EGFR、HER-2 在乳腺導(dǎo)管原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及與臨床病理因素間的關(guān)系*

邵偉偉，鄒琳*，柴琳琳，程曉丹，王樹人

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城第一醫(yī)院病理科，鹽城 224001)

隨著生活水平的提高、防癌意識的增強(qiáng)，近年來越來越多的乳腺癌被發(fā)現(xiàn)且發(fā)病有年輕化趨勢。盡管臨床上有多種輔助檢查手段(B 超、鉬靶、磁共振成像等)可以被用來盡早地發(fā)現(xiàn)潛在患者，但不幸的是相較于原位癌來說絕大多數(shù)被發(fā)現(xiàn)的病例依然是浸潤性癌。2019 年國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示乳腺癌已居我國女性腫瘤發(fā)病率的首位，嚴(yán)重危害女性身心健康。乳腺癌在發(fā)生、發(fā)展過程中涉及多條分子路徑，本研究通過檢測表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)蛋白及基因在乳腺癌中的表達(dá)情況，探討它們在乳腺癌發(fā)生及進(jìn)展中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年1 月—2020 年9 月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城第一醫(yī)院手術(shù)切除的乳腺癌標(biāo)本215 例，其中浸潤性導(dǎo)管癌(infiltrating ductal carcinoma,IDC)184 例，各級別導(dǎo)管原位癌(ductal carcinoma in situ,DCIS) 31 例?；颊吣挲g25～83 歲，中位年齡52 歲。全部病例術(shù)前均未行放、化療及靶向治療，取10 例癌周正常乳腺組織作為對照組，所有組織均采用中性甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色。2 位高年資醫(yī)師重新閱片以進(jìn)一步明確組織學(xué)分級及臨床分期。本實(shí)驗經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫審號[2021]-(K-001)。

1.2 方法

1.2.1 EGFR 及HER-2 免疫組化檢測 EGFR 及HER-2 兔抗人單克隆抗體及SP 試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，均為即用型。石蠟組織常規(guī)脫蠟、水化，經(jīng)組織抗原修復(fù)和10%正常血清封閉后，按說明書操作步驟進(jìn)行，顯微鏡下二氨基聯(lián)苯胺顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)代替一抗處理的切片作為陰性對照片，已知陽性片作為陽性對照片。

1.2.2 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測HER-2 基因擴(kuò)增 HER-2 探針購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，探針通過與細(xì)胞核內(nèi)的DNA 靶序列雜交，在熒光顯微鏡下觀察并分析細(xì)胞核內(nèi)雜交于DNA 靶序列的探針信號，以獲得細(xì)胞核內(nèi)染色體(或染色體片段)上基因狀態(tài)的信息，操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.2.3 結(jié)果判斷 EGFR 陽性染色定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃或棕褐色，每張切片隨機(jī)計數(shù)500 個以上腫瘤細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比?！?0%為+++，＜50%～＞25%為++，25%～＞5%為+，≤5%為-。HER-2 陽性染色定位于細(xì)胞膜上，呈棕黃色或棕褐色顆粒，根據(jù)2019 版指南[1]，判讀：無染色或≤10%的癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱著色為-，＞10%且細(xì)胞膜不完整、微弱著色為+，＞10%且細(xì)胞膜弱-中等強(qiáng)度完整著色或≤10%但強(qiáng)而完整的著色為++，≤10%且細(xì)胞膜強(qiáng)而連續(xù)完整著色為+++。HER-2 基因擴(kuò)增判斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：(1)HER-2/CEP17比值≥2.0 且平均HER-2 拷貝數(shù)/細(xì)胞≥4.0 或HER-2信號連接成簇時為HER-2 擴(kuò)增陽性。(2)HER-2/CEP17 比值≥2.0 且平均HER-2 拷貝數(shù)/細(xì)胞＜4.0：增加計數(shù)細(xì)胞，若結(jié)果維持不變，則判為HER-2 擴(kuò)增陰性。(3)HER-2/CEP17 比值＜2.0 且平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥6.0：增加計數(shù)細(xì)胞，若結(jié)果維持不變，則判為HER-2 擴(kuò)增陽性。(4)HER-2/CEP17 比值＜2.0 且平均HER-2 拷貝數(shù)/細(xì)胞≥4.0 且＜6.0，重新計數(shù)，結(jié)果不變則結(jié)合免疫組化并備注。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5 英文版統(tǒng)計分析軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。率的比較采用χ2檢驗和Fisher-exact 檢驗，采用Spearman 等級相關(guān)分析兩指標(biāo)間的關(guān)系，檢驗水準(zhǔn)均采用α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、HER-2 在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá) EGFR 陽性染色定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中，HER-2 陽性染色定位于細(xì)胞膜上(圖1，見封三)，在乳腺癌組織中兩者陽性表達(dá)率分別為22.79%、60.47%，在正常組織中兩者陽性表達(dá)率分別為10%、0，HER-2 在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.320 7,P＜0.001)，EGFR 在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.904 5,P=0.342)，見表1。

