ABCB1介導(dǎo)HDAC非選擇性抑制劑panobinostat耐藥的機(jī)制研究

竇永海，高曉麗

（1.天津市永久醫(yī)院，天津 300450；2.天津市第五中心醫(yī)院，天津 300450）

panobinostat（panobinostat，PBST）是一種強(qiáng)效口服泛組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑，該抑制劑于2015年被FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤患者［1］。大量臨床試驗(yàn)研究正在評(píng)價(jià)panobinostat對(duì)多種實(shí)體瘤中的抗癌效果，然而不可避免的耐藥是其進(jìn)一步臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的巨大障礙。ABCB1與腫瘤細(xì)胞耐藥高度相關(guān)［2］，表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜的ABCB1可將抗腫瘤藥物泵出胞外，降低胞漿內(nèi)抗腫瘤藥物有效濃度，介導(dǎo)治療抵抗［3］。然而，尚無(wú)研究充分揭示ABCB1在panobinostat耐藥中的作用和分子機(jī)制。因此，本研究擬通過(guò)細(xì)胞水平、體外酶活性水平以及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)ABCB1介導(dǎo)panobinostat耐藥的作用及分子機(jī)理，進(jìn)一步明確和充實(shí)PBST發(fā)生耐藥的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑KB-3-1、KB-C2、SW620/Ad300、SW620、HEK293/pcDNA3.1以及HEK293/ABCB1均由美國(guó)St.John′s University的Zhe-Sheng Chen教授贈(zèng)與。帕比司他（panobinostat，PBST，批號(hào)S1030）、依魯替尼（ibrutinib，批號(hào)S2680）、尼羅替尼（nilotinib，批號(hào)S5205）、拉帕替尼（lapatinib，批號(hào)S2111）、厄洛替尼（elortinib，批號(hào)S1023）、紫杉醇（批號(hào)S1150）、阿霉素（批號(hào)S1208）以及順鉑（批號(hào)S1166）購(gòu)置于Selleck公司。牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)37525）、特級(jí)胎牛血清（FBS，批號(hào)10099）、二甲基亞砜（批號(hào)D5879）、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號(hào)2323405）、青/鏈霉素（批號(hào)30-001-CI）以及胰蛋白酶（批號(hào)25-051-CI）購(gòu)置于美國(guó)Corning公司。PVDF膜（批號(hào)ISEQ00010）以及綠色熒光標(biāo)記的Goat-anti-mouse IgG抗體（批號(hào)A-11029）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。ABCB1單克隆抗體（批號(hào)SAB2108866）、DAPI（批號(hào)D9542）、MTT（批號(hào)M2128）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)71285-M）以及verapamil（批號(hào)1711202）購(gòu)置于美國(guó)Sigma公司。氚標(biāo)紫杉醇（批號(hào)33152970）購(gòu)置于美國(guó)Moravek公司。

1.2 儀器HERAA cell 150i細(xì)胞恒溫CO2培養(yǎng)箱以及C1112B超凈工作臺(tái)購(gòu)置于美國(guó)Sigma公司。I Mark全自動(dòng)酶標(biāo)儀以及Powerpac hc SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳-轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)買于美國(guó)Bio-Rad公司。5418R低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)置于美國(guó)Eppendorf公司。DMI 3000B倒置熒光顯微鏡購(gòu)置于瑞士Leica公司。Tri Carb 2100TR液體閃爍分析儀購(gòu)置于美國(guó)Packard公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究利用的全部細(xì)胞均在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并于含有5%濃度的CO2培養(yǎng)箱以37℃的潮濕溫度培養(yǎng)。KB-C2、SW620/Ad300為藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞，在使用前需要加入相應(yīng)的抗腫瘤藥物維持其耐藥性。具體方法為，在KB-C2細(xì)胞中以2 μg/ml的colchicine培養(yǎng)72 h，在SW620/Ad300細(xì)胞中以300 ng/ml的doxorubicin培養(yǎng)72 h，并更換無(wú)藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)并正常傳代兩周后使用。HEK293/ABCB1為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)ABCB1編碼區(qū)的帶有G418抗性細(xì)胞，使用前采用2 mg/ml的G418篩選穩(wěn)定細(xì)胞72 h后，更換無(wú)藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)并正常傳代兩周后使用。

