

本研究選取了合適的菌株基因序列，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示.與Ps3同源性比較高的菌株為Pseudomonassp.JC5和Pseudomonasprotegensstrain CP-M2-5，三者位于同一分支上.菌Ps3也與Pseudomonasplecoglossicidastrain 2-3有較高的同源性，二者均處于一個較大的分支上的兩個分支．

圖5 假單胞菌Ps3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of Pseudomonas Ps3

2.5 菌發(fā)酵液分離組分的溶藻效果

在鏈狀裸甲藻和米氏凱倫藻中分別投加不同體積分?jǐn)?shù)的乙酸乙酯后，48 h內(nèi)藻細(xì)胞密度基本持平，并無明顯改變．因此投加乙酸乙酯對溶藻實(shí)驗(yàn)的影響可以忽略．

將不同體積分?jǐn)?shù)的乙酸乙酯提取相溶液和剩余相溶液分別投加到鏈狀裸甲藻后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6a所示，體積分?jǐn)?shù)0.1%和0.5%乙酸乙酯提取相溶液對藻的溶解效果較差，分別為10.4%和24.6%；投加體積分?jǐn)?shù)1.0%的乙酸乙酯提取相溶液后，48 h溶藻率明顯增加，為80.5%；而投加體積分?jǐn)?shù)4.0%的提取相溶液之后，溶藻率達(dá)到98.4%．相較之下，投加體積分?jǐn)?shù)4.0%的剩余相溶液48 h之后溶藻率僅為24.5%，表明剩余相的溶藻能力較差．

在米氏凱倫藻中(圖6b)，投加體積分?jǐn)?shù)0.1%和0.5%乙酸乙酯提取相溶液后，溶藻率分別為15.4%和54.7%，高于鏈狀裸甲藻組，表現(xiàn)出較好的效果；而體積分?jǐn)?shù)4.0%乙酸乙酯提取相溶液的溶藻率達(dá)到95.9%，相較其它組有顯著提升(P<0.05)．值得注意的是，不同于鏈狀裸甲藻，體積分?jǐn)?shù)4.0%的剩余相溶液對米氏凱倫藻的溶藻率也有45.0%，作用顯著(P<0.05)，可能是由于藻的種類以及溶藻機(jī)理的不同，存在一定差異[26]．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，假單胞菌Ps3的活性物質(zhì)主要在乙酸乙酯提取相中．

圖6 假單胞菌Ps3發(fā)酵液中的乙酸乙酯提取相與剩余相對鏈狀裸甲藻(a)和米氏凱倫藻(b)的溶藻作用Fig.6 The algal lysis of Gymnodinium catenatum (a) and Karenia mikimotoi (b) by ethyl acetate extraction phase and residual phase in the fermentation broth of Pseudomonas sp.Ps3

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)采用菌藻共培養(yǎng)的方法，篩選出一株溶藻效果好的菌Ps3，革蘭氏染色結(jié)果為藍(lán)色，判斷為革蘭氏陰性菌；掃描電鏡觀察，單個Ps3菌體為短桿狀，大小為(1.5～1.7) μm×(1.1～1.3) μm．結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化和測序比對結(jié)果，鑒定菌Ps3為假單胞菌屬(Pseudomonas)．

(2)采用乙酸乙酯作為發(fā)酵液提取相，將不同體積分?jǐn)?shù)投加量下乙酸乙酯提取相溶液和剩余相溶液對鏈狀裸甲藻和米氏凱倫藻的溶藻率進(jìn)行比較，剩余相溶液的溶藻能力較差，投加體積分?jǐn)?shù)4.0%時對鏈狀裸甲藻的溶藻率僅為24.5%，對米氏凱倫藻的溶藻率為45.0%；假單胞菌Ps3的活性物質(zhì)主要在乙酸乙酯提取相中，4.0%乙酸乙酯相提取液對鏈狀裸甲藻和米氏凱倫藻的溶藻效果是最好的，48 h溶藻率分別為98.4%和95.9%．