基于exoRBase 數(shù)據(jù)庫胰腺癌患者血液外泌體競爭性內(nèi)源RNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建*

朱康樂，許李俊，王崇宇，王慶慶**

(1 南通大學(xué)杏林學(xué)院醫(yī)學(xué)部，南通 226007；2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院普外科)

胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差。5年的存活率通常＜5%[1]。早期發(fā)現(xiàn)和治療是患者獲得根治性治療的唯一機(jī)會(huì)。然而，由于缺乏典型臨床表現(xiàn)及特異性腫瘤標(biāo)志物，PAAD 的早期篩查十分困難，約90%的PAAD 患者確診時(shí)已處于晚期。因此，探索PAAD 診斷和治療的潛在新靶點(diǎn)具有重要意義。

外泌體是一種直徑為40～100 nm 的胞外盤狀囊泡，由多種活性細(xì)胞特異性分泌，分布在唾液、乳汁和血漿等體液中，其內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等生物活性物質(zhì)[2-3]。外泌體將生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞或激活靶細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來發(fā)揮細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵功能，具有較高的臨床治療和診斷價(jià)值[4]。近年來研究者[5]發(fā)現(xiàn)非編碼RNA 在生理功能調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假說的提出，以及對(duì)包括微小RNA(microRNA,miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在內(nèi)的多種ceRNAs在PAAD 中作用的研究，均為腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了重要線索及新的研究方向。

本研究對(duì)exoRBase 數(shù)據(jù)庫中PAAD 患者和正常對(duì)照者的血液外泌體測序數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析，發(fā)現(xiàn)mRNA、lncRNA 及環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)差異表達(dá)譜，并構(gòu)建ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，為探索PAAD診斷和治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及篩選差異表達(dá)的mRNA、lncRNA、circRNA 從exoRBase 數(shù)據(jù)庫(http://www.exorbase.org/)下載PAAD 患者和正常對(duì)照者的血液外泌體測序數(shù)據(jù)，同時(shí)下載相應(yīng)的基因注釋文件。整合出相應(yīng)基因表達(dá)譜矩陣，采用基因注釋文件對(duì)circRNA進(jìn)行注釋。分別對(duì)PAAD 患者和正常對(duì)照者外泌體中的mRNA、lncRNA 及circRNA 的表達(dá)譜進(jìn)行差異表達(dá)分析，差異表達(dá)的篩選條件為|log2FC|＞0，校正后的篩選條件為P＜0.05。

1.2 相互作用miRNA 的預(yù)測及ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建采用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)和miRanda(http://www.microrna.org/)數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測與差異表達(dá)mRNA 結(jié)合的miRNA。采用miRcode(http://www.mircode.org/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測與差異表達(dá)lncRNA 結(jié)合的miRNA，采用starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測與差異表達(dá)circRNA 結(jié)合的miRNA。最后將相關(guān)的mRNA、circRNA、lncRNA 和其相對(duì)應(yīng)的miRNA 預(yù)測數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape(版本3.8.2)軟件中對(duì)ceRNA 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.3 差異表達(dá)mRNA 的功能富集分析 使用R 語言“org.Hs.eg.db”將差異表達(dá)mRNA 由Gene Symbol轉(zhuǎn)換成entrez ID，然后使用R 語言“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”和“ggplot2”對(duì)差異表達(dá)mRNA 進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析并進(jìn)行可視化，以探索差異表達(dá)mRNA 可能起到的潛在作用或影響的潛在通路。

1.4 Hub 基因篩選 將得到的網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件，采用CytoHubba 插件計(jì)算每個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)的連接度得分，得分排名前10 個(gè)基因被確定為Hub 基因。

1.5 Hub 基因的表達(dá)和生存分析 采用表達(dá)譜交互分析數(shù)據(jù)庫GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)分析PAAD 和正常樣本的基因測序表達(dá)數(shù)據(jù)。比較PAAD 患者和正常對(duì)照者中前10 個(gè)Hub 基因表達(dá)，并繪制對(duì)應(yīng)Hub 基因的生存曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Perl(版本strawberry-perl-5.32.)編程語言整理數(shù)據(jù)，使用RStudio(版本4.1.0)進(jìn)行繪圖及數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，采用t 檢驗(yàn)或方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)下載及差異分析 從exoRBase 數(shù)據(jù)庫中分別下載正常人群(n=32)和PAAD 患者(n=14)的測序數(shù)據(jù)。整合出mRNA 表達(dá)譜、lncRNA 表達(dá)譜和circRNA 表達(dá)譜矩陣，使用R 語言分別對(duì)mRNA、lncRNA 和circRNA 進(jìn)行差異分析，篩選出差異表達(dá)mRNA(n=120)、差異表達(dá)lncRNA(n=48)、差異表達(dá)circRNA(n=23)(圖1)。

圖1 RNA 差異表達(dá)熱圖

2.2 miRNA 相關(guān)ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用TargetScan 和miRanda 數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測到與差異表達(dá)mRNA 相結(jié)合的miRNA(n=234)，采用miRcode 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到與差異表達(dá)lncRNA 相結(jié)合的miRNA(n=623)，采用starBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到與差異表達(dá)circRNA 相結(jié)合的miRNA(n=38)。Cytoscape 軟件構(gòu)建了ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，共19 個(gè)mRNA 節(jié)點(diǎn)、12 個(gè)lncRNA節(jié)點(diǎn)、3 個(gè)circRNA 節(jié)點(diǎn)、31 個(gè)miRNA 節(jié)點(diǎn)(圖1)。