1.4 基于MTT法的細(xì)胞增殖檢測(cè)及逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 顯微鏡下觀察處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，PBS進(jìn)行清洗，然后加入0.25%胰酶進(jìn)行消化（37℃培養(yǎng)箱），消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)有些許差別，消化完成后制備單細(xì)胞懸液，并利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，規(guī)定細(xì)胞密度為3×104個(gè)/ml，根據(jù)細(xì)胞實(shí)際濃度吸取特定體積的細(xì)胞懸液，并加入一定體積的培基，吸管吹打混合均勻，吸取200 μl液體加入到96孔板中，并設(shè)置空白對(duì)照，即不含細(xì)胞懸液的培基，并將邊緣孔用PBS填充，細(xì)胞鋪板完成后輕輕拍打培養(yǎng)板使細(xì)胞懸液均勻分布在孔中，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪板密度和細(xì)胞狀態(tài)，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜穩(wěn)定培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，加入按濃度梯度配置好的PBST，以DMSO處理組為對(duì)照組，培養(yǎng)72 h。給藥培養(yǎng)72 h后，給藥組和對(duì)照組每個(gè)孔加20 μl MTT溶液，培養(yǎng)4 h。經(jīng)過(guò)4 h孵育，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，用負(fù)壓泵吸去上清液，移液槍吸取100 μl DMSO加入到孔中，并放置于搖床上震蕩混合，使結(jié)晶紫甲瓚充分溶解，溶液呈透明色即可于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)OD值。采用Graphpad 7.00軟件計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的半抑制濃度。針對(duì)逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，按照上述體系，將特定濃度的逆轉(zhuǎn)藥物加入96孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，并按照上述步驟進(jìn)行后續(xù)處理。

1.5 Western blot法評(píng)價(jià)ABCB1蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KB-C2細(xì)胞，消化并計(jì)數(shù)，并以2×104個(gè)/孔的濃度接種于6孔板，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過(guò)夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每孔加入2 μl的panobinostat，使其KB-C2細(xì)胞藥物終濃度為100 nmol/L，加藥處理不同時(shí)間（24、48以及72 h）。處理完成后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部刮下來(lái)，吸管吸取含有細(xì)胞的培養(yǎng)液加入到1.5 ml EP管中，放置于低溫離心機(jī)中進(jìn)行離心，并采用冰PBS洗滌細(xì)胞，清洗1~2次。將提前配好的細(xì)胞裂解液（RAPA∶CocktailA∶CocktailB=100∶1∶1）加入到細(xì)胞沉淀中裂解細(xì)胞，收集裂解組分于離心管中，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液為總蛋白提取液。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，按一定比例混勻蛋白原液和超純水，使上樣蛋白量為20 μg，并加入5×SDS上樣緩沖液。在95℃水浴中孵育樣品10 min使其變性。根據(jù)比例配制凝膠，待膠凝后向孔中加入制備好的蛋白樣品和預(yù)染marker，進(jìn)行電泳。電泳完成后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件：電流200 mA，電轉(zhuǎn)2.5 h。結(jié)束后，將PVDF膜放在提前用1×TBST緩沖溶液配置好的5%的脫脂牛奶中，于室溫置于低速搖床1 h。牛奶封閉結(jié)束。按照抗體說(shuō)明書(shū)配置適當(dāng)濃度的一抗（抗ABCB1，1∶1000；抗GAPDH，1∶1 000）。將膜放入雜交帶中，加入一抗稀釋液，封口機(jī)封口。放在4℃搖床上，慢搖孵育過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，一抗進(jìn)行回收，使用TBST緩沖液清洗PVDF膜2~3次，每次5 min。孵育二抗1 h（HRP兔抗，1∶2 000），使用TBST緩沖液清洗PVDF膜2~3次，每次5 min。配置ECL顯影液（A液∶B液=1∶1），將配置好的發(fā)光顯影液（ECL）均勻加到目的蛋白條帶上進(jìn)行顯影拍照。