表1 EGFR、HER-2 在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)

圖1 EGFR、HER-2 在正常乳腺及乳腺癌組織中的表達(dá)(SP,100×)

2.2 DCIS 組織中EGFR、HER-2 的表達(dá)與臨床病理因素間的關(guān)系 DCIS 組31 例組織中EGFR、HER-2的表達(dá)與患者年齡及組織學(xué)分級均無關(guān)(均P＞0.05)，EGFR 的表達(dá)與腫瘤大小相關(guān)(P＜0.05)，而HER-2的表達(dá)與腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05)，EGFR 的表達(dá)與腫瘤發(fā)生部位無關(guān)(P＞0.05)，但HER-2 的表達(dá)與腫瘤發(fā)生部位相關(guān)，左側(cè)明顯高于右側(cè)(P＜0.05)，見表2。

表2 DCIS 組中EGFR、HER-2 的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

2.3 IDC 組織中EGFR、HER-2 的表達(dá)及與臨床病理因素間的關(guān)系 IDC 組184 例組織中EGFR、HER-2 的表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級、TNM 分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P＜0.05)，而與腫瘤發(fā)生部位及患者年齡無關(guān)(均P＞0.05)，見表3。

表3 IDC 組中EGFR、HER-2 的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

2.4 IDC 組EGFR、HER-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性 184例IDC 組織中EGFR、HER-2 蛋白共陰性表達(dá)60例，共強(qiáng)陽性表達(dá)3 例，兩者的表達(dá)無相關(guān)性(r=0.013,P=0.858)，見表4。

表4 IDC 組EGFR、HER-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.5 IDC 組EGFR 蛋白表達(dá)與HER-2 基因擴(kuò)增的關(guān)系 EGFR 蛋白陰性表達(dá)142 例中HER-2 基因擴(kuò)增陽性26 例(圖2)，EGFR 蛋白陽性表達(dá)42 例中HER-2 基因擴(kuò)增陽性15 例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.670,P=0.017)，進(jìn)一步做Spearman 等級相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)(r=0.176,P=0.017)，見表5。

圖2 FISH 檢測HER-2 基因呈簇狀擴(kuò)增(SP,1 000×)