2.3 GO 和KEGG 通路富集分析 GO 注釋富集分析顯示，mRNA 主要富集在富含ficolin-1 顆粒腔(ficolin-1-rich-granule)和組蛋白脫乙酰酶結(jié)合(histone deacetylase binding)；KEGG 富集分析顯示調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)的mRNA 主要富集在黏附連接通路(adherens junction pathway)、結(jié)直腸癌通路(colorectal cancer pathway)和神經(jīng)營養(yǎng)信號(hào)通路(neurotrophin signaling pathway)(圖2)。

圖2 GO 和KEGG 富集分析圖

2.4 Hub 基因篩選 Cytoscape 軟件分析共出10 個(gè)Hub 基因，2 個(gè)lncRNA：磷脂酰肌醇4-激酶α 假基因2(phosphatidylinositol 4-kinase alpha pseudogene 2,PI4KAP2)和通用轉(zhuǎn)錄因子Ⅱi 假基因1(general transcription factor Ⅱi pseudogene 1,GTF2IP1)；1 個(gè)mRNA：RAC1；6 個(gè)miRNA：hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1297、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-20b-5p 和hsa-miR-129-5p；1 個(gè)circRNA:hsa_circ_0001360(圖3)。

圖3 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中的Hub 基因

2.5 Hub 基因表達(dá)量和生存分析 采用GEPIA 進(jìn)一步分析PI4KAP2、GTF2IP1 和RAC1 基因，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照者相比，PAAD 患者表達(dá)RAC1 基因水平明顯升高，PI4KAP2、GTF2IP1 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。生存分析結(jié)果顯示：PI4KAP2 高表達(dá)組PAAD 患者的生存率明顯高于PI4KAP2 低表達(dá)組，RAC1 低表達(dá)組PAAD 患者的生存率顯著高于RAC1 高表達(dá)組(圖5)。

圖4 PAAD 患者(n=179)與正常對(duì)照者(n=171)差異表達(dá)的基因

圖5 Hub 基因PI4KAP2 和RAC1 的預(yù)后分析

3 討論

PAAD 是消化道常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)展迅速，早期發(fā)現(xiàn)率低，預(yù)后差，生存率極低[6-7]。因此，尋找PAAD 診斷與治療的新靶點(diǎn)已成為亟待解決的問題。外泌體中含有豐富的生物活性分子，包括DNA、mRNA、miRNA 和蛋白質(zhì)等，已成為近年來研究的熱點(diǎn)。外泌體通過調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)和多種信號(hào)通路，在腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮生物學(xué)作用，具有重大的研究價(jià)值[8]。研究[9-10]表明PAAD 患者和健康成年人外周血中外泌體所含miRNA 表達(dá)存在顯著差異，PAAD 患者血漿外泌體miRNA 水平的變化對(duì)早期臨床診斷具有重要意義。而近年來，ceRNA 假說成為一種解釋RNA 間相互作用的熱門機(jī)制，非編碼RNA 也成為多種疾病的研究熱點(diǎn)[11]。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一個(gè)重要因素，miRNA 的活性可通過“海綿”吸附的方式被lncRNA 調(diào)控。lncRNA 或circRNA 競爭性地與miRNA 結(jié)合，從而影響miRNA 導(dǎo)致的基因沉默，進(jìn)而調(diào)節(jié)編碼基因的蛋白質(zhì)水平，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控[12]。ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)PAAD 的發(fā)生和發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[13]。但在PAAD 患者外周血中外泌體的ceRNA 調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

本研究確定了PAAD 發(fā)生相關(guān)的外泌體RNA，篩選出差異表達(dá)的mRNA、lncRNA 和circRNA 基因，同時(shí)構(gòu)建相應(yīng)的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)。已發(fā)現(xiàn)miR-217[14]、miR-429[15]可能成為PAAD 早期診斷、預(yù)后的新型標(biāo)志物；miR-200b-3p 通過靶向下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)表達(dá)，進(jìn)而抑制PAAD 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]；miR-17-5p 表達(dá)水平可用于早期診斷消化系統(tǒng)腫瘤，并可評(píng)價(jià)患者預(yù)后[17]。ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建成功確定了PAAD 發(fā)生發(fā)展的重要Hub 基因RAC1，RAC1 是Rho 三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)酶家族的成員，具有GTP 酶活性，是多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的“分子開關(guān)”，可參與腫瘤細(xì)胞遷移、黏附、增殖及凋亡等過程[18]。RAC1 在腫瘤細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，致瘤因素通過直接或間接途徑上調(diào)RAC1 活性或表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而下調(diào)RAC1 活性或表達(dá)則可減弱腫瘤的惡性行為[19]。田銳等[20]研究揭示RAC1 通過wntβ-Catenin 信號(hào)通路促進(jìn)PAAD 細(xì)胞的增殖。李軍輝等[21]研究也發(fā)現(xiàn)RAC1 在PAAD 組織中高表達(dá)，并與腫瘤的分期明顯相關(guān)。RAC1 在PAAD 細(xì)胞株中呈現(xiàn)普遍表達(dá)，可增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。本研究采用GEPIA 分析發(fā)現(xiàn)PAAD 患者RAC1 基因表達(dá)水平明顯升高，生存分析也發(fā)現(xiàn)RAC1 低表達(dá)組PAAD 患者的生存率顯著高于高表達(dá)組。上述基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究[20-21]也驗(yàn)證了RAC1 在PAAD 組織中高表達(dá)，促進(jìn)PAAD 細(xì)胞的增殖，為后續(xù)研究PAAD 轉(zhuǎn)移和治療提供了確切的靶點(diǎn)。

但本研究存在收集的外泌體數(shù)據(jù)庫中的樣本量較少，未與GEO 和TCGA 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行聯(lián)合分析，缺乏進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究等局限性。因此，需要進(jìn)一步的大樣本臨床試驗(yàn)驗(yàn)證和基礎(chǔ)研究探索其具體作用機(jī)制。