1.6 免疫熒光法評(píng)價(jià)ABCB1質(zhì)膜定位 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的細(xì)胞，消化并計(jì)數(shù)，并以2×104個(gè)/孔的濃度接種于6孔板，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過(guò)夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每孔加入2 μl的panobinostat，使細(xì)胞藥物終濃度為100 nmol/L，加藥處理不同時(shí)間（24、48以及72 h）。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（親本細(xì)胞）和模型組（經(jīng)DMSO處理的耐藥細(xì)胞）。作用完成后，采用4%多聚甲醛作為固定液，吸取一定體積加入到孔中，固定時(shí)間為30 min。固定結(jié)束之后，棄去多聚甲醛溶液，用冰PBS洗滌兩次。然后采用0.25%的Triton X-100溶液進(jìn)行透化，透化時(shí)間為5 min，再用PBS清洗液清洗2次。加入5%BSA，在37℃孵箱中進(jìn)行封閉，時(shí)間為1 h。封閉結(jié)束之后，加入一定體積按照抗體說(shuō)明書(shū)使用5%BSA配置的一抗稀釋液（抗P-gp，1∶500），于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h并用PBS進(jìn)行清洗。然后孵育二抗（綠色熒光標(biāo)記的Goat-anti-mouse IgG，1∶500）。利用抗熒光猝滅封片劑覆蓋板中細(xì)胞，并置于倒置熒光顯微鏡下觀察成像。

1.7 以氚標(biāo)紫杉醇為探針評(píng)價(jià)藥物蓄積水平 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，并接種于6孔板中（2×104個(gè)/孔），轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中過(guò)夜穩(wěn)定培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每孔加入2 μl的panobinostat，使細(xì)胞藥物終濃度分別為3 μmol/L和6 μmol/L，加藥處理不同時(shí)間（24、48以及72 h）。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置加ABCB1特異性逆轉(zhuǎn)劑（verapamil）陽(yáng)性對(duì)照組，加藥處理2 h。2 h后，向孔中加入氚標(biāo)紫杉醇，使其終濃度為10 μmol/L，繼續(xù)處理2 h，然后使用PBS清洗氚標(biāo)抗腫瘤藥物。同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化操作，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液體閃爍計(jì)數(shù)瓶中，根據(jù)液體閃爍計(jì)數(shù)儀的數(shù)值確定藥物的蓄積能力。

1.8 釩敏感的ATPase活性實(shí)驗(yàn)ATP酶檢測(cè)緩沖系統(tǒng)中分別加入經(jīng)過(guò)預(yù)制的ABCB1膜囊泡［4］（總量為10 μg），其中PC組加入0.3 mmol/L的釩酸酯，調(diào)整反應(yīng)溫度為37℃，作用時(shí)間為4 min。加入Mg-ATP（5 mmol/L）促使反應(yīng)的開(kāi)始，調(diào)整panobinostat的濃度，范圍在0~40 μmol/L。調(diào)整反應(yīng)溫度為37℃，作用時(shí)間為25 min，加入5% SDS終止反應(yīng)液使反應(yīng)停止。于酶標(biāo)儀600 nm處測(cè)量最大吸收OD值繪制相關(guān)酶活曲線，ATP酶反應(yīng)活性為游離的磷酸。