表5 IDC 組中EGFR 蛋白表達(dá)與HER-2 基因擴(kuò)增的關(guān)系

3 討論

酪氨酸蛋白激酶受體在細(xì)胞的生長及分化中起重要作用，其家族有50 多種成員[2]，其中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族，亦稱erbB 家族，由4 個成員組成，它們具有相似的結(jié)構(gòu)和序列，包含一個胞外配體結(jié)構(gòu)域，一個跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，除erbB2(HER-2)之外，erbB 的激活首先需與細(xì)胞外配體結(jié)合，然后與相鄰的受體酪氨酸蛋白激酶交聯(lián)和反式自磷酸化，隨后通過復(fù)雜底物蛋白磷酸化啟動下游信號通路，這些信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、凋亡、增殖、分化、運(yùn)動和血管生成，還上調(diào)、激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(癌細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵過程)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的發(fā)生[2-3]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)erbB 家族參與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展，尤其是在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌中[4-6]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR 在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)陽性率分別為22.79%、10.00%，與文獻(xiàn)[7]的報道不一致，究其原因：(1)本研究納入正常乳腺組織樣本量較少；(2)乳腺癌組為Ⅰ～Ⅲ期病例，未納入Ⅳ期病例；(3)采用免疫組化方法檢測EGFR 的敏感性及特異性較差，存在假陰性可能。HER-2 蛋白在乳腺癌組及正常乳腺組織組中的陽性表達(dá)率分別為60.47%、0，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。IDC 組中隨腫瘤的進(jìn)展(體積的增大、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高TNM 分期及高組織學(xué)分級)，EGFR、HER-2 的陽性表達(dá)率呈上升趨勢，與文獻(xiàn)[8-10]的報道一致。原因：(1)EGFR 位于細(xì)胞膜表面，與配體如轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子結(jié)合后由單體轉(zhuǎn)化為二聚體，激活其位于細(xì)胞內(nèi)的激活位點(diǎn)以完成自磷酸化，接著誘導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)通路(如PI3K/AKT、Ras/MEK/ERK 等)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移[2]；(2)現(xiàn)已在多種實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)突變型EGFR的存在[11-12]，當(dāng)EGFR 基因出現(xiàn)缺失、突變和重排或因結(jié)構(gòu)域缺失而導(dǎo)致受體下調(diào)機(jī)制破壞時會導(dǎo)致EGFR 出現(xiàn)持續(xù)活化，進(jìn)一步加速腫瘤細(xì)胞的生長，導(dǎo)致患者出現(xiàn)高TNM 分期和高組織學(xué)分級。在DCIS 組中除了發(fā)現(xiàn)HER-2 的表達(dá)與腫瘤發(fā)生部位相關(guān)外，未發(fā)現(xiàn)兩者與其他臨床病理因素間存在關(guān)系。由于DCIS 在臨床TNM 分期中屬于Tis，患者預(yù)后較好。

在IDC 組中，EGFR 蛋白與HER-2 蛋白的表達(dá)沒有相關(guān)性，可能是由于EGFR 的活化需與配體結(jié)合，但HER-2 可不直接與任何已知的配體結(jié)合，其介導(dǎo)的信號通路的激活是通過配體激活的EGFR 或ERBB3 異源二聚作用發(fā)生，或當(dāng)其高濃度存在時，通過均質(zhì)二聚作用發(fā)生，從而啟動類似于EGFR 的下游信號級聯(lián)。因此乳腺癌進(jìn)展過程中HER-2 蛋白的過表達(dá)可獨(dú)立于EGFR 發(fā)生，兩者可無相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)EGFR 蛋白與HER-2 基因擴(kuò)增呈正相關(guān)，提示HER-2 基因擴(kuò)增的過程中，活化的EGFR可能發(fā)揮了協(xié)同作用。

目前針對乳腺癌是采取手術(shù)、內(nèi)分泌、化療及靶向治療的綜合治療方案，根據(jù)不同的分子分型結(jié)果采用精準(zhǔn)治療。其中應(yīng)用最為廣泛的靶向藥物(赫賽汀)是針對HER-2 基因擴(kuò)增為陽性或免疫組化為強(qiáng)陽性表達(dá)的病例，取得了較好的臨床治療效果。其作用機(jī)制：(1)赫賽汀競爭性地與HER-2 受體結(jié)合，抑制細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞，降低細(xì)胞增殖、遷移能力；(2)可加速HER-2 受體降解，使HER-2 受體表達(dá)下調(diào)，抑制癌細(xì)胞的生長；(3)抑制血管內(nèi)皮生長因子的生成，阻斷腫瘤內(nèi)的新生血管。EGFR 的靶向治療目前主要是應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌中，其作用機(jī)制[13]為：(1)封閉配體分子如ABX-EGF 對EGFR 的激活；(2)通過競爭性結(jié)合EGFR 的TK 區(qū)從而抑制EGFR 激酶活性；(3)利用RNAi 作用機(jī)制對EGFR 進(jìn)行降解；(4)對富含EGFR 腫瘤細(xì)胞選擇性殺死；(5)通過阻礙EGFR的二聚化/寡聚化從而抑制EGFR 的激活。雖然目前抗EGFR 在乳腺癌的靶向治療中意義不明確，但是EGFR 與HER-2 有50%的同源性，且其在非小細(xì)胞肺癌的治療中已被證實(shí)可顯著改善患者預(yù)后，因此研究其在乳腺癌中的表達(dá)是有必要的。

本研究結(jié)果表明，EGFR、HER-2 在乳腺癌中存在復(fù)雜而密切的關(guān)聯(lián)，探討其關(guān)系有助于進(jìn)一步了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子事件，為指導(dǎo)治療和評估預(yù)后提供幫助。