1.9 計(jì)算機(jī)輔助分子對(duì)接評(píng)價(jià)PBST與ABCB1的潛在結(jié)合位點(diǎn) 利用ChemBioDraw Ultra 14.0和AutodockTools軟件評(píng)價(jià)PBST與P-gp底物結(jié)合空腔的結(jié)合。首先導(dǎo)入PBST的分子結(jié)構(gòu)，使用Chem－Bio3D Ultra 14.0模塊轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)，使其最終為三維結(jié)構(gòu)，并利用MMFF94將力場(chǎng)優(yōu)化。P-gp的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：6ETI）從RCSB Protein Data Bank（www.rcsb.org）下載得到。P-gp和PBST均使用Autodock－Tools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。分子對(duì)接部分，采用Autodock vina 1.1.2軟件進(jìn)行。根據(jù)P-gp原配體的位置，確定P-gp活性位點(diǎn)的坐標(biāo)為：X-148.155，Y-150.903，Z-150.147。調(diào)整參數(shù)exhaustiveness的值為20。對(duì)接結(jié)束后，根據(jù)評(píng)分結(jié)果選取打分值最高的構(gòu)象，并利用Free Meastro 11.9對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用LSD-t法進(jìn)行多重比較，采用用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Panobinostat對(duì)腫瘤MDR細(xì)胞的增殖抑制活性顯著下調(diào) 本研究首先利用MTT法評(píng)價(jià)panobinostat對(duì)過(guò)表達(dá)ABCB1的腫瘤MDR細(xì)胞增殖活性的影響。如圖1A-1C所示，在過(guò)表達(dá)ABCB1的腫瘤MDR細(xì)胞KB-C2、SW620/Ad300、HEK293/ABCB1細(xì)胞中，panobinostat的IC50值 分 別 為0.604、0.293 7以 及0.280 6 μmol/L，高于其在親本細(xì)胞KB-3-1、SW620/Ad300以及HEK293/pcDNA3.1細(xì)胞中的IC50值。

圖1 Panobinostat在腫瘤MDR細(xì)胞和親本細(xì)胞中的增殖抑制活性曲線

2.2 ABCB1逆轉(zhuǎn)藥物上調(diào)panobinostat對(duì)腫瘤MDR細(xì)胞的增殖抑制活性 在MDR細(xì)胞KB-C2以及SW620/Ad300細(xì)胞中，以panobinostat聯(lián)合應(yīng)用已報(bào)道的耐藥逆轉(zhuǎn)小分子verapamil（10 μmol/L）、ibrutinib（5 μmol/L）、nilotinib（5 μmol/L）、lapatinib（5 μmol/L）以及erlotinib（5 μmol/L）后，panobinostat對(duì)KB-C2以及SW620/Ad300細(xì)胞的IC50值較對(duì)照組（DMSO組）均顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（KB-C2：n=3，F(xiàn)=148.8，P<0.05；SW620/Ad300：n=3，F(xiàn)=221.8，P<0.05）。然而，在親本細(xì)胞KB-3-1和SW620細(xì)胞中，上述耐藥逆轉(zhuǎn)小分子并不顯著影響panobinostat的IC50值（KB-3-1：n=3，F(xiàn)=1.70，P=0.209；SW620：n=3，F(xiàn)=0.949，P=0.484）（圖2A-2B）。

圖2 ABCB1逆轉(zhuǎn)劑逆轉(zhuǎn)panobinostat耐藥

2.3 Panobinostat上調(diào)ABCB1蛋白表達(dá)水平，不改變ABCB1質(zhì)膜定位 如圖3所示，在腫瘤MDR細(xì)胞KB-C2中給予低濃度panobinostat處理，ABCB1的蛋白表達(dá)水平以時(shí)間依賴性上調(diào)。但是圖4的免疫熒光結(jié)果提示，panobinostat并不顯著改變ABCB1在腫瘤MDR細(xì)胞中的質(zhì)膜定位水平。

圖3 PBST對(duì)腫瘤MDR細(xì)胞中ABCB1蛋白表達(dá)水平的影響

圖4 PBST對(duì)腫瘤MDR細(xì)胞中ABCB1質(zhì)膜定位的影響

2.4 Panobinostat上調(diào)化療藥物在腫瘤MDR細(xì)胞中的蓄積 在腫瘤MDR細(xì)胞KB-C2中，預(yù)處理2 h的panobinostat可劑量依賴性地顯著上調(diào)氚標(biāo)紫杉醇的藥物蓄積水平，并且與陽(yáng)性藥物verapamil作用效果相當(dāng)（n=3，F(xiàn)=21.51，P<0.05）；但在親本細(xì)胞KB-3-1中，圖示濃度的panobinostat并不顯著改變氚標(biāo)紫杉醇的藥物蓄積水平，且陽(yáng)性對(duì)照組verapamil也未能改變氚標(biāo)紫杉醇的蓄積水平（n=3，F(xiàn)=0.465，P=0.714）（圖5A-5B）。

圖5 PBST對(duì)腫瘤MDR和親本細(xì)胞中氚標(biāo)紫杉醇蓄積水平的影響

2.5 Panobinostat上調(diào)ABCB1的ATP酶活性，并與ABCB1底物結(jié)合口袋的氨基酸殘基發(fā)生相互作用在釩敏感的ATP酶活性實(shí)驗(yàn)中，panobinostat可顯著上調(diào)ABCB1的ATP酶活性，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性特征（圖6A-6B）；分子對(duì)接結(jié)果顯示，panobinostat與ABCB1的親和力為-9.1 kcal/mol，并且與TYR306形成一個(gè)氫鍵相互作用、與PHE982、PHE302形成Pi-Pi相互作用、與PHE335形成Pi-cation相互作用（圖7）。

圖6 PBST上調(diào)ABCB1的ATP酶活性

圖7 分子對(duì)接模擬panobinostat與ABCB1的潛在結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

腫瘤多藥耐藥是耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)多種其他未暴露的具有不同結(jié)構(gòu)和靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象。惡性腫瘤的多藥耐藥是臨床中多種抗腫瘤藥物治療失敗的的主要原因之一。已發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合盒家族的成員參與了這一過(guò)程。根據(jù)基因組序列和TMD（跨膜結(jié)構(gòu)域）結(jié)構(gòu)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族可分為七大類型，由于其可以導(dǎo)致化療藥物外排增加引起了廣泛關(guān)注。近年來(lái)，人們做出了許多努力來(lái)調(diào)節(jié)這些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，從而增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥［5-6］。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在正常組織和腫瘤細(xì)胞中都表達(dá)，其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)原發(fā)性表達(dá)導(dǎo)致原發(fā)性耐藥［7］；另外，ABC被特定結(jié)構(gòu)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)表達(dá)后可以導(dǎo)致獲得性耐藥［8］。ABCB1是第一個(gè)被鑒定的人類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，是一種負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)藥物通透性的蛋白。ABCB1蛋白的過(guò)度表達(dá)預(yù)示著對(duì)抗腫瘤藥物治療的反應(yīng)性降低，造成治療結(jié)果預(yù)期較差，甚至影響患者生存［9］。ABCB1可以外排化療藥物，如阿霉素、紫杉醇等，并降低細(xì)胞內(nèi)藥物水平，這是化療耐藥的主要原因之一［10］。隨著越來(lái)越多的癌癥治療靶點(diǎn)被研究，靶向治療在癌癥治療中廣泛興起并應(yīng)用于臨床，使患者受益。部分靶向藥物仍由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用而出現(xiàn)耐藥，最終導(dǎo)致治療失?。?1］。因此，致力于研究調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白克服腫瘤多藥耐藥，為抗癌靶向藥物的臨床藥效學(xué)評(píng)價(jià)和聯(lián)合用藥策略提供有力支撐。

Panobinostat是一種口服組蛋白去乙?；福℉DAC）泛抑制劑，并且是HDAC抑制劑中最強(qiáng)小的小分子。該藥物于2015年被FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤患者［12］。同時(shí)，panobinostat也進(jìn)入了多種血液和實(shí)體腫瘤的臨床評(píng)價(jià)，其中部分進(jìn)入了Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗(yàn)，如與西羅莫司聯(lián)合治療前列腺癌、三陰性乳腺癌、霍奇金淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征［13］。相關(guān)研究報(bào)道了panobinostat的耐藥發(fā)生的原因。研究表明，panobinostat應(yīng)用于治療急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）出現(xiàn)耐藥可能是由于HO-1的水平受低表達(dá)GFI-1基因的影響［14］。同時(shí)，CXCR-4介導(dǎo)的panobinostat的耐藥可通過(guò)mTOR抑制劑everolimus抑制P21被逆轉(zhuǎn)，間接提示mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活和CXCR4在panobinostat耐藥中的關(guān)鍵作用［15］。然而對(duì)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與panobinostat耐藥的關(guān)系，仍沒(méi)有相關(guān)的研究闡明機(jī)制。本研究針對(duì)上述科學(xué)問(wèn)題，以經(jīng)典的腫瘤多藥耐藥細(xì)胞為模型，深入探究ABCB1介導(dǎo)的panobinostat耐藥的機(jī)制。

將Panobinostat同時(shí)作用于親本細(xì)胞和過(guò)表達(dá)ABCB1的人類口腔上皮細(xì)胞癌KB-C2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，對(duì)親本細(xì)胞作用明顯強(qiáng)于過(guò)表達(dá)ABCB1的人類口腔上皮細(xì)胞癌KB-C2細(xì)胞。另外，研究panobinostat對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞SW620/Ad300耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，panobinostat抑制細(xì)胞增殖的能力被顯著削弱。因此，推斷panobinostat耐藥性的發(fā)生可能是由于ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)表達(dá)。進(jìn)一步研究panobinostat在轉(zhuǎn)染ABCB1全長(zhǎng)基因的人類胚胎腎細(xì)胞HEK293（HEK293/ABCB1）和親本細(xì)胞中的增殖抑制活性有明顯差異，發(fā)現(xiàn)panobinostat在親本細(xì)胞中抑制增殖的能力更強(qiáng)，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了筆者的假設(shè)：即panobinostat的耐藥是ABCB1的過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的。

近十年來(lái)，越來(lái)越多的小分子抑制劑被研究證明具有逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的腫瘤MDR的活性，如verapamil［16］以及部分靶向藥物，如ibrutinib、nilotinib、lapatinib和erlotinib［17-19］。在本研究中，上述小分子聯(lián)合panobinostat均可顯著增加panobinostat在腫瘤MDR細(xì)胞中的增殖抑制活性，證明ABCB1介導(dǎo)panobinostat耐藥。

盡管上述結(jié)果提示ABCB1是介導(dǎo)panobinostat耐藥的關(guān)鍵蛋白，但其導(dǎo)致耐藥的機(jī)制仍不清楚，有待于進(jìn)一步研究。因此，本研究進(jìn)一步評(píng)價(jià)panobinostat對(duì)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平的影響。Western blot結(jié)果提示，panobinostat可顯著增加KBC2細(xì)胞中ABCB1的表達(dá)水平，且這種作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。這說(shuō)明，ABCB1介導(dǎo)panobinostat的治療抵抗很大可能是通過(guò)上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平。但是，panobinostat介導(dǎo)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平的上調(diào)的具體機(jī)制是未知的，這可能涉及一些關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白的參與。研究表明，部分抗腫瘤藥物可通過(guò)激活A(yù)BCB1的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件介導(dǎo)其過(guò)度表達(dá)［20］，panobinostat是否也通過(guò)這一機(jī)制調(diào)控ABCB1的表達(dá)上調(diào)？進(jìn)一步的研究會(huì)解決這些問(wèn)題。此外，ABCB1在轉(zhuǎn)錄后通過(guò)翻譯后修飾定位于細(xì)胞膜，從而發(fā)揮其耐藥泵的作用。因此，上調(diào)ABCB1在腫瘤細(xì)胞膜的豐度是panobinostat耐藥的另一潛在因素。但是通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)，并未發(fā)現(xiàn)panobinostat可顯著改變ABCB1在腫瘤MDR細(xì)胞中的定位。

ABCB1介導(dǎo)的腫瘤MDR有多種特征，其中最顯著的特征之一是導(dǎo)致抗腫瘤藥物蓄積水平發(fā)生改變［5］。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將抗腫瘤藥物外排，導(dǎo)致其在腫瘤細(xì)胞中蓄積水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致藥物無(wú)法發(fā)揮特定的療效而導(dǎo)致化療失敗。

紫杉醇是ABCB1的作用底物，可通過(guò)ABCB1的外排作用泵出細(xì)胞。因此，本部分研究以氚標(biāo)紫杉醇為探針，探究panobinostat作用于ABCB1過(guò)表達(dá)腫瘤MDR細(xì)胞中對(duì)蓄積水平的影響，進(jìn)而間接評(píng)價(jià)ABCB1對(duì)panobinostat的蓄積水平的影響。結(jié)果顯示，不同濃度的panobinostat可顯著上調(diào)氚標(biāo)紫杉醇在腫瘤MDR細(xì)胞KB-C2中的蓄積水平，表明panobinostat可在底物結(jié)合空腔內(nèi)特異性結(jié)合ABCB1底物，導(dǎo)致紫杉醇的結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，從而增加氚標(biāo)記紫杉醇在細(xì)胞內(nèi)的積累水平。這部分結(jié)果揭示了ABCB1介導(dǎo)panobinostat耐藥的具體機(jī)制及過(guò)程。

上述結(jié)果表明，panobinostat很有可能是ABCB1的特異性底物。由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的核苷結(jié)合域具有ATP酶活性，可以通過(guò)水解ATP高能磷酸鍵獲得能量，達(dá)到轉(zhuǎn)運(yùn)底物的目的。因此筆者推測(cè)Panobinostat可能對(duì)ABCB1的ATP酶活性有一定的影響。在本文釩敏感的ATP酶活性探究中，panobinostat可顯著激活體外ABCB1的ATP酶活性，這與研究報(bào)道的大部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物的特征一致。計(jì)算機(jī)輔助分子對(duì)接結(jié)果表明，panobinostat可與ABCB1底物結(jié)合口袋的部分氨基酸殘基以共價(jià)結(jié)合方式發(fā)生相互作用。綜上，提示panobinostat是ABCB1的特異性底物。

Panobinostat作為FDA批準(zhǔn)的最強(qiáng)效HDAC抑制劑，在多發(fā)性骨髓瘤中應(yīng)用較為成熟，但臨床研究表明，其在其他腫瘤中的應(yīng)用的敏感性和有效性卻受到了限制，耐藥性是阻礙panobinostat進(jìn)一步臨床開(kāi)發(fā)的重要障礙。在本研究中，筆者首次發(fā)現(xiàn)并闡明ABCB1介導(dǎo)panobinostat在腫瘤細(xì)胞中耐藥的作用及分子機(jī)制，這將為panobinostat在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用提供有力的線索。誠(chéng)然，由于腫瘤異質(zhì)性等多方面因素的影響，造成了腫瘤耐藥發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜。ABCB1的過(guò)表達(dá)是否會(huì)影響應(yīng)用panobinostat患者的預(yù)后，亟待通過(guò)進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)panobinostat可上調(diào)ABCB1的表達(dá)水平，其潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步的分子生物學(xué)途徑探究。